Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie immunohistochemii w celu wizualizacji wybranych białek. W tym przykładzie zastosowano IBA1 dla mikrogleju oraz pan-neuronalny marker dla neuronów. Osiąga się to poprzez umieszczenie przygotowanych skrawków w roztworze blokującym w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu.

W drugim kroku przeciwciała rozpoznające dwa różne białka docelowe nanosi się na skrawki i inkubuje przez noc. Następnie skrawki są płukane i inkubowane z przeciwciałami wtórnymi w celu dołączenia znaczników fluorescencyjnych do przeciwciał pierwotnych. Wyniki podwójnego znakowania mogą wskazać barwienia mikrogleju w obrębie pól neuronów.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają początkowo trudności ze względu na dużą liczbę zmiennych, które należy dostosować. Technikę tę zaprezentuje dziś Hazel May, studentka pracująca w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, należy starannie utrwalić i pociąć mózgi gryzoni zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie ostrożnie przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia.

Po przygotowaniu do kontynuacji protokołu należy wyjąć preparaty z zamrażarki i rozmrozić je w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieścić preparaty w statywie i przemyć je trzykrotnie w PBS przez pięć minut w każdym cyklu. Od tego momentu nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków.

Osusz krawędzie szkiełek i za pomocą pisaka hydrofobowego wykonaj wokół krawędzi szkiełka barierę odpychającą ciecz, aby zapewnić równomierne pokrycie preparatu i zminimalizować efekty brzegowe. Następnie zablokuj sekcje, dodając na każde szkiełko 300 µl surowicy w PBS. Surowica powinna pochodzić z gatunku, w którym wytworzono przeciwciało wtórne.

W tym przypadku zastosowano surowicę osła. Należy upewnić się, że roztwór blokujący dociera do krawędzi szkiełka i całkowicie pokrywa tkankę. Aby uniknąć nierównomiernego barwienia, szkiełka należy umieścić w komorze wilgotnościowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, rozcieńczając przeciwciało anty-IBA1 w stosunku 1:5 000, a przeciwciało pan-neuronalne w stosunku 1:500 w mieszaninie 1% surowicy osła w PBS. Usunąć roztwór blokujący i dodać 300 µL roztworu przeciwciał zawierającego oba przeciwciała docelowe. Przygotować również trzy preparaty kontrolne.

Nanieś 300 µL rozcieńczenia samego przeciwciała IVA na jeden slajd, 300 µL rozcieńczenia samego przeciwciała pan-neuronalnego na drugi slajd oraz 300 µL 1% surowicy osła w PBS na trzeci slajd. Umieść wszystkie slajdy w komorze wilgotnościowej i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka przemyj slajdy trzykrotnie w PBS przez 5 minut każdy.

Przygotować mieszaninę fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, rozcieńczając oba przeciwciała w stosunku 1:250 w 1% surowicy osła w PBS. Nanieść 300 µL mieszaniny na każdy preparat, a następnie umieścić preparaty w ciemnej komorze wilgotnościowej na 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut każdy, a na koniec opłukać je w wodzie dwukrotnie destylowanej.

Podczas płukania należy chronić preparaty przed światłem. Do każdego szkiełka w PBS należy dodać kilka kropel wodnego medium montażowego, które pomaga zachować intensywność sygnału fluorescencyjnego. Następnie należy przykryć preparat szkiełkiem nakrywnym i usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby szczelnie przymocować medium montażowe do szkiełek i zapobiec wysychaniu skrawków.

Krawędzie należy pokryć lakierem do paznokci. Preparaty pozostawia się do wyschnięcia w pozycji poziomej przez jedną godzinę w pudełku chroniącym przed światłem, a następnie przechowuje w szczelnym, owiniętym folią pojemniku w temperaturze 4 °C. Po wyschnięciu lakieru preparaty przenosi się do pomieszczenia z mikroskopem w celu wykonania obrazowania.

Przygotuj pomieszczenie, wyłączając oświetlenie górne i blokując wszelkie inne zewnętrzne źródła światła. Włącz mikroskop, fluorescencyjne źródło światła oraz komputer do obrazowania. Następnie umieść preparat na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość.

Za pomocą dołączonego oprogramowania ustaw ekspozycję oddzielnie dla każdej długości fali. Unikaj nadmiernej ekspozycji preparatu na światło przez dłuższy czas, aby zapobiec fotoblaknięciu próbki. Następnie wykonaj obrazy w każdym kanale, nie przesuwając przekroju i nie korygując ostrości.

Połącz obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania i zapisz je do późniejszej analizy. Stosując opisany powyżej protokół barwienia, można łatwo uzyskać obrazy fluorescencyjne, takie jak te przedstawione tutaj: w kanale czerwonym wyraźnie widoczne są mikrogleje dodatnie pod kątem IBA1, a w kanale zielonym neurony dodatnie pod kątem pan-neuronalnym wyróżniają się na tle tła. Przedstawiono również obrazy kontrolne dla obu tych barwień przeciwciałami.

Podwójne znakowanie w ciemnym polu z użyciem IBA1 oraz pan-neuronalnego markera, przedstawione tutaj, ukazuje głównie ramifikującą się mikrogleję z długimi, cienkimi wypustkami neuronalnymi widocznymi we wszystkich warstwach kory. Wyniki barwienia podobne do tych pokazanych tutaj mogą wystąpić również w przypadku słabej jakości tkanki. Słaba jakość tkanki objawia się brakiem wyraźnie zdefiniowanych ciał komórkowych oraz fragmentacją wypustek mikroglejalnych i neuronalnych.

Barwienie mikrogleju jest niewyraźne, a barwienie neuronów całkowicie nieobecne, co sprawia, że obraz nałożony nie niesie istotnych informacji podczas próby zastosowania tej techniki. Ważne jest, aby równomiernie pokryć skrawki i pamiętać, by nie pozwolić im wyschnąć pomiędzy poszczególnymi etapami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat podstawowych technik immunohistochemicznych.