Name: Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj technikę immunohistochemii do podwójnego barwienia mikrogleju i neuronów w tkance mózgowej szczura. Protokół obejmuje przygotowanie przecinów, blokowanie, inkubację z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi oraz wizualizację fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Panom Ryanowi Hartowi i Panu Arrizowi Lucasowi za ich nieocenione opinie na temat tej komunikacji. Praca ta była wspierana przez NIH NINDS R01 NS065052 i Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds.

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Arizony. Listę zalecanych materiałów i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.
1. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Perfuzja
	<ol>
		<li>Uśmierć gryzonia poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, IP), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) aż do całkowitego upuszczenia krwi (3-5 min) przy szybkości przepływu 8 ml/min. Szczegółowe instrukcje dotyczące perfuzji znajdują się w publikacji Gage et al 20129.</li>
		<li>Bezpośrednio po płukaniu PBS utrwal tkankę, przeprowadzając perfuzję 4% paraformaldehydem w PBS przez 15-20 min przy szybkości przepływu 8 ml/min.</li>
		<li>Wyjmij mózg i umieść w 4% paraformaldehydzie na 24 hr, a następnie w roztworach sacharozy o rosnącym stężeniu (kolejno 15%, 30%, 30%; przygotowanych w buforze tris-saline) w temperaturze 4 °C. Przenieś mózg do kolejnego roztworu sacharozy dopiero wtedy, gdy mózg opadnie na dno w każdym z roztworów. Uwaga: Zazwyczaj 5 dni w każdym roztworze jest wystarczającym czasem, aby tkanka opadła na dno.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie tkanki i kriosekcjonowanie
	<ol>
		<li>Umieść mózg w medium do zatapiania, takim jak związek O.C.T., i zanurz w izopentanie w temperaturze -35 °C. Pozostaw mózg do zamrożenia na minimum 10 min, a następnie przechowuj w -80 °C. Niedbałość w utrzymaniu temperatury może prowadzić do wystąpienia problemów; informacje dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji dyskusji.</li>
		<li>Wykonaj seryjne przekroje czołowe o grubości 20 µm w temperaturze -20 °C. Zbierz tkankę na szkiełka dodatnio naładowane. Przekroje mózgu można umieścić w kasetce na szkiełka owiniętej w folię, włożyć do woreczka strunowego i przechowywać długoterminowo w -80 °C. Ta metoda przechowywania tworzy podwójną barierę zapobiegającą dostępowi powietrza i powstawaniu szronu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obróbka tkanek
UWAGA: Przykładowy sprzęt i materiały niezbędne do barwienia przedstawiono na Rysunku 3. Dostępne są alternatywy, jednak obrazy te pomogą osobom rozpoczynającym pracę z barwieniem immunohistochemicznym w wizualizacji odpowiednich elementów przed ich zakupem.
<img alt="Ustawienie elektroforezy żelowej z talami do żelu, grzebieniami i narzędziami do eksperymentu rozdziału DNA." src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykładowe elementy wymagane do barwienia immunohistochemicznego. Czarna skrzynka pokazana na (A) stanowi idealną komorę wilgotnościową do immunofluorescencji, ponieważ preparaty są chronione przed światłem bez konieczności owijania skrzynki folią. Po wykonaniu skrawków preparaty mogą być przechowywane w skrzynce, takiej jak żółta skrzynka pokazana na (B). Szczelne owinięcie skrzynki folią i umieszczenie jej w woreczku strunowym przed włożeniem do zamrażarki pomaga chronić próbki tkanek przed wysuszeniem mrozowym. Przykład preparatów przedstawiono na (C), a różne kuwety do barwienia ukazano na (D) i (E). Szkiełka zakrywkowe mogą różnić się rozmiarem i grubością (F), jednak zakrywki o grubości 1.2 zapewniają dobre wyniki obrazowania w większości mikroskopów pionowych i konfokalnych. Ołówek, taki jak pokazany na (G), może być używany do opisywania preparatów. Należy unikać markerów permanentnych, ponieważ tusz może się rozmazać, co wpływa zarówno na barwienie, jak i na możliwość zidentyfikowania próbki. Mini pisak do cytologii (pap pen), taki jak pokazany na (H), umożliwia narysowanie na preparacie odpychającej obwódki.
