Name: Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę wykrywania prawdziwych komórek B produkujących IgE u myszy przy użyciu trypSyny i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia dokładną analizę rekombinacji klasy przełączania IgH in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.R.W. jest wspierany przez granty NIH AI089972 i AI113217, oraz przez Zespół Badań nad Immunologią Błony Śluzowej, a także posiada Nagrodę Kariery dla Naukowców Medycznych od Burroughs Wellcome Fund.

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj eksperymenty były zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zatwierdzone przez Animal Research Children's Hospital (ARCH), Boston, Massachusetts.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>1,000x IL-4 Stock: Rozcieńczyć cytokinę IL-4 do 20 μg/ml wH2Olub 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dozować 200 μl podwielokrotności do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>1,000x anty-CD40: Uzyskać od producenta w stężeniu 1,0 mg/ml, przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pożywka do stymulacji limfocytów B: Do 425 ml pożywki RPMI-1640 dodać 75 ml świeżo rozmrożonej płodowej surowicy cielęcej (FCS), 10 ml 1,0 M buforu HEPES, 5 ml bulionu L-glutaminy, 5 ml bulionu penicylina: Streptomycyna, 5 ml minimalnej ilości niezbędnych pożywki dla aminokwasów endogennych (MEM-NEAA) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu. Utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Dodać IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) bezpośrednio przed użyciem tylko do wymaganej objętości podłoża.</li>
	<li>2% bufor FCS-FACS: Dodaj 10 ml FCS do 490 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>2x roztwór trypsyny-EDTA: Rozcieńczyć 5 ml 10x roztworu podstawowego trypsyna-EDTA (5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA na litr) w 20 ml 1x PBS. Przechowywać trypsynę-EDTA w 2 porcjach roboczych w temperaturze 4 °C. Przed użyciem pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Surowica cielęca płodu: Rozmrożony FCS należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Umieścić na lodzie 15 minut przed zabiegiem barwienia cytoplazmatycznego.</li>
	<li>Formalina buforowana obojętnie: Przygotuj 10% roztwór formaliny (3,7% paraformaldehydu). Formalina jest toksyczna, dlatego należy obchodzić się z nią pod laboratoryjnym wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej. Przechowuj formalinę w temperaturze pokojowej w szafie do przechowywania chemikaliów.</li>
	<li>Metanol: Przechowuj metanol bezwzględny (100%) w temperaturze -20 °C, aż komórki będą gotowe do przepuszczalności. Należy pamiętać, że metanol jest łatwopalny i powinien być przechowywany w odpowiedniej zamrażarce.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie i aktywacja komórek B
<ol>
	<li>Ze świeżo pobranej śledziony myszy przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie przeciskając narząd przez sitko o wielkości 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zebrać komórki w 10 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przez 5 min. Zneutralizować 13,5 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Oddziel magnetycznie komórki B za pomocą kulek znakowanych anty-CD45R(B220), postępując zgodnie z protokołem oczyszczania MACS zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Stymulować oczyszczone limfocyty B w stężeniu 1,0 x 106 komórek/ml w podgrzanej pożywce do stymulacji komórek B zawierającej IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Rozpocząć od 8 ml kultury podzielonej na 2 dołki 6-dołkowej płytki hodowlanej (po 4 ml każda).</li>
	<li>Sprawdzaj hodowlę codziennie, aby utrzymać ją na poziomie 1,0 x 106 komórek/ml. Dostosuj stężenie, dzieląc się na inne dołki i rozcieńczając kulturę pożywką stymulacyjną komórek B zawierającą świeżą IL-4 i anty-CD40.</li>
</ol>
3. Trypsynizacja, fiksacja i przepuszczalność
<ol>
	<li>Trypsynizacja
	<ol>
		<li>Zebrać maksymalnie 1,0 x 107 hodowanych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant.</li>
		<li>Przemyć 10 ml PBS w celu usunięcia pozostałości białka z pożywki komórkowej. Powtórzyć etap wirowania i zdekantować supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w objętości pozostałej po dekantacji (około 100 μl).</li>
