Name: Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Poznaj metodę EMSA do analizy interakcji RNA-białko z wykorzystaniem radiolabelowanego sondy RNA i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Technika ta pozwala wizualizować kompleksy RNA-białko i badać dynamikę wiązania białek regulacyjnych żelaza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Procedury eksperymentalne na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill (protokół 4966).
1. Przygotowanie ekstraktów białkowych z hodowanych komórek
<ol>
	<li>Przemyć wyhodowane komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Zeskrobać przylegające komórki za pomocą gumowego policjanta lub plastikowego skrobaka do komórek w 1 ml lodowatego PBS, przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 700 x g, w temperaturze 4 °C. Odsysać PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl lodowatego buforu do lizy cytoplazmatycznej (Tabela 1) na 107 komórek i pipetować w górę iw dół.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut z pełną prędkością w mikrowirówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzuć granulkę. Przenieść szwadron do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Określić stężenie białka (zwykle 1 - 10 μg/μl) za pomocą testu Bradforda23.</li>
	<li>Porcję i przechowywać ekstrakty komórkowe w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów białkowych z wątroby i śledziony myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą wdychania CO2 .</li>
	<li>Połóż uśpione zwierzę na czystej podkładce nad deską sekcyjną. Otwórz brzuch nożyczkami.</li>
	<li>Wypreparuj wątrobę i śledzionę za pomocą nożyczek i kleszczy, a następnie opłucz każdą tkankę w około 50 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Natychmiast pokrój tkanki na małe kawałki skalpelem (na przykład: około 1 - 2 mm3).</li>
	<li>Nie zwlekająco włóż kawałków tkanek do świeżej krioprobówki, a następnie zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać zamrożone podwielokrotności tkanek w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Homogenizować jeden kawałek zamrożonej tkanki (około 1 - 2 mm3) w 0,25 - 0,5 ml lodowatego buforu do lizy cytoplazmatycznej (Tabela 1) z homogenizatorem tkankowym przez 10 sekund.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i schłodzić na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut z pełną prędkością w mikrowirówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Określić stężenie białka (zwykle 1 - 10 μg/μl) za pomocą testu Bradforda23.</li>
	<li>Porcję i przechowywać ekstrakty komórkowe w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sondy IRE znakowanej radioaktywnie
<ol>
	<li>Linearyzować plazmid zawierający IRE I-12.CAT22 przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z endonukleazą restrykcyjną XbaI (1 U na μg plazmidu), która rozszczepia się poniżej sekwencji IRE. Zlinearyzowany plazmid zostanie wykorzystany jako matryca do transkrypcji in vitro.</li>
	<li>Przygotować reakcję transkrypcji in vitro o całkowitej objętości 20 μl. Użyć roztworów podstawowych przedstawionych w tabeli 2 i dodać: 1 μl zlinearyzowanej matrycy plazmidowej, 4 μl buforu transkrypcyjnego; 1 μl mieszaniny mieszaniny ATP/CTP/GTP, 10 μl [α-32 P]-UTP, 2 μl ditiotreitolu, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl polimerazy RNA T7. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę24.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie sondy IRE znakowanej radioaktywnie
<ol>
	<li>Zakończyć reakcję transkrypcji in vitro, dodając 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10 mg/ml tRNA jako nośnik dla lepszego wytrącenia. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Dodać 82,5 μl 3 M octanu amonu. Wymieszaj przez wirowanie.</li>
	<li>Dodać 273 μl etanolu. Wymieszaj przez wirowanie.</li>
	<li>Odstawić na RT na 5 minut.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut z pełną prędkością w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj granulat 100 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut z pełną prędkością w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Suszenie na powietrzu przez 10 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl podwójnie destylowanego, uprzednio autoklawizowanegoH2O.</li>
	<li>Określić ilościowo radioaktywność w płynnym liczniku scyntylacyjnym, podwielokrotnej sondzie IRE znakowanej radioaktywnie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Zamrożone porcje można stosować do 3 tygodni.</li>
</ol>
5. Przygotowanie natywnego żelu poliakrylamidowego dla EMSA
<ol>
	<li>Złóż żel (16 x 16 cm) za pomocą przekładek 1,5 mm i grzebienia.</li>
	<li>Aby przygotować 6% natywny żel poliakrylamidowy, należy użyć roztworów podstawowych przedstawionych w Tabeli 3. Wymieszać 7,5 ml 40% akrylamidu: bisakrylamid, 5 ml 5x TBE i 37,5 ml podwójnie destylowanegoH2O.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 10% świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu (APS) i 25 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).</li>
	<li>Natychmiast wlej roztwór akrylamidu do żelu i pozwól mu spolimeryzować. Odczekaj około 30 minut.</li>
	<li>Zmontuj aparat do elektroforezy z żelem, napełnij zbiorniki 0,5x TBE i podłącz do zasilania.</li>
</ol>
6. Test przesunięcia mobilności elektroforetycznej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 25 μg ekstraktu białkowego z komórek lub tkanek buforem do lizy cytoplazmatycznej (Tabela 1) w całkowitej objętości 10 μl (można również stosować niższe stężenia białka). Trzymaj na lodzie. W razie potrzeby dodać 1 μl rozcieńczonego w stosunku 1:4 2-merkaptoetanolu (2-ME) w celu aktywacji uśpionego IRP1 (stężenie końcowe: 2%)25.</li>
	<li>Rozcieńczyć znakowaną radioaktywnie sondę IRE w podwójnie destylowanymH2Odo 200 000 cpm/μl, podgrzać denaturację w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i schłodzić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Rozpocznij reakcję EMSA, dodając 1 μl znakowanej radioaktywnie sondy IRE do ekstraktu białkowego.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 1 μl 50 mg/ml heparyny do reakcji (w celu zahamowania niespecyficznych oddziaływań białkowych z sondą9) i kontynuować inkubację przez kolejne 10 minut. Podwielokrotnić roztwór podstawowy heparyny (50 mg/ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W przypadku stosowania długich sond znakowanych radioaktywnie (>60 nukleotydów) dodać 1 μl RNazy T1 (1 U/μl) i inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białka z sondą i umożliwić lepsze oddzielenie kompleksu RNA/białko podczas elektroforezy.</li>
	<li>Dodać 3 μl buforu ładującego (80% glicerolu + błękit bromofenolowy), wymieszać i obciążyć 6% niedenaturującym żelem poliakrylamidowym.</li>
	<li>Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 130 V (5 V/cm).</li>
	<li>Przenieś żel na dużą bibułę filtracyjną i wysusz.</li>
	<li>Wystaw się na film i rozwiń autoradiografię. Czas ekspozycji może wynosić od 1 godziny (lub mniej) do O/N.</li>
</ol>