<ol>
	<li>Przygotowanie szkiełek
	<ol>
		<li>Wyjąć szkiełka z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Opcjonalnie: Jeśli skrawki wcześniej oddzieliły się od szkiełek, umieścić rozmrożone szkiełka w piekarniku w temperaturze 60 °C na maksymalnie 4 h, aby zapobiec odklejaniu się skrawków tkanki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić szkiełka w statywie i odpowiadającej mu kuwecie.</li>
		<li>Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde, wymieniając roztwór pomiędzy przemyciami. Od tego kroku należy unikać pozostawiania skrawków bez cieczy przez dłuższy czas. Uwaga: Jeśli skrawki wyschną, wzrośnie tło barwienia i nie będzie można uzyskać wiarygodnych danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie tkanki
	<ol>
		<li>W szczelnej przed światłem kasecie do barwienia stworzyć „komorę wilgotnościową” z chusteczek beztkaninowych nasączonych wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Osuszyć krawędzie szkiełka chusteczką beztkaninową, użyć mini pap pen do utworzenia hydrofobowej obwódki na samym brzegu szkiełka, z dala od skrawków tkanki. Obwódka ta powinna zapewnić odpowiednią przestrzeń między meniskiem cieczy a krawędzią tkanki, aby napięcie powierzchniowe nie wpływało na barwienie. 
		UWAGA: Obwódkę z pap pen można nanieść przed krokiem 2.1.3, jeśli badane przeciwciała nie wymagają mikrofalowego odsłaniania antygenów. Jeśli pap pen został naniesiony przed przemywaniem w PBS, na tym etapie należy sprawdzić szczelność hydrofobowej obwódki. Użyć mini-pap pen, aby uzupełnić wszelkie luki w obwódce.</li>
		<li>Przy poziomo ułożonych szkiełkach zablokować nieswoiste wiązanie antygenów poprzez inkubację w 4% v/v serum w PBS (roztwór blokujący). Nanieść pipetą 300 µl roztworu blokującego na szkiełko i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Należy upewnić się, że roztwór blokujący sięga obwódki z pap pen na krawędzi szkiełka i całkowicie pokrywa tkankę, aby uniknąć nierównomiernego barwienia spowodowanego napięciem powierzchniowym w pobliżu tkanki.
		<ol>
			<li>Użyć serum z tego samego gatunku, w którym wytworzono przeciwciało wtórne. Uwaga: W tej procedurze przeciwciała wtórne są wytworzone w ośle, dlatego stosuje się serum osła. Jeśli używa się przeciwciał wtórnych z dwóch lub więcej różnych gatunków, należy dołączyć serum z każdego z tych gatunków.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nanieść pipetą przeciwciało pierwotne na szkiełka. Uwaga: Stężenia przeciwciał dla tego barwienia zostały zoptymalizowane na poziomie odpowiednio 1:5 000 dla Iba1 i 1:500 dla Pan-neuronal. Stwierdzono, że stężenia te zapewniają wyraźne barwienie przy braku tła.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć roztwór blokujący do 1% serum w PBS i dodać przeciwciała pierwotne. Nanieść pipetą 300 µl roztworu przeciwciała pierwotnego w 1% serum na szkiełko. Ponownie upewnić się, że ciecz sięga krawędzi obwódki z pap pen. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Przygotować trzy szkiełka kontrolne: jedno bez przeciwciał Iba1 i Pan-neuronal, jedno z Iba1 bez przeciwciała Pan-neuronal oraz jedno z przeciwciałem Pan-neuronal bez Iba1. Barwić te szkiełka w tej samej serii, używając tych samych roztworów, jednak z pominięciem przeciwciał pierwotnych, aby przetestować nieswoiste wiązanie przeciwciał wtórnych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Następnego dnia przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde, wymieniając roztwór pomiędzy przemyciami.</li>
		<li>Przeciwciała fluorescencyjne są światłoczułe, dlatego od tego kroku należy minimalizować ekspozycję na światło, upewniając się, że pojemniki do przemywania są owinięte folią, a kasety do hybrydyzacji są czarne lub inkubowane w ciemności. Nanieść pipetą odpowiednie przeciwciała wtórne na wszystkie szkiełka i inkubować przez 60 min w temperaturze pokojowej w stężeniu 1:250 w roztworze blokującym (patrz krok 2.2.3) w szczelnej przed światłem „komorze wilgotnościowej” (patrz krok 2.2.1).