		<li>Ostrożnie dodaj do komórek 800 μl 0,1% (2x) trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej. Dozuj powoli pod kątem 45° wzdłuż boku stożkowej tuby.</li>
		<li>Zamknij probówkę i delikatnie wymieszaj, przechylając probówkę tak, aby płyn płynął wzdłuż rurki 5-6 razy. W roztworze może tworzyć się żylasty, biały osad. Ogranicz czas trypsynizacji do mniej niż minuty.</li>
		<li>Ugasić reakcję trypsynizacji 1 ml zimnego FCS. Natychmiast rozcieńczyć FCS, dodając 10 ml zimnego PBS.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, następnie zdekantować supernatant i ponownie umieścić probówki w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości po dekantacji. W razie potrzeby zwiększyć objętość do 100 μl zimnym PBS.</li>
		<li>W dygestorium dodać 800 μl 10% neutralnego buforowanego roztworu formaliny do komórek i pipetować w górę iw dół. Rurka ogrzeje się po dodaniu formaliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność
	<ol>
		<li>Ustaw stołowy mikser wirowy z delikatną prędkością potrząsania.</li>
		<li>Pobrać 9 ml zimnego (-20 °C) metanolu do pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Przytrzymaj probówkę zawierającą komórki nad mieszalnikiem wirowym i delikatnie zacznij potrząsać komórkami.</li>
		<li>Dodaj zimny metanol do probówki, aby spadał kroplami na komórki, podczas gdy rurka nadal się trzęsie, tak aby metanol stale się mieszał. Po pierwszych 2 ml metanolu prędkość dozowania można zwiększyć do wolnego strumienia.</li>
		<li>Pozostaw rurkę na lodzie na 30 minut, aby zakończyć przepuszczalność. Alternatywnie ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie fluorescencyjne dla przełączania klas IgG1 i IgE
<ol>
	<li>Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut i zdekantować roztwór metanolu. Biały osad może osadzać się z komórkami.</li>
	<li>Dodać 10 ml o temperaturze pokojowej 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w celu przepłukania komórek. Powtórz raz. Uwaga: Mycie granulatu PBS w temperaturze pokojowej rozpuszcza dodatkowy osad, który może powstać po kroku 4.1.</li>
	<li>Wykonać dodatkowe płukanie 10 ml 2% buforu FCS-FACS.</li>
	<li>Rozprowadzić próbki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i umieścić płytkę na lodzie.</li>
	<li>Wybarwić w 60 μl 2% buforu FCS-FACS na studzienkę następującymi rozcieńczeniami przeciwciał: Anti-IgM RPE/Cy7, 1:200, Anti-IgG1 PE, 1:600, Anti-IgE FITC, 1:100, Anti-CD45R(B220) PerCP-Cy5.5, 1:200</li>
	<li>Po 5 minutach barwienia przemyć płytkę 150 μl 2% buforu FCS-FACS i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 400 μl 2% buforu FCS-FACS i pipetować przez sitko z komórek nylonowych o średnicy 40 μm do probówki FACS o pojemności 5 ml.</li>
</ol>
5. Użyj następującej strategii bramkowania:
<ol>
	<li>Wyizoluj komórki CD45R (B220) dodatnie z populacji limfocytów blastingowych znajdujących się na powierzchni FSC / SSC (ryc. 1).</li>
	<li>Z komórek B220 dodatnich użyj wykresu IgE i IgG1, aby ujawnić odpowiednie populacje.</li>
</ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Stymulacja mysich komórek B śledziony w hodowli za pomocą anty-CD40 i IL-4 będzie symulować interakcje T pomocniczego typu 2 (TH2), zachęcając do zmiany klasy na IgG1 i IgE5. Limfocyty B mogą być aktywowane do CSR w kontekście całkowitych splenocytów12 lub jako oczyszczone komórki B śledziony11. Jak zauważono w protokole (krok 2.3), wzbogacanie limfocytów B jest opcjonalne i zależy od uznania eksperymentatora, aby określić, czy byłoby to korzystne. Wykorzystuje się tutaj dodatn...

Podczas rekombinacji przełącznika (CSR) klasy ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (IgH) u myszy i ludzi, eksony IgH μ stałego regionu (Cμ) są usuwane i zastępowane przez jeden z kilku zestawów dalszycheksonów ostałym regionie (CH, s) (np. Cγ, Cε i Cα), co powoduje przejście z produkcji IgM na produkcję innych klas Ig (np. IgG, IgE lub IgA). CSR występuje w obszarach przełączania (S), które są sekwencjami 1-10 kb położonymi 5' do każdego zestawu CHs 1. Enzym deaminaza cytydyny indukowana aktywacją (AID) inicjuje CSR poprzez aktywność deaminacji cytydyny.
