Name: Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę obrazowania 3D neuronów zakażonych Toxoplasma gondii u myszy. Protokół umożliwia wizualizację przestrzennych relacji między pasożytem a komórkami nerwowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy całemu laboratorium Koshy za pomocne dyskusje. Dziękujemy Patty Jansma i Wydziałowi Neurologii Uniwersytetu Arizony za porady i pomoc w obrazowaniu. Dziękujemy również laboratorium Porreca za korzystanie z ich Vibratome. Badania te były wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH NS065116, A.A.K.).

UWAGA: Myszy były hodowane i utrzymywane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnymi odwróconymi cyklami światła/ciemności z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum na Uniwersytecie Arizony. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Arizony. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Myszy Cre-reporter są na tle C57BL/611 i są dostępne na rynku.
1. Zakażenie myszą
UWAGA: Opisana poniżej metoda zakażenia myszy Toxoplasma gondii została wykorzystana w badaniach opublikowanych wcześniej10–12.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Hoduj szczepy Toxoplasma w ludzkich fibroblastach napletka (HFF) hodowanych w pożywce Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (cDMEM) w kolbie T-25 w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aż pasożyty utworzą duże wakuole parazytoforyczne.</li>
	<li>Pasożyty uwalniające się ze strzykawki poprzez zeskrobanie komórek z dna kolby i przepuszczenie otrzymanego roztworu przez igłę o rozmiarze 25 G podłączoną do strzykawki o pojemności 3 ml 2 razy wewnątrz kolby, a następnie przeniesienie całego roztworu do pojemnika na strzykawkę o pojemności 5 ml połączonego z igłą o rozmiarze 27, która została umieszczona do góry nogami w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Podłączyć tłok do strzykawki i przepuścić roztwór pasożyta do stożkowej rurki.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 10 minut przy 300 x g. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 4-6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem klasy USP 1x o pH 7,4 (roztwór podstawowy).</li>
	<li>Załaduj hemocytometr 10 μl roztworu podstawowego, odczekaj 5-10 minut, aż pasożyty się uspokoją, a następnie policz liczbę pasożytów w czterech rogach i środkowych kwadratach środkowego dużego kwadratu.</li>
	<li>Rozcieńczyć pasożyty do odpowiedniej wielkości inokulum 100K/200 μl 1x PBS, a następnie wstrzyknąć myszom dootrzewnowo (i.p.) o całkowitej objętości 200 μl. 
	UWAGA: W tej procedurze myszy inokulowano 100K tachyzoitami typu III ()13 w 200 μl 1x PBS. W przypadku zakażania myszy innymi szczepami Toxoplasma może być konieczne dostosowanie stężenia inokulum w celu uwzględnienia poziomu zjadliwości.</li>
</ol>
2. Perfuzja i zbieranie mózgów
UWAGA: Ten protokół został przeprowadzony 21 dni po infekcji (dpi), ponieważ reprezentuje on punkt czasowy, w którym w mózgu myszy znajduje się szczytowa liczba torbieli, ale można użyć innych punktów czasowych. Wielkość, liczba, lokalizacja oraz obecność lub brak torbieli zależy od wielu czynników, w tym szczepu myszy, typu szczepu pasożyta, a także wielkości inokulum7,14–17. Badacze będą musieli indywidualnie określić odpowiednie inokulum dla myszy i używanego przez nią szczepu Toxoplasma.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Ustaw wszystkie chirurgiczne narzędzia do zbierania (Rysunek 1).</li>
	<li>Dla każdej myszy przygotuj i trzymaj na lodzie: strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną 0,9% chlorkiem sodu (NaCl) + 10 U/ml heparyny w 1x sterylnym PBS (heparyna/sól fizjologiczna) klasy USP); strzykawka o pojemności 20 ml wypełniona 4% paraformaldehydem (PFA); Fiolka scyntylacyjna zawierająca 15 ml 4% PFA. W przypadku wielu myszy należy przygotować zlewkę wypełnioną całą ilością każdego roztworu potrzebną dla wszystkich myszy, a następnie pobrać nową strzykawkę pełną roztworu do każdej perfuzji.</li>
	<li>Znieczulij mysz i.p. 200 μl/25 g masy ciała koktajlu ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 24 mg/ml i 4,8 mg/ml) w dniu zainteresowania. Monitoruj mysz pod kątem poziomu znieczulenia, sprawdzając odruch szczypania palców u stóp. Kontynuuj protokół tylko wtedy, gdy mysz nie wykaże żadnej reakcji na mocne uszczypnięcie palca. 