		<ol>
			<li>Użyć przeciwciał wtórnych o różnych długościach fal. W tym przypadku dla przeciwciała pierwotnego rabbit anti-Iba1 zastosować donkey anti-rabbit 594 jako odpowiednie przeciwciało wtórne. Dla przeciwciała pierwotnego mouse anti-Pan-neuronal zastosować donkey anti-mouse 488 jako odpowiednie przeciwciało wtórne. Alternatywnie można użyć anti-rabbit 488 i anti-mouse 594.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde.</li>
		<li>Opcjonalnie: wykonać barwienie jąder komórkowych.
		<ol>
			<li>Umieścić w Hoechst (lub innym barwniku jądrowym) o stężeniu 0,03 µg/ml w podwójnie destylowanej H2O dokładnie przez 60 s.</li>
			<li>Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć w ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykrywanie szkiełek
	<ol>
		<li>Przykryć szkiełka szkiełkami cover-slip, używając wodnego medium montażowego, takiego jak Fluoromount-G lub ProlongGold. Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem. 
		Uwaga: Można stosować inne środki montażowe, jednak niektórzy zauważyli silne przenikanie barwników w ciągu kilku dni od przykrycia szkiełek.</li>
		<li>Użyć bezbarwnego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie, zapobiegając wysychaniu skrawków na skutek odparowania. Pozostawić lakier do wyschnięcia w pojemniku chroniącym przed światłem, podczas gdy szkiełka pozostają w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w pojemniku chroniącym przed światłem, owiniętym folią, w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie barwionej tkanki
<ol>
	<li>Mikroskopia
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem mikroskopii, która powinna odbywać się w zaciemnionym pomieszczeniu, należy pozostawić lakier do paznokci do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę.</li>
		<li>Należy wykonać fotomikrografie przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub badawczego z fluorescencyjnym źródłem światła i dołączoną kamerą cyfrową. Przy użyciu dołączonego oprogramowania należy osobno ustawić ekspozycję dla każdej długości fali – 405, 488 i 594. Uwaga: szczegółowe instrukcje obrazowania powinny być dostępne online u producenta mikroskopu.</li>
		<li>Należy wykonać fotomikrografie w każdym kanale bez przesuwania skrawków ani regulacji ostrości. Obrazy należy rejestrować w kolorze lub alternatywnie w skali szarości, a następnie przekonwertować na kolor. 
		Uwaga: obrazy kolorowe lub w skali szarości z każdego kanału można zestawić podczas postprocesingu.</li>
		<li>Należy dopilnować, aby skrawki tkanki nie były wystawione na działanie światła otoczenia ani światła mikroskopowego przez dłuższy czas, ponieważ dojdzie do fotoblaknięcia skrawków. Aby tego uniknąć, należy zwiększyć czas ekspozycji zamiast zwiększać natężenie światła/lasera.</li>
		<li>Nie należy wyłączać fluorescencyjnego źródła światła w ciągu 30 min od jego włączenia. 
		Uwaga: Szybkie włączanie i wyłączanie źródła może skrócić żywotność żarówki fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnym celem niniejszej publikacji było zapoznanie czytelnika z procedurami immunohistochemicznymi. W tym celu wykorzystano przykład podwójnego znakowania antygenami Iba1 oraz pan-neuronalnymi w celu obserwacji mikrogleju i neuronów w preparatach mózgu szczura, które zostały perfundowane paraformaldehydem, krioprotektowane sacharozą i poddane kriosekcjonowaniu.
