Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest walidacja zastosowania szczepu eksprymującego lucyferazy do nieinwazyjnego monitorowania tworzenia się biofilmu in vivo przez komórki Candida albican. Osiąga się to poprzez wszczepienie fragmentów cewnika skolonizowanych lucyferazyą wyrażającą szczep Candida albicans w grzbiecie myszy. W drugim etapie drożdże mogą wyrosnąć w grubą warstwę komórek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej, wytwarzając dojrzały biofilm po wewnętrznej stronie cewników.

Następnie dodaje się substrat, który zostanie przekształcony przez enzym lucyferazy. W wyniku tej reakcji powstaje mierzalne światło, obrazowanie bioluminescencyjne lub BLI jest następnie wykorzystywane do rejestrowania i ilościowego określania powstawania biofilmu w żywym gospodarzu. Główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi technikami, takimi jak centralny system Venmo, jest to, że możemy przetestować do sześciu biofilmów wewnątrz jednego zwierzęcia, co znacznie zmniejsza liczbę zwierząt, których potrzebujemy do analizy statystycznej.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii tworzenia biofilmu Candida albicans, ponieważ nasza metoda pozwala na łatwe testowanie istniejących i nowych składników przeciwgrzybiczych. Metoda ta może również zapewnić wgląd w candida albicans, biofilmy grzybów. Może być również stosowany do innych drobnoustrojów, takich jak bakterie lub inne zabawne gatunki.

Proponowane procedury są łatwe do wdrożenia w każdym laboratorium, które ma dostęp do pomieszczenia dla zwierząt na 24 godziny przed zabiegiem chirurgicznym, otworzyło opakowanie zawierające cewniki o potrójnym świetle w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Użyj sterylnej pęsety, aby usunąć wszystkie niepotrzebne części i sterylnego skalpela, aby przeciąć część przymocowaną do cewnika. Następnie umieść linijkę pod plastikowym opakowaniem i pokrój cewnik poliuretanowy na centymetrowe kawałki.

Następnie napełnij każdy cewnik około 1,8 mililitra 100% płodowej surowicy bydlęcej i inkubuj kawałki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przenieś każdy kawałek cewnika pokrytego surowicą do pojedynczych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i zeskrob C albicans z płytki A YPD do jednego mililitra PBS w oddzielnej probówce mikrowirówki w rozcieńczeniu od jednego do 100. Po zliczeniu rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowego stężenia pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr.

I dodaj jeden mililitr komórek do każdego z kawałków cewnika pokrytego surowicą. Pozwól komórkom przylegać do cewników przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przytrzymaj probówki w pozycji pionowej za pomocą sterylnej pęsety.

Delikatnie przepłucz każdy kawałek przez światło dwukrotnie jednym mililitrem PBS, aby umieścić cewniki. Zacznij od ogolenia dolnej części pleców ośmiotygodniowej znieczulonej myszy płci żeńskiej umieszczonej na poduszce grzewczej. Następnie zdezynfekuj skórę i wykonaj jedno małe nacięcie o długości od 0,5 do jednego centymetra z każdej strony zwierzęcia.

Następnie rozetnij subcu nożyczkami, aby utworzyć dwa podskórne tunele o długości około 1,5 centymetra i szerokości jednego centymetra. Włożyć trzy części cewnika do każdego tunelu, upewniając się, że kawałki leżą obok siebie w układzie poziomym, nie nakładając się na siebie. Zamknij nacięcia szwami, a następnie bardzo delikatnie oczyść rany środkiem dezynfekującym.

Następnie nałóż znieczulenie miejscowe bezpośrednio na nacięcia i podaj środek odwracający znieczulenie, monitorując zwierzęta do czasu ich całkowitego wyzdrowienia. Aby zobrazować tworzenie się biofilmu w odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, wstrzyknij 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej cewki i terezyny podskórnie do każdego obszaru zawierającego cewniki u znieczulonego zwierzęcia. Następnie wykonuj kolejne skany z czasem akwizycji od 20 do 60 sekund, aż do osiągnięcia maksymalnej intensywności sygnału.

