Name: Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę wykrywania prawdziwych komórek B produkujących IgE u myszy przy użyciu trypSyny i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia dokładną analizę rekombinacji klasy przełączania IgH in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.R.W. jest wspierany przez granty NIH AI089972 i AI113217, oraz przez Zespół Badań nad Immunologią Błony Śluzowej, a także posiada Nagrodę Kariery dla Naukowców Medycznych od Burroughs Wellcome Fund.

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj eksperymenty były zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zatwierdzone przez Animal Research Children's Hospital (ARCH), Boston, Massachusetts.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>1,000x IL-4 Stock: Rozcieńczyć cytokinę IL-4 do 20 μg/ml wH2Olub 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dozować 200 μl podwielokrotności do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>1,000x anty-CD40: Uzyskać od producenta w stężeniu 1,0 mg/ml, przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pożywka do stymulacji limfocytów B: Do 425 ml pożywki RPMI-1640 dodać 75 ml świeżo rozmrożonej płodowej surowicy cielęcej (FCS), 10 ml 1,0 M buforu HEPES, 5 ml bulionu L-glutaminy, 5 ml bulionu penicylina: Streptomycyna, 5 ml minimalnej ilości niezbędnych pożywki dla aminokwasów endogennych (MEM-NEAA) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu. Utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Dodać IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) bezpośrednio przed użyciem tylko do wymaganej objętości podłoża.</li>
	<li>2% bufor FCS-FACS: Dodaj 10 ml FCS do 490 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>2x roztwór trypsyny-EDTA: Rozcieńczyć 5 ml 10x roztworu podstawowego trypsyna-EDTA (5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA na litr) w 20 ml 1x PBS. Przechowywać trypsynę-EDTA w 2 porcjach roboczych w temperaturze 4 °C. Przed użyciem pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Surowica cielęca płodu: Rozmrożony FCS należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Umieścić na lodzie 15 minut przed zabiegiem barwienia cytoplazmatycznego.</li>
	<li>Formalina buforowana obojętnie: Przygotuj 10% roztwór formaliny (3,7% paraformaldehydu). Formalina jest toksyczna, dlatego należy obchodzić się z nią pod laboratoryjnym wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej. Przechowuj formalinę w temperaturze pokojowej w szafie do przechowywania chemikaliów.</li>
	<li>Metanol: Przechowuj metanol bezwzględny (100%) w temperaturze -20 °C, aż komórki będą gotowe do przepuszczalności. Należy pamiętać, że metanol jest łatwopalny i powinien być przechowywany w odpowiedniej zamrażarce.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie i aktywacja komórek B
<ol>
	<li>Ze świeżo pobranej śledziony myszy przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie przeciskając narząd przez sitko o wielkości 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zebrać komórki w 10 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przez 5 min. Zneutralizować 13,5 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Oddziel magnetycznie komórki B za pomocą kulek znakowanych anty-CD45R(B220), postępując zgodnie z protokołem oczyszczania MACS zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Stymulować oczyszczone limfocyty B w stężeniu 1,0 x 106 komórek/ml w podgrzanej pożywce do stymulacji komórek B zawierającej IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Rozpocząć od 8 ml kultury podzielonej na 2 dołki 6-dołkowej płytki hodowlanej (po 4 ml każda).</li>
	<li>Sprawdzaj hodowlę codziennie, aby utrzymać ją na poziomie 1,0 x 106 komórek/ml. Dostosuj stężenie, dzieląc się na inne dołki i rozcieńczając kulturę pożywką stymulacyjną komórek B zawierającą świeżą IL-4 i anty-CD40.</li>
</ol>
3. Trypsynizacja, fiksacja i przepuszczalność