	UWAGA: Inne metody znieczulenia mogą być stosowane, o ile odpowiedni poziom znieczulenia zostanie osiągnięty przed przystąpieniem do protokołu.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na zakrytej platformie piankowej. Przypnij wszystkie cztery kończyny do stóp, a następnie spryskaj klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem (EtOH) (ryc. 2A). Dodanie kilku sterylnych ręczników papierowych pod myszą może być użyte, aby pomóc wchłonąć nadmiar płynów perfuzyjnych.</li>
	<li>Podnieś skórę tuż pod mostkiem za pomocą kleszczy, a następnie użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie. Odciągnij skórę do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową (ryc. 2B).</li>
	<li>Podnieś wyrostek mieczykowaty i wykonaj nacięcie brzucha tuż pod przeponą, odsłaniając wątrobę, która jest tępo wycięta z przepony. Wykonaj dwa nacięcia, jedno po lewej i jedno po prawej przez przeponę i spód żeber. Przedłuż lewe i prawe nacięcie około 1/2-2/3 w górę klatki piersiowej, która jest następnie odbijana z powrotem, aby otworzyć jamę klatki piersiowej (ryc. 2C). 
	UWAGA: Należy uważać, aby podczas tej procedury nie przeciąć żadnych narządów ani głównych naczyń krwionośnych, ponieważ pogorszy to jakość perfuzji.</li>
	<li>Wykonać perfuzję przezskórną z 10-20 ml heparyny/soli fizjologicznej, a następnie 10-20 ml 4% PFA. 
	UWAGA: Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, wątroba zmieni kolor z czerwonego na brązowy (ryc. 2D). Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, naczynia krwionośne będą widoczne (ryc. 2E).</li>
	<li>Odwróć mysz na brzuch, ponownie przypnij stopy, a następnie spryskaj głowę i szyję 70% EtOH. Podnieś skórę od podstawy szyi i wykonaj nacięcie. Usuń skórę, aby odsłonić czaszkę (ryc. 2F). Odetnij głowę na wysokości ramion. Usuń czaszkę, delikatnie usuń mózg i umieść go w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej 4% PFA (ryc. 2G-H). 
	UWAGA: Jeśli mózg jest dobrze ukrwiony, będzie wyglądał na biały bez widocznych naczyń krwionośnych (ryc. 2I). Jeśli mózg nie jest dobrze ukrwiony, naczynia krwionośne będą widoczne (ryc. 2J).</li>
	<li>Umieścić fiolkę scyntylacyjną z mózgiem w 4% PFA w temperaturze 4 °C na noc, przykrytą światłem. Przepłucz mózg w 1x PBS klasy innej niż USP i przenieś do nowej fiolki scyntylacyjnej wypełnionej schłodzonym 1x PBS. Przechowywać mózg w 1x PBS w temperaturze 4 °C, przykryty przed światłem. 