Podczas pobierania kolejnej ramki umieść obszar zainteresowania nad każdym z trzech cewników, aby zmierzyć obrazowanie bioluminescencyjne lub intensywność sygnału BLI wcześniej nabytych ramek. Umieść prostokątny obszar zainteresowania o stałym rozmiarze na obszarze kontrolnym, aby zmierzyć sygnał tła w oprogramowaniu do obsługi obrazu na żywo. Zmierz strumień fotonów przez obszary zainteresowania dla każdego trio cewnika, a także dla tła.

Po powtórzeniu tych pomiarów dla każdego zwierzęcia i w różnych punktach czasowych podczas tworzenia biofilmu, intensywność sygnału BLI każdego trio cewnika jako strumień fotonów na sekundę. Dane można kopiować i wklejać bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego. Pod koniec eksperymentu podłużnego należy złożyć w ofierze każde zwierzę przecięte przez tkankę podskórną i użyć sterylnej pęsety, aby usunąć fragmenty cewnika jeden po drugim.

Umyj cewniki dwa razy w jednym mililitrze PBS, jak właśnie pokazano. Następnie poddać sonikacji kawałki w nowej mikroprobówce wirówkowej w jednym mililitrze świeżego PBS przy 40 000 Hz w łaźni wodnej. Po 10 minutach przeprowadzić sonizację, umieścić probówki zawierające cewniki na lodzie i rozlać 100 mikrolitrów oryginalnych próbek w rozcieńczeniach od jednego do 10 i od jednego do 100 na płytkach agarowych YPD.

W dwóch egzemplarzach. Na koniec wykreśl średnią i odchylenie standardowe jednostek tworzących kolonię. I sygnał BLI dla każdego zwierzęcia w skali logarytmicznej.

Na tym zdjęciu pokazane jest reprezentatywne zwierzę wyświetlające sygnał bioluminescencji wraz z obszarami zainteresowania oznaczonymi sześć dni po rozwoju biofilmu. Zwraca się uwagę na brak sygnalizacji w obszarze tła kontrolnego potwierdzającego ograniczenie biofilmu do obszarów bezpośrednio przylegających do cewników pokrytych candidą. W tym reprezentatywnym eksperymencie można zaobserwować wyraźny sygnał BLI wytwarzany przez lucyferazy wyrażające biofilmy, podczas gdy tylko sygnał tła wydaje się być wytwarzany przez szczep typu dzikiego.

Ten wzrost sygnału podąża za tym samym trendem, co wzrost liczby jednostek tworzących kolonie na biofilm i pomiary strumienia fotonów dla każdej grupy zwierząt razem wzięte. Dane te ilustrują, że BLI jest potężną techniką monitorowania i ilościowego określania in vivo tworzenia biofilmu dojrzałych C. albicans w podskórnym modelu myszy. Po opanowaniu zakażenie urządzeń komórkami Candida może zająć dwie godziny, podczas gdy implant cewnika można wykonać w ciągu 10 minut na mysz.

Obrazowanie BLI można wykonać w ciągu pięciu minut na mysz. Dużą zaletą stosowania BLI jest to, że można wielokrotnie monitorować rozwój biomasy i biofilmu u tego samego zwierzęcia. Z biegiem czasu Po tej procedurze inne metody, takie jak rezonans magnetyczny lub tomografia komputerowa, mogą dostarczyć informacji na temat dokładnej pozycji katedry.

Informacje te można następnie wykorzystać do kwantyfikacji w bardziej złożonych modelach, takich jak model katedry z żyłami głębokimi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobre zrozumienie, jak wykonywać in vivo, biofilm podskórny, ss u myszy, a to może stanowić podstawę do dalszej dogłębnej analizy interakcji patogenów gospodarza.