<ol><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30(2013).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22Filter-binding+assay+for+analysis+of+RNA-protein+interactions%22">Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions</a>. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-mediated+degradation+of+IRP2%3A+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li>
<li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li>
<li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+iron+regulatory+protein-1+%28IRP1%29+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li>
<li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li>
<li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li>
<li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-responsive+elements%3A+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li>
<li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li>
<li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li>
<li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1%2C+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li>
<li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li>
<li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li>
<li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulation+and+the+cell+cycle%3A+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3%27-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li>
<li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li>
<li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein%2C+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein%28s%29+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li>
<li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li>
<li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li>
<li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li>
<li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload%3A+from+pathophysiology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li>
<li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+%28IRP%29-1+and+-2+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li>
<li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-%2F-+mice%3A+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530(2014).</li>
<li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym artykule opisujemy protokół, który został opracowany w celu zbadania aktywności IRP1 i IRP2 wiążących IRE, i przedstawiamy reprezentatywne dane. Dzięki zastosowaniu różnych sond, protokół ten można również dostosować do badania innych białek wiążących RNA. Krytycznym krokiem jest rozmiar sondy. Stosowanie długich sond, co jest powszechne, gdy dokładne miejsce wiązania jest nieznane, może skutkować powstawaniem kompleksów RNA/białko, które nie migrują inaczej niż wolny RNA. W takim przypadku zaleca się usunię...