	UWAGA: Pomyślne oczyszczenie i obrazowanie zostało osiągnięte dzięki sekcjom przechowywanym w 1x PBS przez okres do jednego miesiąca, ale najlepiej jest przeciąć mózg w ciągu kilku dni, ponieważ długotrwałe przechowywanie w PBS odwróci fiksację PFA i może prowadzić do mniej niż optymalnych obrazów. Autofluorescencję i zwiększone rozmycie zaobserwowano w niektórych sekcjach sfotografowanych po przechowywaniu w 1x PBS przez miesiąc lub dłużej.</li>
</ol>
3. Sekcja mózgu
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Usuń mózg z 1x PBS i umieść go w macierzy mózgowej (ryc. 3A), aby umożliwić bardziej precyzyjne i równomierne cięcia przez mózg. Odetnij móżdżek i opuszki węchowe, jeśli są obecne, a następnie przetnij mózg koronalnie na 2 lub 3 sekcje. 
	UWAGA: Przycinanie i wycinanie mózgu może odbywać się bez pomocy macierzy mózgowej. Liczba sekcji ciętych koronalnie będzie zależeć od odległości cięcia używanego wibratomu. Mózg można podzielić na sekcje w dowolnej orientacji, chociaż sekcje strzałkowe i czołowe są najczęściej używane do identyfikacji neuroanatomicznej.</li>
	<li>Przymocuj każdy fragment mózgu do bloku montażowego próbki za pomocą cyjanoakrylanu. Umieść mały blok 5% żelu agarozowego za sekcją mózgu w celu podparcia (ryc. 3B). 
	UWAGA: Można zastosować inne mechanizmy wsparcia, ale bez wsparcia wibratom może naciskać na mózg, powodując nierówne podziały.</li>
	<li>Pokrój tkankę na odcinki o grubości 160 μm (odległość robocza obiektywu używanego do obrazowania) z wibratomem ustawionym na prędkość 4 i amplitudę 9, 
	UWAGA: Ustawienia prędkości i amplitudy można dostosować w zależności od używanej maszyny w celu uzyskania równych, gładkich odcinków. Jeśli ustawienia nie są prawidłowe, rezultatem mogą być nierówne przekroje, rozdarcie tkanki lub ślady karbowania.</li>
	<li>Zbierz skrawki tkanek do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej świeżym, schłodzonym 1x PBS, jeśli mają zostać usunięte w ciągu jednego tygodnia. Jeśli skrawki nie zostaną oczyszczone w ciągu jednego tygodnia, należy umieścić je w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych roztworem kriokonserwującym i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Optyczne oczyszczanie wycinków tkanki mózgowej
UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany w stosunku do poprzednio opublikowanej metody 8.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przygotuj glicerol 25%, 50%, 75% i 90% obj. w 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl/PBST).</li>
	<li>Usunąć skrawki z 1x PBS lub, jeśli zawiera się kriokonserwant, spłukać w 1x PBS i przenieść do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 10 ml 25% Gl/PBST. Umieścić fiolkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C, pod przykryciem przed światłem, na 12 godzin.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie sekcje opadły na dno fiolki. Odessać 25% Gl/PBST, pozostawiając tylko tyle, aby pokryć skrawki, a następnie napełnić fiolkę 10 ml 50% Gl/PBST i umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C, pod przykryciem przed wystawieniem na działanie światła, na 12 godzin. Powtórz ten proces dla 75% Gl/PBST, a następnie dla 90% Gl/PBST. Pozostaw sekcje w 90% Gl/PBST na 24 godziny, aby osiągnąć maksymalne oczyszczenie. W trakcie procesu oczyszczania obserwuj stopniowe oczyszczanie optyczne (Rysunek 4). 
	UWAGA: Proces ten może być przyspieszony, jeśli roztwory zostaną zmienione natychmiast po zapadnięciu się skrawków na dno fiolki. W roztworach 75% i 90% skrawki nie opadają aż do dna fiolki, ale unoszą się w środku.</li>
</ol>
5. Montaż sekcji tkanki mózgowej
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Wytnij szkiełko nakrywkowe nr 1,5 na 5 części, aby utworzyć przekładkę. Użyj linijki i ołówka z diamentową końcówką, aby naciąć i złamać szkiełko nakrywkowe wzdłuż linii przerywanych pokazanych na rysunku 5A. Wyrzuć środkową część, ułóż 4 zewnętrzne części na zwykłym szklanym szkiełku, aby utworzyć okno, a następnie nałóż przezroczysty lakier do paznokci na szwy, aby przykleić kawałki przekładki do szkiełka w odpowiedniej konfiguracji (Rysunek 5B). 