IgE jest kluczowym mediatorem choroby alergicznej2, a lepsze zrozumienie, w jaki sposób IgE jest wytwarzane i regulowane, może otworzyć drzwi do nowych podejść terapeutycznych do choroby atopowej. U myszy i ludzi IgE jest najściślej regulowanym izotypem Ig. IgE jest zwykle wykrywana na poziomach tysiące razy niższych niż inne izotypy IgH3, ale może być bardzo podwyższona w stanach chorobowych4. Jednak CSR do IgE nie jest w pełni zrozumiały. Aktywacja in vitro limfocytów B za pomocą IL-4 w połączeniu z anty-CD40 lub LPS indukuje CSR zarówno do IgG1, jak i IgE5. Aktywowane limfocyty B wyrażają receptor IgE o niskim powinowactwie FcεRII/CD232,6, który wiąże rozpuszczalne IgE wydzielane w hodowli po CSR. Dlatego podczas analizy za pomocą cytometrii przepływowej komórki B z IgE związanymi z receptorem barwią się podobnie jak komórki B endogennie eksprymujące IgE7. Chociaż wiadomo, że mysie limfocyty B wyrażają receptor IgG o niskim powinowactwie FcγRIIB1 (CD32)8, z naszego doświadczenia wynika, że nie wydaje się, aby przeszkadzało to w pomiarze przejścia klasy na IgG1. Jednak podczas pomiaru przełączania IgE po aktywacji limfocytów B w hodowli, niespecyficzne IgE związane powierzchniowo mogą zaciemniać analizę. W przypadku typowych metod barwienia komórki bez ekspresji IgE barwią się dodatnio na obecność IgE.
Opisana tutaj jest strategia, która została wykorzystana do przeprowadzenia testów CSR i wykrycia prawdziwych limfocytów B z ekspresją IgE od myszy 9-11. Traktowanie aktywowanych limfocytów B trypsyną, powszechnym odczynnikiem laboratoryjnym do trawienia białka, usuwa zarówno cytofilowe, jak i związane z błoną powierzchniową IgE. Późniejsza przepuszczalność i barwienie cytoplazmatycznych IgE ujawnia zatem prawdziwe komórki wytwarzające IgE.

<table><tbody><tr><td>Przeciw myszym IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>klon R35-72</td></tr><tr><td>Szczur Przeciw myszom IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen 550083</td><td></td><td>klon A85-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Utrzymuj w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell 40 & mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell 70 i mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>anty-mysz/szczur CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>klon HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki MACS CD45R (B220)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna oczyszczająca MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Rozpuszcza się w wodzie lub 0,1%</td></tr><tr><td>roztworze formaliny BSA, neutralnie buforowany, 10%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA&#8226; 4 Na litr 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10 000 U Penicylina; 10 mg / ml Streptomycyna (100x)</td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysi IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>klon 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Płodowa surowica cielęca</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>do stymulacji komórek B Pożywka do stymulacji komórek B składa się z RPMI z płodową surowicą cielęcą (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamina,&nbsp; 1x Penicylina-Streptomycyna (penicylina: 100 U/ml, Streptomycyna: 100 &mikro; g/ml), beta-merkaptoetanol (7 &mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1 &mikro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii b z ekspresją ige

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B immunoglobuliny limfocytów ciężkiego łańcucha ciężkiego (IgH) rekombinacja przełącznika (CSR) to proces, w którym początkowo wyrażona IgM przełącza się na inne izotypy IgH, takie jak IgA, IgE i IgG. Pomiar IgH CSR in vitro jest kluczową metodą badania wielu procesów biologicznych, począwszy od rekombinacji i naprawy DNA, a skończywszy na aspektach immunologii molekularnej i komórkowej. Metody in vitro Test CSR obejmuje pomiar powierzchni Ig metodą cytometrii przepływowej na aktywowanych komórkach B. Podczas gdy pomiar podklas IgA i IgG jest prosty, pomiar IgE tą metodą jest problematyczny ze względu na rozpuszczalne wiązanie IgE z FcεRII/CD23 ulegające ekspresji na powierzchni aktywowanych limfocytów B. W tym miejscu opisujemy unikalną procedurę dokładnego pomiaru mysich komórek B wytwarzających IgE, które przeszły CSR w hodowli. Metoda opiera się na rozszczepianiu kompleksów IgE-CD23 za pośrednictwem trypsyny na powierzchni komórek, co pozwala na wykrycie komórek linii B wytwarzających IgE za pomocą barwienia cytoplazmatycznego. Procedura ta stanowi wygodne rozwiązanie do analizy cytometrii przepływowej CSR do IgE.