Technikę tę można dostosować do wielu różnych celów. Dzięki niewielkim modyfikacjom protokołu można w sposób immunohistochemiczny zwi...

Immunohistochemia jest procesem wykrywania antygenów (t.j. białek) w skrawkach tkanek przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych, które wiążą się specyficznie z badanymi antygenami. Immunohistochemia została zapoczątkowana przez J.R. Marracka w 1934 roku, kiedy stwierdził on, że przeciwciała mogą lokalizować antygeny z dużą specyficznością1. Począwszy od 1942 roku, opublikowano niektóre z pierwszych badań in vitro z wykorzystaniem przeciwciał fluorescencyjnych do wizualizacji immunohistochemicznej2,3, po których opublikowano pierwsze badanie histochemiczne in vivo4. W latach 60. XX wieku, trzy dekady po wprowadzeniu metod immunohistochemicznych, przeciwciała sprzężone z enzymami zaczęto stosować jako odczynniki wtórne. Metody te zostały opracowane jednocześnie i niezależnie we Francji i w USA5,6. Obecnie szeroki wachlarz przeciwciał zapewnia nieograniczone możliwości prowadzenia badań immunohistochemicznych7.
Ogólnym celem niniejszej korespondencji jest przedstawienie krótkiego wprowadzenia do barwienia immunohistochemicznego; nie ma ona na celu bycia kompleksowym i wyczerpującym przeglądem tej techniki. W opisanym protokole zaprezentowano techniki immunohistochemiczne dla dwóch antygenów (markerów mikrogleju i neuronów) do barwienia preparatów mózgu szczura, które zostały poddane perfuzji paraformaldehydem, krioprotekcji sacharozą i kriosekcjonowaniu. Barwienie immunohistochemiczne rozpoczyna się od blokowania nieswoistego wiązania antygenów w celu zmniejszenia tła. Następnie inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym umożliwia wiązanie ze specyficznym antygenem w tkance. Po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego podaje się kolejne przeciwciało, zwane przeciwciałem drugorzędowym, aby połączyć przeciwciało pierwszorzędowe z koniugowanym sygnałem wizualizacji8. Przeciwciało drugorzędowe jest skierowane przeciwko domenie immunoglobulin G (IgG) specyficznej dla gatunku, w którym wytworzono przeciwciało pierwszorzędowe. Przeciwciało drugorzędowe wzmacnia sygnał przeciwciała pierwszorzędowego, ponieważ regiony Fab przeciwciała drugorzędowego wiążą się z wieloma miejscami w domenie IgG przeciwciała pierwszorzędowego. Wizualizację umożliwiają enzymy lub cząsteczki fluorescencyjne skoniugowane z regionami Fc przeciwciała drugorzędowego. Na przykład królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko Iba1 jest cząsteczką króliczego IgG specyficzną dla Iba1. Po zastosowaniu osiołkowego przeciwciała przeciwko króliczemu IgG jako przeciwciała drugorzędowego, rozpozna ono i zwiąże się z wieloma regionami króliczego IgG przeciwko Iba1 (patrz Rycina 1). Przeciwciało osiołkowe można wizualizować różnymi metodami. Niniejsza korespondencja koncentruje się na detekcji fluoroforu skoniugowanego z przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe, w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W immunohistochemii fluorescencyjnej do wizualizacji wszystkich jąder komórkowych można zastosować barwnik jądrowy, taki jak Hoechst lub DAPI.