	UWAGA: Przekładka posłuży do stworzenia niezbędnej przestrzeni między prowadnicą a szkiełkiem nakrywkowym do montażu oczyszczonych sekcji. Szkiełko nakrywkowe można przyciąć na różne sposoby, aby stworzyć okno o dowolnym rozmiarze. W handlu dostępne są również wstępnie przycięte przekładki piankowe. Aby lakier do paznokci całkowicie wyschł, najlepiej wykonać ślizgi z przekładkami co najmniej dzień przed montażem sekcji.</li>
	<li>Przenieś skrawki na szkiełko za pomocą plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką. Upewnij się, że wypełniłeś okolicę 90% Gl/PBST. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na sekcje, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków. Nadmiar Gl/PBST można usunąć za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.</li>
	<li>Natychmiast zobrazuj neurony GFP+ zawierające torbiele RFP+ Toxoplasma gondii za pomocą mikroskopu konfokalnego (ryc. 7A-B), a następnie przechowuj szkiełka płasko i przykryte przed światłem w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie, uszczelka przesuwa się całkowicie wokół wszystkich krawędzi, aby przechowywać i obrazować w późniejszym czasie. Użycie przezroczystego lakieru do paznokci do uszczelnienia szkiełka jest opcjonalne i może utrudnić usunięcie szkiełka nakrywkowego, jeśli zostanie się usuniętym fragmentami szkiełka w późniejszym terminie w celu dalszej obróbki.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
UWAGA: Można użyć dowolnego mikroskopu, który ma zdolność uzyskiwania stosów z o wysokiej rozdzielczości.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Po początkowym znalezieniu płaszczyzny ogniskowej przy 10X, zmień obiektyw na 20X i przeskanuj przekrój, aby zidentyfikować torbiel znajdującą się wewnątrz komórki GFP+. Wyśrodkuj obszar zainteresowania (ROI) w polu view.</li>
	<li>Zmień obiektyw na 40X. Skoncentruj się w górę iw dół przez cały zwrot z inwestycji, aby upewnić się, że cała komórka i torbiel są widoczne. 
	UWAGA: Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X/1,30 Oil DIC M27.</li>
	<li>Korzystając z zainstalowanego oprogramowania do obrazowania, uzyskaj stos z, który obejmuje całą komórkę z torbielą. Średnie ustawienia używane do uzyskiwania obrazów pokazano na rysunku 6. 
	UWAGA: Ustawienia mogą wymagać dostosowania w zależności od sekcji tkanek każdego badacza i możliwości mikroskopu.</li>
	<li>Uzyskaj maksymalny obraz projekcji stosu z, ustawiając liczbę projekcji na 1. Uzyskaj pełny widok obrotowy, ustawiając liczbę projekcji na 64, 
	UWAGA: Dostępne są inne pakiety oprogramowania, które mogą być używane do uzyskiwania maksymalnej projekcji, obrotu i innych widoków obrazów z-stack</li>.