<ol>
	<li>Trypsynizacja
	<ol>
		<li>Zebrać maksymalnie 1,0 x 107 hodowanych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant.</li>
		<li>Przemyć 10 ml PBS w celu usunięcia pozostałości białka z pożywki komórkowej. Powtórzyć etap wirowania i zdekantować supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w objętości pozostałej po dekantacji (około 100 μl).</li>
		<li>Ostrożnie dodaj do komórek 800 μl 0,1% (2x) trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej. Dozuj powoli pod kątem 45° wzdłuż boku stożkowej tuby.</li>
		<li>Zamknij probówkę i delikatnie wymieszaj, przechylając probówkę tak, aby płyn płynął wzdłuż rurki 5-6 razy. W roztworze może tworzyć się żylasty, biały osad. Ogranicz czas trypsynizacji do mniej niż minuty.</li>
		<li>Ugasić reakcję trypsynizacji 1 ml zimnego FCS. Natychmiast rozcieńczyć FCS, dodając 10 ml zimnego PBS.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, następnie zdekantować supernatant i ponownie umieścić probówki w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości po dekantacji. W razie potrzeby zwiększyć objętość do 100 μl zimnym PBS.</li>
		<li>W dygestorium dodać 800 μl 10% neutralnego buforowanego roztworu formaliny do komórek i pipetować w górę iw dół. Rurka ogrzeje się po dodaniu formaliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność
	<ol>
		<li>Ustaw stołowy mikser wirowy z delikatną prędkością potrząsania.</li>
		<li>Pobrać 9 ml zimnego (-20 °C) metanolu do pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Przytrzymaj probówkę zawierającą komórki nad mieszalnikiem wirowym i delikatnie zacznij potrząsać komórkami.</li>
		<li>Dodaj zimny metanol do probówki, aby spadał kroplami na komórki, podczas gdy rurka nadal się trzęsie, tak aby metanol stale się mieszał. Po pierwszych 2 ml metanolu prędkość dozowania można zwiększyć do wolnego strumienia.</li>
		<li>Pozostaw rurkę na lodzie na 30 minut, aby zakończyć przepuszczalność. Alternatywnie ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie fluorescencyjne dla przełączania klas IgG1 i IgE
<ol>
	<li>Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut i zdekantować roztwór metanolu. Biały osad może osadzać się z komórkami.</li>
	<li>Dodać 10 ml o temperaturze pokojowej 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w celu przepłukania komórek. Powtórz raz. Uwaga: Mycie granulatu PBS w temperaturze pokojowej rozpuszcza dodatkowy osad, który może powstać po kroku 4.1.</li>
	<li>Wykonać dodatkowe płukanie 10 ml 2% buforu FCS-FACS.</li>
	<li>Rozprowadzić próbki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i umieścić płytkę na lodzie.</li>
	<li>Wybarwić w 60 μl 2% buforu FCS-FACS na studzienkę następującymi rozcieńczeniami przeciwciał: Anti-IgM RPE/Cy7, 1:200, Anti-IgG1 PE, 1:600, Anti-IgE FITC, 1:100, Anti-CD45R(B220) PerCP-Cy5.5, 1:200</li>
	<li>Po 5 minutach barwienia przemyć płytkę 150 μl 2% buforu FCS-FACS i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 400 μl 2% buforu FCS-FACS i pipetować przez sitko z komórek nylonowych o średnicy 40 μm do probówki FACS o pojemności 5 ml.</li>
</ol>
5. Użyj następującej strategii bramkowania:
<ol>
	<li>Wyizoluj komórki CD45R (B220) dodatnie z populacji limfocytów blastingowych znajdujących się na powierzchni FSC / SSC (ryc. 1).</li>
	<li>Z komórek B220 dodatnich użyj wykresu IgE i IgG1, aby ujawnić odpowiednie populacje.</li>
</ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Stymulacja mysich komórek B śledziony w hodowli za pomocą anty-CD40 i IL-4 będzie symulować interakcje T pomocniczego typu 2 (TH2), zachęcając do zmiany klasy na IgG1 i IgE5. Limfocyty B mogą być aktywowane do CSR w kontekście całkowitych splenocytów12 lub jako oczyszczone komórki B śledziony11. Jak zauważono w protokole (krok 2.3), wzbogacanie limfocytów B jest opcjonalne i zależy od uznania eksperymentatora, aby określić, czy byłoby to korzystne. Wykorzystuje się tutaj dodatn...

