Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja partnerów interakcji białkowych białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą testu KOMPLEMENTACJI fragmentu białka hydro reduktazy folianowej DI lub D-H-F-R-P-C-A. Osiąga się to poprzez najpierw zagęszczenie kolekcji DH FFR F three lub pochwałę macierzy kolonijnych o dużej gęstości. Następnie szczep przynęty jest wytwarzany z szeregiem pochwał na bogatym podłożu.

W ostatnim kroku wybierane są diploidy powstałe w wyniku tych wiązań. Ostatecznie rekonstytucja DHFR jest określana ilościowo poprzez pomiar wielkości kolonii na selektywnej pożywce PCA, która daje sygnał proporcjonalny do ilości kompleksu przynęty zdobycz odtworzonego w komórkach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii chorób takich jak rak, ponieważ polega ona na ponownym okablowaniu sieci interakcji białek.

Że mutacje mogą prowadzić do takich chorób. Rano w dniu zabiegu wysterylizuj platformę robotyczną, najpierw zanurzając narzędzia PIN pięć razy przez 10 sekund w stacji kąpieli wodnej, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Następnie zanurz narzędzie PIN dwa razy w przód iw tył w stacji szczotkowej i dwa razy w stacji cateringowej na 20 sekund, aby usunąć pozostałe komórki podczas czyszczenia narzędzi PIN.

Włącz lampę UV na pięć minut, aby wysterylizować robota. Obudowa następnie po ostatnim praniu wysuszyć narzędzia PIN w stacji osuszacza powietrza przez 25 sekund. Skondensuj tutaj kolekcję A-D-H-F-R na 16 tablicach 384 szczepów.

Tablicę 384 można podzielić na cztery równomiernie rozmieszczone ćwiartki, z których każdy składa się z 96 pozycji w układzie macierzy dwa na dwa, co daje w sumie cztery ćwiartki. Aby to zrobić dla każdej macierzy 384, wydrukuj cztery płytki glicerolu na czterech ćwiartkach dookólnej tacy zawierającej YPD plus 250 mikrogramów na mililitr. Higromycyna B, używając w tym celu narzędzia 96-pinowego, włóż 4 96-dołkowe płytki zawierające kontrolę ujemną LDH FFR F między 60 płytek glicerolu z kolekcji DHFR trzy, aby uzyskać końcowy zestaw 64 płytek, które dokładnie wypełniają cztery matryce 1 536.

Następnie włóż 4 96-dołkowe płytki zawierające kontrolę ujemną LDH, FFR, F, między 60 innych płytek, aby uzyskać końcowy zestaw 64 płytek, które dokładnie wypełniają 4, 15, 36 tablic, przed dodaniem komórek do płytek źródłowych, zwilż wysterylizowane szpilki w 35 mililitrach sterylnej wody w omni tacce w stacji mokrej. Inkubuj tablice w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni, a następnie skondensuj kolekcję w cztery tablice po 1 536 szczepów. Wydrukuj cztery tablice 384 szczepów na każdej z czterech płyt docelowych.

Korzystanie z narzędzia 384 pin. Sterylizacja narzędzia PIN między każdym cyklem replikacji, jak właśnie wykazano po kolejnej dwudniowej inkubacji. Ustandaryzuj wielkość kolonii, replikując cztery tablice na wybranym pożywce YPD za pomocą narzędzia 1,536 pin i inkubuj płytki przez kolejne 48 godzin.

Dla wysokiej przepustowości. D-H-F-R-P-C-A najpierw zaszczepia kulturę szczepu przynęty w 20 mililitrach płynnego YPD plus rycyny CIO w 50-mililitrowej probówce i inkubuje komórki przez dwa dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min. Gdy kultura osiągnie nasycenie.

Umieść pięć mililitrów zawiesiny komórkowej na tacy YPD plus komar omni i pozwól komórkom wchłonąć się na powierzchni po pięciu do 10 minutach, usuń nadmiar płynu i inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza po dwóch dniach. Użyj narzędzia do szpilek 1,536, aby wydrukować szczep przynęty na 12 płytkach YPD, używając każdego trawnika komórkowego nie więcej niż cztery razy. Następnie za pomocą narzędzia do szpilek 1,536 ponownie wydrukuj odpowiednią tablicę dla kolekcji DHFR F trzy na wierzchu komórek przynęty.

Pozwól szczepom połączyć się w pary podczas kolejnej dwudniowej inkubacji, a następnie wybierz komórki diploidalne, drukując kolonie na tacach omni zawierających YPD plus hydro mycynę B i nortynę. Inkubuj diploidy przez kolejne dwa dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, a następnie powtórz selekcję, jak właśnie pokazano, jeden dzień po inkubacji. Następnego dnia należy zalać płytki pożywką zawierającą metotreksat.

Użyj narzędzia 1,536 pin, aby wydrukować diploidalne komórki na pożywce metotreksatu i inkubować płytki przez kolejne cztery dni w plastikowych torebkach, aby zapobiec wysychaniu kultur. W trzecim dniu inkubacji. Wlej drugą partię tacek omni zawierających podłoże MTX, jak właśnie pokazano następnego dnia, włącz światło robota i użyj platformy robotycznej do obrazowania płytek, aby zmniejszyć wzrost tła szczepów PCA i zwiększyć rozdzielczość ilościową, powtórz komórki na drugiej partii pożywki MTX, aby wykonać drugą rundę selekcji MTX, jak właśnie pokazano.

Na koniec, po uzyskaniu obrazów z drugiego zestawu płytek, przeanalizuj tablice kolonii za pomocą odpowiedniego oprogramowania, zbierając informacje o wielkości kolonii dla każdej pozycji każdej tablicy. Próg zdefiniowany za pomocą trzech kontrolek LDH FFR F może być używany jako próg empiryczny do określania trafień o wysokim poziomie ufności. Znane fizyczne interakcje przynęty można następnie pobrać z baz danych, takich jak Biogrid, i nałożyć na dane.

Na przykład w tym przypadku pięć z ośmiu trafień o wysokim poziomie ufności zostało wcześniej zgłoszonych jako interakcje NUP 82, wśród których inne NUP 16 i NUP 1 59 zostały określone jako część podkompleksu NUP 82. Dane wskazują również, że przybliżone białko błonowe PEX 30 może reprezentować nową fizyczną interakcję Nup 82, co potwierdzono przy użyciu D-H-F-R-P-C-A przy niskiej przepustowości, którą wykryto u dwóch innych partnerów interakcji. Ustalono, że nowe 20 i nowe 85 nie są częścią nowego podkompleksu 82, co ilustruje zdolność D-H-F-R-P-C-A do wykrywania interakcji wewnątrz i między podkompleksami większych kompleksów.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać nośnika Freshly Report, aby uniknąć rozwiązywania problemów z etapami drukowania i uwzględnić niezbędne kontrole, aby upewnić się, że końcowy nośnik PCA umożliwia wzrost tylko komórek wykazujących komplementację DHFR.