	<li>Analizuj obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li>
<li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+transmission%2C+diagnosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li>
<li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine%2C+even+after+extensive+parasite+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246(2013).</li>
<li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li>
<li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii%3A+a+histological%2C+immunocytochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li>
<li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain%3A+A+Confocal+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroparasitology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li>
<li>Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li>
<li>Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li>
<li>Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li>
<li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li>
<li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%2C+bradyzoites%2C+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.</li>
<li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Alzheimers+Dis+Other+Demen%22%5BJournal%5D)">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li>
<li>Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis%3A+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925(2011).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li>
<li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li>
<li>Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę, że zmiany komórkowe w zakażonych komórkach gospodarza zostały powiązane z wynikami choroby w infekcjach innymi organizmami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak HIV, wścieklizna i Chlamydia18,19, opracowaliśmy technikę, która pozwoliłaby nam zbadać intymne interakcje zachodzące między komórką gospodarza OUN a Toxoplasma. Opisana tutaj metoda osiąga ten cel, umożliwiając skuteczne obrazowanie przewlekle zakażonych neuronów. Przed opracowaniem tej metody takie obrazowanie było czasochłonne, ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowych obrazów pojedynczych neuronów, które są zainfekowane przez obligatoryjnego wewnątrzkomórkowego pasożyta Toxoplasma gondii.
Toxoplasma jest często uważana za jedną z najbardziej skutecznych pasożytów, ze względu na duży zakres pośrednich żywicieli, który obejmuje ludzi i gryzonie. Zarówno u ludzi, jak i gryzoni, po ostrym zakażeniu poprzez spożycie skażonej żywności lub wody, Toxoplasma jest w stanie wywołać trwałe zakażenie OUN poprzez przekształcenie się z szybko replikującej się formy (tachyzoitu) do formy wolno replikującej się i otorbiającej (bradyzoit). Uważa się, że u osób immunokompetentnych to utajone zakażenie OUN przebiega stosunkowo bezobjawowo, ale u osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci z AIDS lub biorcy przeszczepów, nawrót pasożyta może prowadzić do śmiertelnego toksoplazmatycznego zapalenia mózgu1,2. Ponadto ostatnie badania wykazały, że utajone zakażenie Toxoplasma może prowadzić do zmian w zachowaniu gryzoni3,4, chociaż mechanizm pozostaje nieznany.
Zaskakująco, pomimo tych danych podkreślających znaczenie interakcji OUN-Toxoplasma, stosunkowo niewiele wiadomo o tym związku, zwłaszcza na poziomie komórkowym i molekularnym. Możliwość badania nawet prostych aspektów interakcji mózg-pasożyt została częściowo utrudniona przez ograniczenia technologiczne. Na przykład większość prac pokazujących, że neurony są komórkami, w których utrzymują się torbiele, została wykonana za pomocą mikroskopii elektronowej (EM)5,6. Chociaż EM zapewnia wysoką rozdzielczość, jest czasochłonne, pracochłonne i drogie. Testy immunofluorescencyjne (IF) zostały ostatnio wykorzystane w połączeniu z mikroskopią konfokalną w celu potwierdzenia pracy wykonanej przez EM7. Testy IF są technicznie łatwe do wykonania i stosunkowo niedrogie, ale wykorzystanie tych technik do zrozumienia relacji przestrzennej między torbielą a zakażonym neuronem wymaga seryjnej rekonstrukcji, która jest czasochłonna, trudna technicznie i może prowadzić do utraty cennych informacji. W ten sposób opracowaliśmy metodę, która może być stosowana z mysim modelem toksoplazmozy OUN i pozwala nam obrazować całość zakażonych neuronów bez EM lub immunohistochemii (IHC). Opracowując taką technikę, możemy zacząć badać związek komórkowy między zakażoną komórką a torbielą w stosunkowo szybki i niedrogi sposób.