<img alt="Schemat metod immunofluorescencji i barwienia DAB; wyjaśnienie oddziaływań antygen-przeciwciało." src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie technik bezpośredniego i pośredniego znakowania przeciwciałami. Przeciwciała wiążą się z badanym antygenem i mogą być wzmocnione przez przeciwciała wtórne wytworzone przeciwko gatunkowi przeciwciał pierwszorzędowych. Technikę tę można przeprowadzić z wykorzystaniem kompleksu awidyna-biotyna (ABC) w celu amplifikacji i DAB do wizualizacji (A) lub bezpośrednio sprzężonego fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (B). Alternatywnie, przeciwciała pierwszorzędowe mogą być bezpośrednio sprzężone z wieloma różnymi znacznikami, w tym z biotyną lub fluorophorem (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Alternatywną metodą wizualizacji barwienia immunohistochemicznego jest zastosowanie tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB; patrz Rysunki 1 i 2). Różni się ona od fluorescencji wykorzystaniem biotynilowanego przeciwciała wtórnego lub przeciwciała sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), co dostarcza enzymu przekształcającego DAB w osad widoczny w mikroskopii w świetle przechodzącym. W przypadkach, gdy przedmiotem zainteresowania jest pojedynczy antygen lub wymagane jest trwałe barwienie, DAB może być bardziej odpowiedni niż barwienie fluorescencyjne. Jednak barwienie DAB nie nadaje się do różnicowania wielu markerów, zwłaszcza jeśli analizowane są dwa antygeny jądrowe. Informacje na temat materiałów do DAB i modyfikacji protokołu znajdują się w Tabeli 1. Alternatywnie, do wizualizacji przeciwciała wtórnego sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (AP) można użyć chlorku nitro błękitu tetrazoliowego/5-bromo-4-chloro-3-indolylofosforanu (NBT/BCIP).
<img alt="Mikroskopowe obrazy komórek neuronalnych; po lewej: komórki glejowe, po prawej: układ jąder neuronalnych." src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy pojedynczo znakowanych przekrojów tkanki mózgu szczura z zastosowaniem DAB wzmocnionego niklem. Przekroje mózgu szczura znakowane DAB wzmocnionym niklem dla Iba1 (A) oraz Pan-neuronal (B) umożliwiają długotrwałą analizę samych mikroglejów lub neuronów. Pasek skali 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Należy wziąć pod uwagę szacowaną obfitość badanego antygenu w analizowanej tkance. Metody pośrednie (opisane powyżej) są przydatne w przypadku celów o niskiej obfitości. Gdy badany antygen występuje w dużej ilości, można zastosować metody bezpośrednie. Metody bezpośrednie wykorzystują przeciwciało pierwszorzędowe, które jest bezpośrednio sprzężone z sygnałem wizualizacyjnym, dzięki czemu nie jest wymagane przeciwciało drugorzędowe. Metoda ta upraszcza proces barwienia, ale eliminuje wzmocnienie sygnału uzyskiwane w metodach pośrednich. Stosowanie bezpośrednio sprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego eliminuje również reakcje krzyżowe przeciwciał drugorzędowych podczas podwójnego znakowania.
Niniejszy komunikat szczegółowo opisuje protokół podwójnego znakowania z użyciem Iba1 oraz markera pan-neuronalnego (szczegóły w Tabeli 1). Iba1 barwi mikroglej w wielu stanach aktywacji, w tym rozgałęziony, nadmiernie rozgałęziony, aktywowany, ameboidalny i pręcikowy. Marker pan-neuronalny barwi aksony, dendryty i soma neuronów. Ponieważ Iba1 barwi większość komórek mikrogleju, a marker pan-neuronalny celuje w neurony, ta kombinacja barwień jest użyteczna w uzyskaniu szerokiego zrozumienia interakcji między mikroglejem a neuronami.
Podsumowując, barwienie immunohistochemiczne opiera się na starannym doborze przeciwciał. Wraz ze wzrostem specyfiki pytania badawczego może pojawić się potrzeba zastosowania przeciwciał skierowanych przeciwko innym antygenom. Aby skierować badanie na konkretny stan aktywacji mikrogleju, można zdecydować się na użycie przeciwciał CD45 lub CD68 zamiast Iba1. Ponadto w pracy z myszami pożądane wyniki może zapewnić marker F4/80. Podobnie, elementy neuronalne można specyficznie targetować za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko jądru, synapsie (pre- lub postsynaptycznej), aksonowi oraz stożkowi wzrostu. Dodatkowo istnieją inne markery pozwalające zróżnicować wiek neuronu (Double-cortin, NeuN) oraz regenerację neuronalną (GAP-43).