Procedurę tę z powodzeniem zastosowano do badania CSR do IgE w komórkach B myszy. Aby wykazać skuteczność pomiaru CSR, stymulowano komórki B śledziony myszy przeciwciałem anty-CD40 oraz IL-4, zgodnie z wcześniejszym opisem11. Po pięciu dniach stymulacji komórki zebrano, poddano obróbce zgodnie z powyższym protokołem i wybarwiono przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko IgM, IgG1, IgE oraz B220 (CD45R). Po bramkowaniu limfocytów blastycznych (Rysunek 1) wyraźna populacja komórek IgE+ nie może...

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B. Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odróżnienie prawdziwych komórek B eksprymujących IgE od komórek B, wyrażających inne izotypy IgE wydzielane przez IgE. Podczas testów in vitro zamiana klas wiąże się z białkami powierzchniowymi komórek B, co uniemożliwia pomiar zmiany klasy na IgE. Cel ten osiąga się poprzez usunięcie cząsteczek IgE związanych z receptorem przed analizą za pomocą trypsyny, która nie rozszczepia specyficznie białek powierzchniowych komórek, pozostawiając nienaruszone endogennie wytwarzane wewnątrzkomórkowe cząsteczki immunoglobuliny.Po drugie, białka wewnątrzkomórkowe są eksponowane poprzez wiązanie komórek B za pomocą forminy i przenikanie komórek metanolem. Następnie komórki są barwione fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami w celu ujawnienia wewnątrzkomórkowych immunoglobulin. Wyniki wskazują na wyraźną populację IgE-dodatnich komórek B.Jeśli trypsyna jest stosowana w oparciu o analizę cytometrii przepływowej, badania nad biologią IgE były ograniczone ze względu na trudności w wykryciu komórek wytwarzających IgE. Metoda ta zapewnia dostępne rozwiązanie, które laboratoria mogą łatwo zaadoptować, aby przyspieszyć nasze zrozumienie tej interesującej cząsteczki. Technika ta jest korzystna w stosunku do istniejących metod eliminowania wpływu IgE związanych z receptorem.Na przykład jest mniej kosztowny niż blokowanie powierzchniowych IgE za pomocą przeciwciał anty IgE i bardziej wyrozumiały niż zabieg płukania kwasem. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w analizę klasy mysich komórek B, przejście na leczenie IgE trypsyną przed barwieniem faktów może być również zastosowane do innych protokołów, które wymagają usunięcia białek powierzchniowych ze świeżo zebranej śledziony myszy. Przygotować zawiesinę jednokomórkową.Delikatnie przeciśnij narząd przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów za pomocą tłoka trzymililitrowej strzykawki. Zbierz komórki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów jednego XPBS. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Zdekantować nadnatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek. Pozwól reakcji lizy trwać przez pięć minut, a następnie zneutralizuj ją 13,5 mililitra jednego XPBS. Następnie ponownie odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w pozostałej objętości.Teraz dodaj do komórek ciepłe pożywki stymulacyjne komórek B zawierające IL 4 i anty CD 40. Zacznij od ośmiomililitrowej kultury podzielonej na dwie studzienki z sześciodołkową płytką hodowlaną i stymuluj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Codziennie sprawdzaj kulturę, aby utrzymać komórki na poziomie 1 miliona na mililitr.Dostosuj stężenie, dzieląc kultury na inne dołki i rozcieńczając stymulacją komórek B. Nośnik zawierający świeży IL four i anty CD 40. Zacznij od zebrania do 10 milionów stymulowanych limfocytów B w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.Następnie odwirować je w temperaturze 300 G przez pięć minut i zdekantować supernatant w celu usunięcia pozostałości białka z pożywki do zbierania komórek. Umyj komórki B 10 mililitrami PBS, a następnie ponownie odwiruj i dekantuj snat Po dekantacji ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałej objętości około 100 mikrolitrów i ostrożnie dodać 800 mikrolitrów 0,1% temperatury pokojowej w EDTA. Powoli dodawaj roztwór wzdłuż ścianki bocznej probówki.Dodaj nachylenie, a następnie zakryj