Metoda, którą opracowaliśmy, łączy nowsze techniki optycznego oczyszczania i obrazowania grubych fragmentów mózgu za pomocą mikroskopii konfokalnej8 z systemem, który oznacza in vivo komórki, którym wstrzyknięto białka pasożytów9,10. W tym systemie zakażamy myszy Cre-reporter, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne (GFP) dopiero po rekombinacji11 za pośrednictwem Cre ze szczepami Toxoplasma, które eksprymują białko czerwonej fluorescencji (RFP) i wstrzykują rekombinazę Cre do komórek gospodarza9. Ta kombinacja pozwala nam pobrać zainfekowany mózg myszy po ustaleniu infekcji OUN, wyciąć grube fragmenty mózgu i szybko zidentyfikować odpowiednie obszary do zobrazowania, znajdując torbiele RFP+. Ważne jest, aby pamiętać, że ponieważ ekspresja GFP w komórkach gospodarza zależy wyłącznie od wstrzyknięcia Cre przez pasożyty, a nie od infekcji, wiele komórek GFP+ nie zawiera pasożytów10. Ponieważ celem tego protokołu jest możliwość obrazowania całych zainfekowanych neuronów, nacisk kładziony jest tylko na neurony GFP+, które również zawierają torbiel RFP+, ale protokół może być również używany do obrazowania neuronów GFP+/RFP-.
Po pobraniu i podziale zainfekowanego mózgu, sekcje stają się przezroczyste przez usunięcie glicerolu. Odpowiednie obszary skrawków są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, co pozwala na niespotykaną dotąd wizualizację zakażonych komórek gospodarza i otorbionych pasożytów w całości. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół identyfikacji, optycznego oczyszczania i obrazowania zainfekowanych neuronów.

<table><tbody><tr><td>System sekcyjny Vibratome Series 1000</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Inne wibratory są kompatybilne</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Prowadnice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowy rysik</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Mikroskop konfokalny Meta</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&reg; Ketamina HCl Inj., USP 100 mg / ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&reg; Ksylazyna do wstrzykiwań 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td> chirurgiczny <td>Kleszcze do kciuków; Cienkie nożyczki - ustawione pod kątem na bok, ostre-ostre; Ostre-ostre nożyczki; Hemostatyki Kelly'ego; Nożyczki majonezowe; Mikro szpatułka.</td></tr><tr>Ludzkie <td></td><td></td><td>komórki napletka (HFF)</td><td>Są to pierwotne komórki z ludzkiego napletka. Wykonujemy je we własnym zakresie, ale można je kupić od zewnętrznych dostawców.</td></tr><tr><td>Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Roztwór streptomycyny, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanylo-L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Kolba z przechyloną szyjką</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x Bez Wapń i magnez</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10x, USP Sterylna ultra czysta klasa</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr jasnej linii</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Matryca do krajalnicy mózgu myszy</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Jednorazowe fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol, etylowy, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>Ten produkt jest kupowany z własnego magazynu.&nbsp; Inne firmy są kompatybilne.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td></td><td></td> Clear <td>Inne marki są kompatybilne</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml z Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Inne strzykawki są kompatybilne</td></tr><tr><td>Trójdrożny kran</td><td></td><td></td><td>Kompatybilna jest każda marka</td></tr><tr><td>Igła</td><td></td><td></td> podskórna <td>Każda marka jest kompatybilna - służy do przypinania myszy.</td></tr><tr><td>Skrobak</td><td></td><td></td> do komórek <td>Każda marka jest kompatybilna</td></tr><tr><td>Rurka 25 G x 12 ", zestaw do bezpiecznego pobierania krwi, z adapterem Luer</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Inne marki są kompatybilne</td></tr></tbody></table>

