Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza interakcji białek RNA z ekstraktów komórkowych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw ekstraktu białkowego z komórek lub tkanek w oddzielnym etapie, syntetyzowana i oczyszczana jest specyficzna dla genu sonda RNA znakowana radiowo. Ekstrakt białkowy jest następnie mieszany ze znakowaną sondą RNA, aby umożliwić tworzenie specyficznych kompleksów białkowych RNA.

Na koniec produkt reakcji jest ładowany do niedenaturującego żelu poliakrylamidowego i analizowany za pomocą sondy RNA wolnej od elektroforezy jest oddzielany od kompleksów białkowych RNA ze względu na jego szybszą ruchliwość. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej jest szeroko stosowany do analizy interakcji białek RNA. Mogliśmy przeanalizować wiązanie białek regulatorowych żelaza, IRP jeden i IRP 2 z ich docelowym elementem RNA.

Ale metoda ta może być również zastosowana do badania innych białek wiążących RNA, wykazując, że ta procedura zostanie wykonana przez dr Kaina z Filipin w moim laboratorium oraz przez dr Nicole Wilkinson, doktora habilitowanego ds. komórek przylegających do naczyń. Umyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS, a następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS i zbierz komórki za pomocą plastikowego skrobaka do komórek. Przenieś luźną zawiesinę komórkową do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Umieść probówkę we wstępnie schłodzonej mikrowirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wiruj z małą prędkością przez pięć minut i zasysaj sup natant. Komórki pojawią się jako biała granulka na dnie probówki.

Na każde 10 milionów zebranych komórek dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy cytoplazmatycznej. Poluzować osad komórkowy, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie inkubować zawiesinę na lodzie przez 20 minut. Spowoduje to rozpuszczenie błony komórkowej i uwolnienie całej zawartości cytozolowej do buforu.

Aby wyizolować rozpuszczoną frakcję cytozolową, należy obracać probówkę z pełną prędkością przez 10 minut w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść oczyszczony snat do nowej 1,5 mililitrowej probówki na lodzie i wyrzucić osad. Następnie określ całkowite stężenie białka w powstałym ekstrakcie cytoplazmatycznym za pomocą testu Bradforda. Otrzymany ekstrakt cytoplazmatyczny podzielić podzielić na mniejsze probówki i przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do momentu użycia do produkcji ekstraktów cytoplazmatycznych ze świeżych tkanek.

Rozpocznij proces zbioru, kładąc uśpione zwierzę na czystej podkładce nad deską sekcyjną. Otwórz brzuch nożyczkami. Usuń wątrobę i śledzionę za pomocą nożyczek i kleszczy.

Opłucz każdą tkankę w około 50 mililitrach lodowatego PBS, aby zapobiec degradacji tkanek. Natychmiast pokrój tkanki na małe kawałki około jednego do dwóch milimetrów sześciennych za pomocą skalpela. Umieść chusteczki w świeżej probówce kriogenicznej i zatrzaśnij.

Zamrażać próbkę w ciekłym azocie. Zamrożone chusteczki przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Rozpocznij wytwarzanie ekstraktu cytoplazmatycznego od przeniesienia wcześniej zamrożonej próbki tkanki do dwumililitrowej probówki z płaskim dnem zawierającej od 250 do 500 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy

Umieść końcówkę homogenizatora tkankowego w probówce i włącz aparat ze średnią mocą. Po 10 sekundach homogenizacji natychmiast umieść probówkę na lodzie na 20 minut, aby zapobiec denaturacji białek. Aby wyizolować frakcję cytozolową, należy obracać probówkę z pełną prędkością przez 10 minut w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść sklarowany supernatant do nowej 1,5 mililitrowej probówki na lodzie i wyrzucić osad.

Określić całkowite stężenie białka w otrzymanym ekstrakcie cytoplazmatycznym za pomocą testu Bradforda. Powstały ekstrakt cytoplazmatyczny należy przelać do mniejszych probówek i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Zanim przejdziesz do protokołu, skonfiguruj stół warsztatowy bezpieczny przed promieniowaniem wraz z licznikiem Geigera z osłoną z pleksiglasu.

Wykonaj cytometryczne znaczniki monitora na fartuchach laboratoryjnych i odpowiednich pojemnikach na ostre narzędzia i odpady bez ostrej promieniowania. Zaczynając od de linearyzowanego plazmidu DNA zawierającego sklonowany element odpowiedzi żelaza. Jako matrycę należy ustawić 20-mikrolitrową reakcję transkrypcji RNA in vitro, mieszając bufor reakcyjny matrycy, częściowo radioaktywne nukleotydy i polimerazę RNA za pomocą pipety w temperaturze pokojowej.

Aby rozpocząć syntezę RNA, należy inkubować próbkę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez godzinę. Zakończ reakcję transkrypcji in vitro, dodając jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA pH 8,0. Wymieszać EDTA, pipetując w górę i w dół.

Teraz użyj standardowego protokołu wytrącania alkoholu, aby oczyścić produkt RNA. Na początek dodaj 10 mikrolitrów TRNA i 82,5 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 do mieszaniny po syntezie i wiruj. Mieszanie TRNA będzie działać jako nośnik wytrącający i zwiększy ostateczną wydajność RNA w celu wytrącenia RNA.

Dodaj 273 mikrolitry 95 do 100% etanolu i wymieszaj przez wirowanie. Pozwól, aby reakcja wytrącania postępowała, pozostawiając probówkę na stole na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wyizolowania RNA, odwiruj probówkę w wirówce o temperaturze pokojowej z pełną prędkością przez 10 minut. Za pomocą pipety ostrożnie wyrzucić supernatant i nie naruszać osadu.