<table><tbody><tr><td>Szkiełka szklane Fisherbrand Superfrost Plus&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Używany do montażu tkanek (1.2.2)</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Używany do suszenia tkanek (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Używany w kroku 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Naczynie do barwienia szkiełek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Używany do wszystkich prań podczas barwienia (2.2), a także do kroku Hoechst (2.2.8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Służy do suszenia szkiełek (2.2)</td></tr><tr><td>Czarne pudełko do barwienia</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Służy do blokowania i barwienia etapów (2.2)</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Służy do inkubacji blokowej i przeciwciał (2.2)</td></tr><tr><td>Mysz &alfa;-pan-neuronalna</td><td>milipora</td><td>MAB2300</td><td>Używany do przeciwciał pierwszorzędowych (2.2.4)</td></tr><tr><td>Królik &alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe (2.2.4)</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-królik 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Używany do przeciwciał drugorzędowych (2.2.6)</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-mysz 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Używany jako przeciwciało drugorzędowe (2.2.6)</td></tr><tr><td>Folia cateringowa</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany w krokach 1.2.2 i 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)</td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci&nbsp;</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 i LSM 710 (skaning laserowy, konfokalny)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany do obrazowania (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Używany do obrazowania (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr><td>Zestaw peroksydazy DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr><td>Biotynylowane konie i alfa;-królik IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr>Biotynylowane <td>laboratoria wektorowe</td> <td>konia i alfa-myszy IgG</td><td>BA-2001</td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr><td>30% nadtlenek wodoru</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>Dla protokołu DAB</td></tr><tr><td>Stojaki na suwaki Wheaton i naczynia do barwienia</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>Do protokołu DAB</td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna Masterflex i rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Używany do perfuzji (1.1.1 i 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT związek (przypadek 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Używany do zamrażania tkanek (1.2.1)</td></tr><tr><td>Termometr (-50 do 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Używany do zamrażania tkanek (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Używany do cięcia tkanek (1.2.2)</td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia, plastikowe z 2 pokrywkami</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>Do rerivaly antygenu</td></tr><tr><td>20-miejscowy stojak do barwienia, prowadnice poziome</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>Do rerivaly antygenu</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do rerivaly antygenu</td></tr></tbody></table>

podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania obecności, lokalizacji i względnej obfitości antygenów in situ. Ten protokół na poziomie wprowadzającym opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do zakończenia immunohistochemicznego barwienia tkanki mózgowej gryzonia, na przykładzie markerów mikrogleju i elementów neuronalnych. W szczególności artykuł ten jest protokołem krok po kroku do fluorescencyjnej wizualizacji mikrogleju i neuronów za pomocą immunohistochemii odpowiednio dla Iba1 i Pan-neuronal. Podwójne znakowanie fluorescencyjne jest szczególnie przydatne do lokalizacji wielu białek w tej samej próbce, dając możliwość dokładnej obserwacji interakcji między typami komórek, receptorami, ligandami i/lub macierzą zewnątrzkomórkową w stosunku do siebie, a także kolokalizacji białek w pojedynczej komórce. W przeciwieństwie do innych technik wizualizacji, intensywność barwienia immunohistochemicznego fluorescencji może zmniejszyć się w ciągu kilku tygodni lub miesięcy po barwieniu, chyba że zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności. Pomimo tego ograniczenia, w wielu zastosowaniach podwójne znakowanie fluorescencyjne jest preferowane w stosunku do alternatyw, takich jak czterochlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) lub fosfataza alkaliczna (AP), ponieważ fluorescencja jest bardziej efektywna w czasie i pozwala na bardziej precyzyjne rozróżnienie między dwoma lub więcej markerami. Dyskusja zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i porady, które pomogą Ci osiągnąć sukces.

Niniejszy protokół barwienia pozwala na uzyskanie przekrojów tkanki mózgu szczura, w których mikroglej jest znakowany fluorescencyjnie w kanale 594 (czerwony), a neurony w kanale 488 (zielony; patrz Rycina 4). W przypadku zastosowania barwienia jąder komórkowych, będzie ono widoczne w kanale 405 (niebieski). Obrazy można rejestrować w różnych kanałach, a następnie nakładać je na siebie w celu bezpośredniego porównania trzech kanałów lub dowolnych dwóch z nich. Wiele pakietów oprogramowania do akwizycji c...