obrazowanie 3d i analiza neuronów zakażonych in vivo toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii to obowiązkowy, wewnątrzkomórkowy pasożyt o szerokim zakresie żywicieli, w tym ludzi i gryzoni. Zarówno u ludzi, jak i u gryzoni Toxoplasma wywołuje trwającą całe życie trwałą infekcję w mózgu. Podczas gdy ta infekcja mózgu przebiega bezobjawowo u większości osób immunokompetentnych, u rozwijającego się płodu lub osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci z zespołem nabytego niedoboru odporności (AIDS), to upodobanie i utrzymywanie się w mózgu może prowadzić do wyniszczającej choroby neurologicznej. Tak więc jasne jest, że interakcja mózg-toksoplazma ma kluczowe znaczenie dla objawowej choroby wywoływanej przez Toxoplasma, jednak niewiele wiemy o interakcji komórkowej lub molekularnej między komórkami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) a pasożytem. W mysim modelu toksoplazmozy OUN wiadomo od ponad 30 lat, że neurony są komórkami, w których pasożyt trwa, ale niewiele jest dostępnych informacji na temat tego, która część neuronu jest ogólnie zainfekowana (soma, dendryt, akson) i czy ta relacja komórkowa zmienia się między szczepami. Po części ten brak jest wtórny do trudności w obrazowaniu i wizualizacji całych zainfekowanych neuronów zwierzęcia. Takie obrazy zazwyczaj wymagają seryjnego cięcia i zszywania tkanek obrazowanych za pomocą mikroskopii elektronowej lub mikroskopii konfokalnej po barwieniu immunologicznym. Łącząc kilka technik, opisana tutaj metoda umożliwia wykorzystanie grubych skrawków (160 μm) do identyfikacji i obrazowania całych komórek, które zawierają torbiele, umożliwiając trójwymiarową wizualizację i analizę pojedynczych, przewlekle zakażonych neuronów bez konieczności barwienia immunologicznego, mikroskopii elektronowej lub seryjnego cięcia i zszywania się. Korzystając z tej techniki, możemy zacząć rozumieć związek komórkowy między pasożytem a zainfekowanym neuronem.

Rysunek 7 zawiera reprezentatywne obrazy dwóch neuronów GFP+ zawierających cysty z dwóch różnych przekrojów o grubości 160 µm, a także reprezentatywny pomiar odległości od cysty do ciała komórkowego dla Rysunku 7B. Rysunki 7 A oraz B ilustrują, że ten nowy protokół umożliwia wizualizację zainfekowanego neuronu w całości. Rysunek 7C pokazuje, że dzięki tej technice obrazowania możliwe jest teraz ilościowe określenie odległości ...

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Ogólnym celem tej procedury jest pełna wizualizacja neuronów zakażonych torbielami Toxoplasma Gandhi. Osiąga się to za pomocą pierwszych dootrzewnowych zakażeń myszy reporterowych Cree pasożytami, które wyrażają wiśnię M i są zaprojektowane do wstrzykiwania rekombinazy CRE do komórek gospodarza. Po ustaleniu infekcji OUN drugim krokiem jest wykonanie perfuzji transsercowej z solą fizjologiczną heparyny, a następnie 4% paraldehydu.Następnie zbierz mózg, usuń i wyrzuć opuszki węchowe, a móżdżek pokrój pozostały mózg na dwie połowy, a następnie pokrój połówki na sekcje o grubości 160 mikronów. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie skrawków za pomocą stopniowanych roztworów glicerolu PBS i zamontowanie ich na szkiełkach w celu obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie obrazy mogą być analizowane za pomocą oprogramowania, które umożliwia renderowanie i analizę 3D, a metoda ta może być wykorzystana do pokazania relacji komórkowej między torbielą a zainfekowanymi neuronami.