Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie immunohistochemii w celu wizualizacji białek będących przedmiotem zainteresowania. W tym przykładzie IBA jeden dla mikrogleju i pan neuronal dla neuronów. Osiąga się to poprzez umieszczenie najpierw przygotowanych odcinków w roztworze blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.

W drugim etapie przeciwciała, które rozpoznają dwa różne białka będące przedmiotem zainteresowania, umieszcza się na skrawkach na noc. Kolejne sekcje są myte i inkubowane w przeciwciałach drugorzędowych w celu dodania znaczników fluorescencyjnych do przeciwciał pierwszorzędowych. Wyniki podwójnego znakowania mogą wskazać na barwienia mikrogleju w polach neuronów.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą na początku walczyć, ponieważ jest tak wiele zmiennych, które należy dostosować. Dzisiaj tę technikę zademonstruje Hazel May, studentka w naszym laboratorium. Na początek ostrożnie przymocuj i pokrój mózgi gryzoni zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, a następnie ostrożnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne.

Gdy będziesz gotowy do kontynuowania protokołu, wyjmij szkiełka z zamrażarki i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieść szkiełka w stojaku i umyj je trzy razy w PBS przez pięć minut każde. Od tego momentu nie pozwól, aby sekcje wyschły.

Osusz krawędzie szkiełek i wykonaj odpychające płyny obramowanie wokół krawędzi szkiełka za pomocą pisaka, aby zapewnić równomierne pokrycie płynu i zmniejszyć efekty krawędzi. Następnie zablokuj sekcje, dodając 300 mikrolitrów surowicy w PBS do każdego szkiełka. Surowica powinna pochodzić od gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe.

W tym przypadku użyto surowicy osła. Upewnij się, że roztwór blokujący rozciąga się do krawędzi szkiełka i całkowicie zakrywa tkankę. Aby uniknąć nierównomiernego zabarwienia, umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej do inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Podczas inkubacji przygotuj przeciwciała pierwszorzędowe, rozcieńcz IBA jedno przeciwciało jeden do 5 000, a przeciwciało panneuronalne jeden do 500 w mieszaninie 1% surowicy osła. W PBS usuń roztwór blokujący i dodaj 300 mikrolitrów roztworu przeciwciała, który zawiera oba interesujące przeciwciała. Przygotuj również trzy szkiełka kontrolne.

Dodać 300 mikrolitrów IVA, jedno rozcieńczenie tylko do jednego szkiełka, 300 mikrolitrów samego rozcieńczenia przeciwciała neuronalnego na drugi szkiełko i 300 mikrolitrów 1% surowicy osła w PBS. Na trzecim szkiełku umieść wszystkie szkiełka w komorze wilgotnościowej i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego ranka. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut każde.

Przygotować mieszaninę fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając je od jednego do 250 w 1% surowicy osła w PBS. Dodaj 300 mikrolitrów mieszaniny na każde szkiełko i umieść szkiełka w lekko szczelnej komorze wilgotnościowej na 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut każde, a na koniec opłucz je w wodzie podwójnie destylowanej.

Podczas prania należy chronić szkiełka przed światłem. W PBS dodaj kilka kropli wodnego podłoża montażowego, które pomaga zachować intensywność sygnału fluorescencyjnego do każdego szkiełka. Następnie przykryj, wsuń szkiełko i usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby uszczelnić media montażowe na szkiełkach i zapobiec wysychaniu sekcji.

Pokryj krawędzie lakierem do paznokci. Szkiełka pozostawia się do wyschnięcia na płasko przez godzinę w lekko zabezpieczonym pudełku, a następnie przechowuje w lekkim, szczelnym pojemniku owiniętym w folię w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyschnięciu lakieru do paznokci przenieś szkiełka do pomieszczenia mikroskopu w celu zobrazowania.

Przygotuj pomieszczenie, wyłączając górne światła i blokując wszelkie inne zewnętrzne źródła światła. Włącz mikroskop, fluorescencyjne źródło światła i komputer do obrazowania. Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i ustaw na nim ostrość.

Korzystając z dołączonego oprogramowania, ustaw ekspozycję osobno dla każdej długości fali. Unikaj nadmiernego wystawiania chytrego światła na długie okresy czasu, aby zapobiec fotowybielaniu próbki. Następnie uzyskuj obrazy w każdym kanale bez przesuwania sekcji lub dostosowywania ostrości.

Połącz obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania i zapisz je do późniejszej analizy obrazu. Korzystając z opisanego właśnie protokołu barwienia, obrazy fluorescencyjne, takie jak te pokazane tutaj, można łatwo uzyskać w kanale czerwonym IBA, wyraźnie widać jeden dodatni mikroglej, aw kanale zielonym neurony neuronalne dodatnie wystają ponad tło. Pojawiają się obrazy kontrolne dla obu tych barwień przeciwciał.

Pokazane tutaj ciemne podwójne znakowanie za pomocą IBA one i markera neuronalnego pan pokazuje głównie rozgałęziony mikroglej z długimi, drobnymi projekcjami neuronalnymi widocznymi w warstwach kory mózgowej. Wyniki barwienia, takie jak te pokazane tutaj, są również możliwe, jeśli jakość tkanki jest niska. O złej jakości tkanek świadczy brak jasno zdefiniowanych ciał komórkowych oraz fragmentaryczne procesy mikroglejowe i neuronalne.

Występuje brak jasności barwienia mikrogleju i całkowity brak barwienia neuronów, co sprawia, że nałożony obraz nie ma znaczenia podczas próby tej techniki. Ważne jest, aby równomiernie pokryć sekcje i pamiętać, aby nie dopuścić do ich wyschnięcia między stopniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć wprowadzające techniki immunohistochemiczne.