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie immunohistochemii w celu wizualizacji wybranych białek. W tym przykładzie zastosowano IBA1 dla mikrogleju oraz pan-neuronalny marker dla neuronów. Osiąga się to poprzez umieszczenie przygotowanych skrawków w roztworze blokującym w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu.W drugim kroku przeciwciała rozpoznające dwa różne białka docelowe nanosi się na skrawki i inkubuje przez noc. Następnie skrawki są płukane i inkubowane z przeciwciałami wtórnymi w celu dołączenia znaczników fluorescencyjnych do przeciwciał pierwotnych. Wyniki podwójnego znakowania mogą wskazać barwienia mikrogleju w obrębie pól neuronów.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają początkowo trudności ze względu na dużą liczbę zmiennych, które należy dostosować. Technikę tę zaprezentuje dziś Hazel May, studentka pracująca w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, należy starannie utrwalić i pociąć mózgi gryzoni zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie ostrożnie przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia.Po przygotowaniu do kontynuacji protokołu należy wyjąć preparaty z zamrażarki i rozmrozić je w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieścić preparaty w statywie i przemyć je trzykrotnie w PBS przez pięć minut w każdym cyklu. Od tego momentu nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków.Osusz krawędzie szkiełek i za pomocą pisaka hydrofobowego wykonaj wokół krawędzi szkiełka barierę odpychającą ciecz, aby zapewnić równomierne pokrycie preparatu i zminimalizować efekty brzegowe. Następnie zablokuj sekcje, dodając na każde szkiełko 300 µl surowicy w PBS. Surowica powinna pochodzić z gatunku, w którym wytworzono przeciwciało wtórne.W tym przypadku zastosowano surowicę osła. Należy upewnić się, że roztwór blokujący dociera do krawędzi szkiełka i całkowicie pokrywa tkankę. Aby uniknąć nierównomiernego barwienia, szkiełka należy umieścić w komorze wilgotnościowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Podczas inkubacji przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, rozcieńczając przeciwciało anty-IBA1 w stosunku 1:5 000, a przeciwciało pan-neuronalne w stosunku 1:500 w mieszaninie 1% surowicy osła w PBS. Usunąć roztwór blokujący i dodać 300 µL roztworu przeciwciał zawierającego oba przeciwciała docelowe. Przygotować również trzy preparaty kontrolne.Nanieś 300 µL rozcieńczenia samego przeciwciała IVA na jeden slajd, 300 µL rozcieńczenia samego przeciwciała pan-neuronalnego na drugi slajd oraz 300 µL 1% surowicy osła w PBS na trzeci slajd. Umieść wszystkie slajdy w komorze wilgotnościowej i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka przemyj slajdy trzykrotnie w PBS przez 5 minut każdy.Przygotować mieszaninę fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, rozcieńczając oba przeciwciała w stosunku 1:250 w 1% surowicy osła w PBS. Nanieść 300 µL mieszaniny na każdy preparat, a następnie umieścić preparaty w ciemnej komorze wilgotnościowej na 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut każdy, a na koniec opłukać je w wodzie dwukrotnie destylowanej.Podczas płukania należy chronić preparaty przed światłem. Do każdego szkiełka w PBS należy dodać kilka kropel wodnego medium montażowego, które pomaga zachować intensywność sygnału fluorescencyjnego. Następnie należy przykryć preparat szkiełkiem nakrywnym i usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby szczelnie przymocować medium montażowe do szkiełek i zapobiec wysychaniu skrawków.Krawędzie należy pokryć lakierem do paznokci. Preparaty pozostawia się do wyschnięcia w pozycji poziomej przez jedną godzinę w pudełku chroniącym przed światłem, a następnie przechowuje w szczelnym, owiniętym folią pojemniku w temperaturze 4 °C. Po wyschnięciu lakieru preparaty przenosi się do pomieszczenia z mikroskopem w celu wykonania obrazowania.Przygotuj pomieszczenie, wyłączając oświetlenie górne i blokując wszelkie inne zewnętrzne źródła światła. Włącz mikroskop, fluorescencyjne źródło światła