Wytrącone RNA może występować w postaci małego białego osadu w pobliżu dna probówki lub może być niewidoczne gołym okiem. Umyj granulkę, dodając od 100 do 500 mikrolitrów 70% etanolu. Wirować próbkę z pełną prędkością przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zdekantować naciat pokrywką.

Otwórz osad RNA, pozostawiając otwartą probówkę na stole na 10 do 15 minut. Rozpuść stały RNA znakowany radiowo, dodając 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Określ ilościowo zakres włączenia radioaktywnych nukleotydów, umieszczając roztwór RNA w płynnym roztworze Counter Eloqua.

Znakowaną radiowo sondę RNA umieścić w mniejszych probówkach i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. Zamrożone podwielokrotności można stosować do trzech tygodni przed rozpoczęciem testu przesunięcia elektroforetycznego, należy przygotować standardowy 6% niedenaturujący żel akrylowy o wielkości co najmniej 16 na 16 centymetrów, aby ułatwić większe objętości próbek na pas. I aby zwiększyć stabilność mechaniczną żelu tej wielkości.

Używaj szklanych przekładek i grzebieni o grubości co najmniej jednego milimetra. Aby rozpocząć test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, należy rozmrozić wcześniej zamrożony lizat cytoplazmatyczny i znakowane radiowo sondy RNA na oczach w poszukiwaniu składnika białkowego eksperymentu. Rozcieńczyć 25 mikrogramów ekstraktu cytoplazmatycznego buforem do lizy cytoplazmatycznej do uzyskania końcowej całkowitej objętości 10 mikrolitrów.

W razie potrzeby dodaj jeden mikrolitr dwóch roztworów podstawowych do mieszaniny i trzymaj próbkę białka na lodzie. W przypadku składnika RNA rozcieńczyć znakowaną radiowo sondę RNA w wodzie wolnej od nukleaz do 200 000 zliczeń na minutę na mikrolitr, aby narodzić RNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez jedną minutę i schłodzić roztwór w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Aby zainicjować reakcję wiązania białka RNA, dodaj jeden mikrolitr znakowanej radiowo sondy RNA do ekstraktu białkowego, aby umożliwić wiązanie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Aby zwiększyć swoistość testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, dodaj do reakcji jeden mikrolitr bulionu heparyny. Jeśli znakowane radioaktywnie sondy RNA są dłuższe niż 60 nukleotydów, dodaj dodatkowy jeden mikrolitr RNA T. Pozwól, aby reakcja wiązania trwała przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej, aby jeszcze bardziej zwiększyć specyficzność i umożliwić lepszą separację kompleksu białkowego RNA.

Dodaj trzy mikrolitry bufora ładującego i pipety w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie załaduj całą reakcję na 6% żel akrylowy i uruchom żel pod napięciem pięciu woltów na centymetr przez 60 minut. Upewnij się, że urządzenie jest pokryte odpowiednią osłoną przed promieniowaniem.

Zdemontuj aparat żelowy i przenieś żel na dużą bibułę filtracyjną. Wysuszyć żel za pomocą próżniowego urządzenia do suszenia żelu w ciemnym pomieszczeniu. Umieść kombinację żelu i bibuły filtracyjnej na wierzchu kawałka.

Film po naświetleniu wywołaj i wysusz film. Optymalny czas ekspozycji może wahać się od jednej godziny do nocy. Można ocenić zależną od żelaza zdolność wiązania I RRP 1 i I RRP 2 z radioaktywnymi sondami IRE w komórkach hodowli tkankowej o zmiennej zawartości żelaza.

W ten sposób aktywność wiązania IRE jest indukowana w komórkach zubożonych w żelazo, wcześniej traktowanych K, a następnie deferoksaminą. I odwrotnie, aktywność wiązania IRE jest tłumiona w komórkach obciążonych żelazem, które wcześniej były traktowane hemanem w komórkach obciążonych żelazem. Aktywność wiązania IRE I RRP jeden jest tracona po złożeniu klastra siarki żelaza, podczas gdy I RRP dwa ulega degradacji zależnej od żelaza.

Klaster komórek żelaza IRP one może zostać zniszczony przez traktowanie ekstraktów komórkowych 2%two me, co pozwala monitorować jego uśpioną aktywność wiązania IRE. Aktywność I RRP dwa nie jest odzyskiwana przez dwa ja. W tym następnym eksperymencie aktywność wiązania IRE I RRP jeden i IRP 2 w funkcji stężenia żelaza w komórkach ocenia się w kontekście świeżych tkanek wątroby dzikich myszy z nokautem RRP typu I i dwóch RRP z nokautem.

Tutaj dane pokazują, że karmienie myszy dietą o wysokiej zawartości żelaza, o której wiadomo, że zwiększa obciążenie żelaza w wątrobie, sprzyja zmniejszeniu aktywności wiązania IRE I RRP jeden i IRP 2 w ekstraktach wątrobowych myszy typu dzikiego. I rrp dwa kompleksy IRE są zniekształcone przez obecność I RRP jeden. Są one łatwo wizualizowane w ekstraktach wątrobowych myszy z nokautem I RRP one.

W tym przypadku dieta bogata w żelazo prowadzi do całkowitej dezaktywacji IRP dwa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować interakcje białek RNA za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Pamiętaj, że jakość sondy RNA ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.