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak szeregowe, cięcie, barwienie i rekonstrukcja grubych odcinków, jest to, że eliminuje ona wymagania dotyczące barwienia i rekonstrukcji, które mogą być technicznie trudne i czasochłonne. Zademonstruje tę procedurę Carla Cabral, specjalistka ds. badań z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia mózgu myszy zakażonego Toxoplasma Gandhi w macierzy mózgowej w celu precyzyjnego i równego cięcia, odcięcia móżdżku i opuszki węchowej.Następnie przetnij mózg na dwie sekcje czołowe. Przymocuj każdą sekcję mózgu do bloku montażowego próbki za pomocą Sano acrl. Następnie umieść mały blok żelu 5% Aros za sekcją mózgu, aby uzyskać wsparcie.Pokrój tkankę na odcinki utrwalające o wielkości 160 mikronów za pomocą viome ustawionego na prędkość czterech i amplitudę dziewięciu. Następnie przenieś skrawki tkanek do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej świeżo schłodzonym XPBS, jeśli mają zostać usunięte w ciągu tygodnia. Jeśli skrawki nie zostaną oczyszczone w ciągu tygodnia, umieść je w 1,5-mililitrowych probówkach wirówek wypełnionych krioroztworem konserwującym i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Teraz przygotuj glicerol 25%50%75% i 90% objętości objętości w jednym XPBS plus 2%między 20. Następnie usuń skrawki z jednego XPBS lub, jeśli są w kriokonserwacie, opłucz je w jednym XPBS i przenieś do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 10 mililitrów 25% glicerolu PBST. Umieścić przykrytą fiolkę na shakerze.Przykryj fiolkę, aby uniknąć ekspozycji na światło i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po 12 godzinach upewnić się, że wszystkie sekcje opadły na dno fiolki. Odessać 25% glicerolu PBST, pozostawiając tylko tyle, aby pokryć sekcje.Następnie zbuduj fiolkę z 10 mililitrami 50% glicerolu PBST. Umieścić fiolkę na shakerze i chronić przed światłem, inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 12 godzin. Powtórzyć ten proces dla 75% glicerolu PBST i 90% glicerolu PBST, w których skrawki pozostaną unoszące się w środku fiolki.Pozostaw skrawki w 90% glicerolu PBST na 24 godziny, aby osiągnąć maksymalne oczyszczenie. Teraz utwórz przekładkę, przecinając szkiełko nakrywkowe z numerem 1,5 na pięć części za pomocą linijki i ołówka z diamentową końcówką. Wyrzuć centralny element i ułóż cztery zewnętrzne części na zwykłym szklanym szkiełku, aby stworzyć okno.Następnie nałóż przezroczysty lakier do paznokci na szwy, aby przykleić kawałki przekładki do suwaka w odpowiedniej konfiguracji. Następnie przenieś skrawki na szkiełko za pomocą plastikowej pipety z odciętą końcówką. Upewnij się, że wypełniłeś okolicę 90% glicerolem PBST.Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach i uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków. Nadmiar glicerolu PBST można usunąć za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Później. Obraz neuronów GFP dodatnich zawierających torbiele Toxoplasma Gandhi dodatnie RFP za pomocą mikroskopu konfokalnego Po zakończeniu przechowuj szkiełka płasko i przykryte przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pokazano tutaj maksymalne obrazy projekcyjne neuronów GFP dodatnich zawierających torbiele RFP dodatnie. To jest film rotacyjny 3D komórki. Ten obraz pokazuje wygenerowany przez tęczówkę bezpośredni pomiar liniowy odległości między krawędzią torbieli a krawędzią ciała komórki.W tym przykładzie odległość jest mierzona jako 149 mikronów, a oto film 3D wygenerowany przez IMS pokazujący pomiar od środka do środka i od krawędzi do krawędzi między torbielą a ciałem komórki Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo zgodnie z tą procedurą. Dodatkowe analizy, takie jak liczenie pałek między zakażonymi dendrytami i niezakażonymi dendrytami, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na takie pytania, jak to, czy torbiel zakłóca normalne funkcje neuronów.

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Źródło: Zaeck, L., et al. Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem. J. Vis. exp. (2019).  Ten film pokazuje proces przygotowania i obrazowania tkanki mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny (RABV) w celu oceny postępu infekcji. Przedstawiono w nim kluczowe etapy, w tym barwienie tkanek za pomocą markerów fluorescencyjnych, odwodnienie, oczyszczanie i montaż do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej,...

Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Poznaj metodę obrazowania 3D neuronów zakażonych Toxoplasma gondii u myszy. Protokół umożliwia wizualizację przestrzennych relacji między pasożytem a komórkami nerwowymi.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Przeglądaj więcej filmów