oraz komputer do obrazowania. Następnie umieść preparat na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość.Za pomocą dołączonego oprogramowania ustaw ekspozycję oddzielnie dla każdej długości fali. Unikaj nadmiernej ekspozycji preparatu na światło przez dłuższy czas, aby zapobiec fotoblaknięciu próbki. Następnie wykonaj obrazy w każdym kanale, nie przesuwając przekroju i nie korygując ostrości.Połącz obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania i zapisz je do późniejszej analizy. Stosując opisany powyżej protokół barwienia, można łatwo uzyskać obrazy fluorescencyjne, takie jak te przedstawione tutaj: w kanale czerwonym wyraźnie widoczne są mikrogleje dodatnie pod kątem IBA1, a w kanale zielonym neurony dodatnie pod kątem pan-neuronalnym wyróżniają się na tle tła. Przedstawiono również obrazy kontrolne dla obu tych barwień przeciwciałami.Podwójne znakowanie w ciemnym polu z użyciem IBA1 oraz pan-neuronalnego markera, przedstawione tutaj, ukazuje głównie ramifikującą się mikrogleję z długimi, cienkimi wypustkami neuronalnymi widocznymi we wszystkich warstwach kory. Wyniki barwienia podobne do tych pokazanych tutaj mogą wystąpić również w przypadku słabej jakości tkanki. Słaba jakość tkanki objawia się brakiem wyraźnie zdefiniowanych ciał komórkowych oraz fragmentacją wypustek mikroglejalnych i neuronalnych.Barwienie mikrogleju jest niewyraźne, a barwienie neuronów całkowicie nieobecne, co sprawia, że obraz nałożony nie niesie istotnych informacji podczas próby zastosowania tej techniki. Ważne jest, aby równomiernie pokryć skrawki i pamiętać, by nie pozwolić im wyschnąć pomiędzy poszczególnymi etapami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat podstawowych technik immunohistochemicznych.

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podręcznik do immunohistochemii na kriosekcjonowanych tkankach mózgu szczura: przykładowe barwienie na mikrogleję i neurony

Ten film pokazuje proces wizualizacji interneuronu wypełnionego biocytyną w sekcji hipokampa szczura, podkreślając jego tożsamość neurochemiczną dzięki zastosowaniu specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunologiczne interneuronów w odcinku hipokampa szczura

Ten film przedstawia procedurę barwienia immunologicznego utrwalonego wycinka tkanki mózgowej myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych astrocytów przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz przechwytywania obrazów barwionych astrocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

Źródło: Evilsizor, M. N., et. al., Elementarz immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: Przykład barwienia mikrogleju i neuronów. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje krok po kroku procedurę barwienia immunohistochemicznego na kriosekcji tkanki mózgowej szczura w celu wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia mikrogleju i neuronów.

Barwienie immunohistochemiczne kriosekcji tkanek koronalnych szczurów dla mikrogleju i neuronów

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Tutaj prezentujemy hydrofobową metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na oglądanie docelowych cząsteczek jako części nienaruszonych struktur mózgu. Technika ta została teraz zwalidowana dla kontroli F344/N i transgenicznych szczurów HIV-1 obu płci.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Modele in vivo szczurów są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów patologicznych i celów terapeutycznych dla udaru niedokrwiennego. W niniejszej pracy opisano wykonywanie barwienia immunofluorescencyjnego w wycinkach mózgu z zawałem po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów.

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj technikę immunohistochemii do podwójnego barwienia mikrogleju i neuronów w tkance mózgowej szczura. Protokół obejmuje przygotowanie przecinów, blokowanie, inkubację z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi oraz wizualizację fluorescencyjną.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Przeglądaj więcej filmów