EMSA została pierwotnie opracowana do badania związku białek wiążących DNA z docelowymi sekwencjami DNA1,2. Zasada jest podobna w przypadku interakcji RNA/białko3, na których skupia się ten artykuł. Krótko mówiąc, RNA jest naładowany ujemnie i będzie migrować w kierunku anody podczas elektroforezy bez denaturacji w żelach poliakrylamidowych (lub agarozowych). Migracja w obrębie żelu zależy od wielkości RNA, która jest proporcjonalna do jego ładunku. Specyficzne wiązanie białka z RNA zmienia jego ruchliwość, a kompleks migruje wolniej w porównaniu z wolnym RNA. Wynika to głównie ze wzrostu masy cząsteczkowej, ale także ze zmian w ładunku i ewentualnie konformacji. Wykorzystanie znakowanego RNA jako sondy umożliwia łatwe monitorowanie "opóźnienia żelu" lub "przesunięcia pasma". Użycie 32sond RNA znakowanych P jest bardzo powszechne i zapewnia wysoką czułość. Migracja kompleksów RNA/białko i wolnego RNA jest wykrywana za pomocą autoradiografii. Wadami są krótki okres półtrwania wynoszący 32P (14,29 dni), stopniowe pogarszanie się jakości sondy z powodu radiolizy, wymóg licencji radioaktywnej i infrastruktury do pracy radioaktywnej oraz potencjalne obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. W związku z tym opracowano alternatywne, nieizotopowe metody znakowania sondy RNA, na przykład za pomocą fluoroforów lub biotyny, które umożliwiają detekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lub chemiluminescencyjnego4,5. Ograniczeniami tych metod są wyższe koszty i często zmniejszona czułość w porównaniu z znakowaniem izotopowym oraz możliwość zakłócania interakcji RNA/białko przez znaczniki nieizotopowe. Niedenaturujące żele poliakrylamidowe nadają się do większości zastosowań EMSA i są powszechnie stosowane. Czasami żele agarozowe mogą stanowić alternatywę dla analizy dużych kompleksów.
Główną zaletą EMSA jest to, że łączy w sobie prostotę, czułość i solidność4. Test można wykonać w ciągu kilku godzin i nie wymaga zaawansowanego oprzyrządowania. Oddziaływania RNA/białko mogą być wykrywane przez EMSA w stężeniach tak niskich, jak 0,1 nM lub mniej, i w szerokim zakresie warunków wiązania (pH 4,0 - 9,5, stężenie soli jednowartościowej 1 - 300 mM i temperatura 0 - 60 °C).
Tworzenie kompleksu RNA/białko można również badać za pomocą testu wiązania filtra. Jest to prosta, szybka i niedroga procedura polegająca na zatrzymaniu kompleksów RNA/białko w filtrze nitrocelulozowym, podczas gdy wolna sonda RNA przechodzi przez6. W porównaniu z EMSA jest ona ograniczona w przypadkach, gdy sonda RNA zawiera wiele miejsc wiązania lub surowy ekstrakt zawiera więcej niż jedno białko wiążące RNA, które wiąże się z sondą w tym samym miejscu. Podczas gdy wiele interakcji RNA/białko uniknie wykrycia przez test wiązania filtra, można je łatwo zwizualizować za pomocą EMSA. W niektórych przypadkach wizualizacja jest możliwa nawet wtedy, gdy dwa kompleksy RNA/białko współmigrują (na przykład ludzkie kompleksy IRP1/IRE i IRP2/IRE), dodając przeciwciało przeciwko jednemu z białek wiążących RNA do reakcji EMSA, powodując dalsze opóźnienie żelu ("supershift")7.
EMSA jest szeroko stosowana do badania IRP1 i IRP2, które są potranskrypcyjnymi regulatorami metabolizmu żelaza8-10. Działają poprzez wiązanie się z IRE, filogenetycznie zachowanymi strukturami spinki do włosów w UTR kilku mRNA11. IRE zostały po raz pierwszy odkryte w mRNA kodujących ferrytynę12 i receptor transferyny 1 (TfR1)13, białka odpowiednio magazynujące i wychwytywane żelazo. Później IRE znaleziono w swoistej dla erytroidu syntazie aminolewulinianu (ALAS2)14, tojadazie mitochondrialnej15, ferroportynie16, transporterze metali dwuwartościowych 1 (DMT1)17, czynniku indukowanym hipoksją 2α (HIF2α)18 i innych mRNA19-21. Prototypowe mRNA H- i L-ferrytyny zawierają jeden IRE w swoim 5' UTR, podczas gdy mRNA TfR1 zawiera wiele IRE w swoim 3' UTR. Interakcje IRE/IRP specyficznie hamują translację mRNA ferrytyny poprzez steryczne blokowanie jej asocjacji podjednostki rybosomalnej 43S; ponadto stabilizują mRNA TfR1 przed rozszczepieniem endonukleolitycznym . IRP1 i IRP2 mają duże podobieństwo sekwencji i wykazują wysoką aktywność wiązania IRE w komórkach pozbawionych żelaza. W komórkach bogatych w żelazo IRP1 gromadzi klaster szebanowy Fe-S, który przekształca go w tojadę cytozolową kosztem jego aktywności wiążącej IRE, podczas gdy IRP2 ulega degradacji proteasomalnej. Tak więc oddziaływania IRE/IRP zależą od stanu żelaza w komórkach, ale są również regulowane przez inne sygnały, takie jakH2O2, tlenek azotu (NO) lub niedotlenienie. W tym miejscu opisujemy protokół oceny aktywności wiązania IRE z surowych ekstraktów komórkowych i tkankowych przez EMSA. Użyliśmy sondy IRE H-ferrytyny znakowanej 32P, która została wygenerowana przez transkrypcję in vitro z plazmidowej matrycy DNA (I-12.CAT), w której sekwencja IRE została pierwotnie wprowadzona w orientacji zmysłowej poniżej miejsca polimerazy T7 RNA poprzez klonowanie wyżarzonych syntetycznych oligonukleotydów 22.