Podczas rekombinacji przełącznika (CSR) klasy ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (IgH) u myszy i ludzi, eksony IgH μ stałego regionu (Cμ) są usuwane i zastępowane przez jeden z kilku zestawów dalszycheksonów ostałym regionie (CH, s) (np. Cγ, Cε i Cα), co powoduje przejście z produkcji IgM na produkcję innych klas Ig (np. IgG, IgE lub IgA). CSR występuje w obszarach przełączania (S), które są sekwencjami 1-10 kb położonymi 5' do każdego zestawu CHs 1. Enzym deaminaza cytydyny indukowana aktywacją (AID) inicjuje CSR poprzez aktywność deaminacji cytydyny.
IgE jest kluczowym mediatorem choroby alergicznej2, a lepsze zrozumienie, w jaki sposób IgE jest wytwarzane i regulowane, może otworzyć drzwi do nowych podejść terapeutycznych do choroby atopowej. U myszy i ludzi IgE jest najściślej regulowanym izotypem Ig. IgE jest zwykle wykrywana na poziomach tysiące razy niższych niż inne izotypy IgH3, ale może być bardzo podwyższona w stanach chorobowych4. Jednak CSR do IgE nie jest w pełni zrozumiały. Aktywacja in vitro limfocytów B za pomocą IL-4 w połączeniu z anty-CD40 lub LPS indukuje CSR zarówno do IgG1, jak i IgE5. Aktywowane limfocyty B wyrażają receptor IgE o niskim powinowactwie FcεRII/CD232,6, który wiąże rozpuszczalne IgE wydzielane w hodowli po CSR. Dlatego podczas analizy za pomocą cytometrii przepływowej komórki B z IgE związanymi z receptorem barwią się podobnie jak komórki B endogennie eksprymujące IgE7. Chociaż wiadomo, że mysie limfocyty B wyrażają receptor IgG o niskim powinowactwie FcγRIIB1 (CD32)8, z naszego doświadczenia wynika, że nie wydaje się, aby przeszkadzało to w pomiarze przejścia klasy na IgG1. Jednak podczas pomiaru przełączania IgE po aktywacji limfocytów B w hodowli, niespecyficzne IgE związane powierzchniowo mogą zaciemniać analizę. W przypadku typowych metod barwienia komórki bez ekspresji IgE barwią się dodatnio na obecność IgE.
Opisana tutaj jest strategia, która została wykorzystana do przeprowadzenia testów CSR i wykrycia prawdziwych limfocytów B z ekspresją IgE od myszy 9-11. Traktowanie aktywowanych limfocytów B trypsyną, powszechnym odczynnikiem laboratoryjnym do trawienia białka, usuwa zarówno cytofilowe, jak i związane z błoną powierzchniową IgE. Późniejsza przepuszczalność i barwienie cytoplazmatycznych IgE ujawnia zatem prawdziwe komórki wytwarzające IgE.

<table><tbody><tr><td>Przeciw myszym IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>klon R35-72</td></tr><tr><td>Szczur Przeciw myszom IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen 550083</td><td></td><td>klon A85-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Utrzymuj w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell 40 & mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell 70 i mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>anty-mysz/szczur CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>klon HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki MACS CD45R (B220)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna oczyszczająca MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Rozpuszcza się w wodzie lub 0,1%</td></tr><tr><td>roztworze formaliny BSA, neutralnie buforowany, 10%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA&#8226; 4 Na litr 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10 000 U Penicylina; 10 mg / ml Streptomycyna (100x)</td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysi IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>klon 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Płodowa surowica cielęca</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>do stymulacji komórek B Pożywka do stymulacji komórek B składa się z RPMI z płodową surowicą cielęcą (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamina,&nbsp; 1x Penicylina-Streptomycyna (penicylina: 100 U/ml, Streptomycyna: 100 &mikro; g/ml), beta-merkaptoetanol (7 &mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1 &mikro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii b z ekspresją ige