rurkę i delikatnie wymieszaj, przesuwając płyn wzdłuż rurki. Pięć lub sześć razy w roztworze może powstać żylasty biały osad w ciągu jednej minuty. Ugasić reakcję jednym mililitrem zimnego FCS.Utrzymuj komórki na lodzie. Teraz wciąż żyją i mogą wyrażać nowe białka powierzchniowe. Natychmiast rozcieńczyć FCS, dodając 10 mililitrów zimnego PBS.Usuń wszelkie pływające zanieczyszczenia za pomocą pipety. Zakręć komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast zdekantować snat i ponownie zawiesić ogniwa w pozostałej objętości.W razie potrzeby zwiększyć objętość do 100 mikrolitrów zimnym PBS, postępując szybko w dygestorium przy 800 mikrolitrach 10% neutralnej buforowanej forminy, pipetować mieszaninę w górę iw dół probówki, po zmieszaniu zacznie się nagrzewać, inkubować komórki w utrwalaczu przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W międzyczasie ustaw stołowy mikser wirowy z delikatną prędkością wstrząsania i przygotuj metanol chłodny do minus 20 stopni Celsjusza do użycia. Kiedy komórki zakończą inkubację.Pobrać dziewięć mililitrów metanolu do pipety serologicznej. Następnie odkorkuj delikatnie rurkę, dodając kroplami metanol. Po dozowaniu dwóch mililitrów metanolu kroplami rozpędzaj się do wolnego strumienia.Teraz pozostaw probówkę na lodzie na 30 minut, aby przeniknąć do komórek. Alternatywnie komórki mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do miesiąca. Procedurę barwienia należy rozpocząć od odwirowania komórek przepuszczalnych i dekantacji metanolu.Biały osad może osadzać się z komórkami. Następnie umyj komórki, mieszając w 10 mililitrach temperatury pokojowej jeden XPBS, wirując i dekantując. Wykonaj ten krok prania dwukrotnie.Następnie wykonaj dodatkowe pranie za pomocą 10 mililitrów faksu 2%FCS, buforuj i ponownie zawiesij. Osad w objętości resztkowej postępuje poprzez załadowanie próbki do jednego dołka 96-dołkowej okrągłej płyty dennej. Wiele próbek jest zwykle przetwarzanych równolegle.Załaduj od 20 do 50 mikrolitrów za pomocą wirówki płytkowej, odwiruj komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Następnie zdekantować snat i położyć talerz na lodzie. Teraz wybarwić komórki do każdej studzienki, dodać 60 mikrolitrów buforu faksowego 2% FCS zawierającego cztery różne przeciwciała.Pozwól komórkom inkubować w plamie przez pięć minut po barwieniu. Umyj komórki, dodając 150 mikrolitrów 2% futra bufora faksu FCS. Następnie odwirować płytkę jak poprzednio, a następnie zdekantować roztwór i ponownie zawiesić komórki.Użyj 400 mikrolitrów bufora faksu 2%FCS. Teraz przeciśnij pipetkę komórek przez nylonowe sitko o grubości 40 mikronów do pięciomililitrowej rurki faksowej do bramki faksowej. Komórki najpierw izolują komórki CD 45 R dodatnie, znane również jako B dwie 20 dodatnich komórek z populacji limfocytów blastyzujących na wykresie F-S-C-S-S-C, a następnie z dwóch komórek B 20 dodatnich.Użyj jednego wykresu IgE i IgG, aby ujawnić odpowiednie populacje za pomocą tej procedury. Rekombinację przełącznika klas do IgE badano w mysich komórkach B przy użyciu strategii bramkowania opartej na limfocytach blastycznych. Wyraźna populacja komórek IgE dodatnich nie mogła być czysto rozróżniona bez trypsyny komórek, trypsyna przed utrwaleniem i przenikaniem umożliwiła separację komórek wytwarzających IgE dzięki usunięciu IgE związanych powierzchniowo Po opanowaniu.Tę technikę barwienia można wykonać w ciągu około godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Praca z formaliną i metanolem może być niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować fumę, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie prawdziwych komórek linii B myszy wyrażających IgE

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Poznaj metodę wykrywania prawdziwych komórek B produkujących IgE u myszy przy użyciu trypSyny i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia dokładną analizę rekombinacji klasy przełączania IgH in vitro.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Przeglądaj więcej filmów