<table><tbody><tr><td>leupeptyna</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Test białka BioRad</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Thermoscientific</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alfa-32P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td>NEG507H</tr><tr><td>Ciecz scyntylacyjna</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>heparyna</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ruptor</td><td>tkankowy Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>Grzebienie 20-dołkowe</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td> Przekładki <td>1,5 mm o grubości 1,5</td></tr><tr><td>mm</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (emsa) do badania interakcji rna-białko: przykład ire/irp

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Interakcje RNA/białko są kluczowe dla potranskrypcyjnych szlaków regulacyjnych. Do najlepiej scharakteryzowanych cytozolowych białek wiążących RNA należą białka regulatorowe żelaza, IRP1 i IRP2. Wiążą się z pierwiastkami reagującymi na żelazo (IRE) w regionach nieulegających translacji (UTR) kilku docelowych mRNA, kontrolując w ten sposób translację lub stabilność mRNA. Interakcje IRE/IRP były szeroko badane przez EMSA. W tym miejscu opisujemy protokół EMSA do analizy aktywności wiążącej IRE IRP1 i IRP2, który można uogólnić w celu oceny aktywności również innych białek wiążących RNA. Surowy lizat białkowy zawierający białko wiążące RNA lub oczyszczony preparat tego białka inkubuje się z nadmiarem32 sondy RNA znakowanej P, co pozwala na tworzenie kompleksu. Heparyna jest dodawana w celu wykluczenia niespecyficznego wiązania białka z sondą. Następnie mieszanina jest analizowana za pomocą elektroforezy niedenaturującej na żelu poliakrylamidowym. Wolna sonda migruje szybko, podczas gdy kompleks RNA/białko wykazuje opóźnioną ruchliwość; W związku z tym procedura jest również nazywana testem "opóźnienia żelu" lub "przesunięcia pasmowego". Po zakończeniu elektroforezy żel jest suszony, a kompleksy RNA/białko oraz wolna sonda są wykrywane za pomocą autoradiografii. Ogólnym celem protokołu jest wykrycie i ilościowe określenie IRE/IRP i innych interakcji RNA/białko. Co więcej, EMSA może być również wykorzystywana do określania swoistości, powinowactwa wiązania i stechiometrii badanej interakcji RNA/białko.

Przygotowano radioznakowaną sondę IRE, zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4 protokołu. Sekwencja sondy wynosiła 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'; pogrubione nukleotydy reprezentują nieparowany resztę C oraz pętlę, które są kluczowymi cechami IRE. Aktywność właściwa sondy wynosiła 4,5 x 109 cpm/μg RNA.
Aby ocenić wpływ zaburzeń poziomu żelaza na aktywność wiązania IRE, makrofagi mysie RAW264.7 pozostawiono bez obróbk...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza interakcji białek RNA z ekstraktów komórkowych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw ekstraktu białkowego z komórek lub tkanek w oddzielnym etapie, syntetyzowana i oczyszczana jest specyficzna dla genu sonda RNA znakowana radiowo. Ekstrakt białkowy jest następnie mieszany ze znakowaną sondą RNA, aby umożliwić tworzenie specyficznych kompleksów białkowych RNA.Na koniec produkt reakcji jest ładowany do niedenaturującego żelu poliakrylamidowego i analizowany za pomocą sondy RNA wolnej od elektroforezy jest oddzielany od kompleksów białkowych RNA ze względu na jego szybszą ruchliwość. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej jest szeroko stosowany do analizy interakcji białek RNA. Mogliśmy przeanalizować wiązanie białek regulatorowych żelaza, IRP jeden i IRP 2 z ich docelowym elementem RNA.Ale metoda ta może być również zastosowana do badania innych białek wiążących RNA, wykazując, że ta procedura zostanie wykonana przez dr Kaina z Filipin w moim laboratorium oraz przez dr Nicole Wilkinson, doktora habilitowanego ds. komórek przylegających do naczyń. Umyj kom

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa-for-study-rna-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem do analizy interakcji RNA-białko. Tradycyjnie w większości eksperymentów używano żeli pionowych. Jednak żele poziome mają kilka zalet, takich jak możliwość monitorowania kompleksów podczas elektroforezy. Udostępniamy szczegółowy protokół generowania i stosowania poziomej natywnej elektroforezy żelowej.

Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Poznaj metodę EMSA do analizy interakcji RNA-białko z wykorzystaniem radiolabelowanego sondy RNA i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Technika ta pozwala wizualizować kompleksy RNA-białko i badać dynamikę wiązania białek regulacyjnych żelaza.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Przeglądaj więcej filmów