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B immunoglobuliny limfocytów ciężkiego łańcucha ciężkiego (IgH) rekombinacja przełącznika (CSR) to proces, w którym początkowo wyrażona IgM przełącza się na inne izotypy IgH, takie jak IgA, IgE i IgG. Pomiar IgH CSR in vitro jest kluczową metodą badania wielu procesów biologicznych, począwszy od rekombinacji i naprawy DNA, a skończywszy na aspektach immunologii molekularnej i komórkowej. Metody in vitro Test CSR obejmuje pomiar powierzchni Ig metodą cytometrii przepływowej na aktywowanych komórkach B. Podczas gdy pomiar podklas IgA i IgG jest prosty, pomiar IgE tą metodą jest problematyczny ze względu na rozpuszczalne wiązanie IgE z FcεRII/CD23 ulegające ekspresji na powierzchni aktywowanych limfocytów B. W tym miejscu opisujemy unikalną procedurę dokładnego pomiaru mysich komórek B wytwarzających IgE, które przeszły CSR w hodowli. Metoda opiera się na rozszczepianiu kompleksów IgE-CD23 za pośrednictwem trypsyny na powierzchni komórek, co pozwala na wykrycie komórek linii B wytwarzających IgE za pomocą barwienia cytoplazmatycznego. Procedura ta stanowi wygodne rozwiązanie do analizy cytometrii przepływowej CSR do IgE.

Procedurę tę z powodzeniem zastosowano do badania CSR do IgE w komórkach B myszy. Aby wykazać skuteczność pomiaru CSR, stymulowano komórki B śledziony myszy przeciwciałem anty-CD40 oraz IL-4, zgodnie z wcześniejszym opisem11. Po pięciu dniach stymulacji komórki zebrano, poddano obróbce zgodnie z powyższym protokołem i wybarwiono przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko IgM, IgG1, IgE oraz B220 (CD45R). Po bramkowaniu limfocytów blastycznych (Rysunek 1) wyraźna populacja komórek IgE+ nie może...

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B. Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odróżnienie prawdziwych komórek B eksprymujących IgE od komórek B, wyrażających inne izotypy IgE wydzielane przez IgE. Podczas testów in vitro zamiana klas wiąże się z białkami powierzchniowymi komórek B, co uniemożliwia pomiar zmiany klasy na IgE. Cel ten osiąga się poprzez usunięcie cząsteczek IgE związanych z receptorem przed analizą za pomocą trypsyny, która nie rozszczepia specyficznie białek powierzchniowych komórek, pozostawiając nienaruszone endogennie wytwarzane wewnątrzkomórkowe cząsteczki immunoglobuliny.Po drugie, białka wewnątrzkomórkowe są eksponowane poprzez wiązanie komórek B za pomocą forminy i przenikanie komórek metanolem. Następnie komórki są barwione fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami w celu ujawnienia wewnątrzkomórkowych immunoglobulin. Wyniki wskazują na wyraźną populację IgE-dodatnich komórek B.Jeśli trypsyna jest stosowana w oparciu o analizę cytometrii przepływowej, badania nad biologią IgE były ograniczone ze względu na trudności w wykryciu komórek wytwarzających IgE. Metoda ta zapewnia dostępne rozwiązanie, które laboratoria mogą łatwo zaadoptować, aby przyspieszyć nasze zrozumienie tej interesującej cz

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie prawdziwych komórek linii B myszy wyrażających IgE

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Poznaj metodę wykrywania prawdziwych komórek B produkujących IgE u myszy przy użyciu trypSyny i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia dokładną analizę rekombinacji klasy przełączania IgH in vitro.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Przeglądaj więcej filmów