Name: Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego wątroby myszy do pomiaru prędkości przepływu krwi w naczyniach wątrobowych. Technika ta umożliwia wizualizację erytrocytów w sinusoidach wątrobowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez INSERM, Uniwersytet Aix-Marsylia i nagroda za rozwój kariery od HFSPO uzyskana przez CL Forestier.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami, które zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Aix-Marseille we Francji. Samice myszy C57Bl/6 w wieku 8-10 tygodni zostały pozyskane komercyjnie i traktowane zgodnie z zasadami Décret No 8 87–848, 19 października 1987 r., Paryż. Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem pasożytów L. donovani LD1S zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego wynikającymi z ustawodawstwa francuskiego i Unii Europejskiej.
1. Zakażenie myszy pasożytami promastigoty L. donovani

<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli in vitro pasożytów L. donovani promastigote, LD1S (MHOM/SD/62/1S-CL2D).
	<ol>
		<li>Użyj medium M199. Suplement pożywki M199 z 10% płodową surowicą cielęcą (inaktywowaną termicznie w temperaturze 56 °C przez 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO3, 1 mM glutaminą, mieszanką witamin RPMI 16040, 10 mM kwasu foliowego, 100 mM adenozyny, 7,6 mM heminy, 50 U/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla pasożytów LD1S w 10 ml kompletnej pożywki M199 w temperaturze 26 °C w wentylowanej kolbie o długości 25cm2.</li>
	<li>Stosując kolejne etapy wirowania różnicowego, przygotuj populację pasożytów promastigot, które są wzbogacone w formy metacykliczne.
	<ol>
		<li>Zbierz kulturę pasożytów w środkowej fazie logarytmicznej. Możesz liczyć na hemocytomer. Zawiesić 5 x 105 pasożytów/ml w 10 ml kompletnej pożywki M199. Hoduj kulturę pasożytów w warunkach beztlenowych, aż osiągną późną fazę stacjonarną (w ciągu około 5-6 dni).</li>
		<li>Wirować kulturę LD1S w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 26 °C w celu osadzenia pasożytów niemetacyklicznych, odzyskać supernatant i ponownie odwirować go w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 26 °C przez 10 minut 
		Uwaga: Ta ostatnia osadka jest wysoce wzbogacona w metacykliczne pasożyty promastygoty.</li>
		<li>Zawiesić osad w 100 μl PBS. Usunąć małą porcję do utrwalenia za pomocą 25% aldehydu glutarowego 1/100 v:v i policzyć pasożyty za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć wzbogaconą populację pasożytów metacyklicznych do 1 x 107/100 μl w PBS. Zawiesinę pasożyta należy wstrzyknąć do żyły ogonowej znieczulonej myszy (patrz poniżej) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G. W przypadku zwierząt kontrolnych wstrzyknąć 100 μl PBS do żyły ogonowej.</li>
</ol>
2. Zabiegi chirurgiczne
<ol>
	<li>Zdezynfekuj przestrzeń roboczą biobójczym środkiem dezynfekującym w sprayu oraz wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór znieczulający, w zależności od masy ciała zwierzęcia, zawierający 125 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny rozcieńczonej w PBS.</li>
	<li>Zważyć mysz i dootrzewnowo wstrzyknąć odpowiednią dawkę środka znieczulającego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G.</li>
	<li>Utrzymuj mysz w cieple i sprawdź, czy mysz jest całkowicie znieczulona, ściskając podnóżek przed kontynuowaniem. Ponownie wstrzykiwać połowę dawki roztworu znieczulającego myszy co 60 minut.</li>
	<li>Ogol brzuch myszy i wyczyść go za pomocą Vetedine. Wykonaj małe nacięcie w skórze i mięśniach pod klatką piersiową po lewej stronie brzucha.</li>
	<li>Połóż kawałek wilgotnej gazy na brzuchu tuż pod otwartym obszarem. Odsłoń wątrobę i umieść ją na gazie. Połóż kolejny kawałek wilgotnej gazy nad wątrobą.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm i grubościod 2 do 150 μm, połączone cyjanoakrylanem z metalową ramą, na wątrobie w celu wizualizacji pod mikroskopem.</li>
	<li>Chroń oczy myszy wilgotną gazą.</li>
	<li>Po sesji obrazowania należy poddać znieczulone zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
3. Obrazowanie architektury wątroby pod mikroskopem przyżyciowym
<ol>
	<li>Przeprowadzić eksperymenty mikroskopii przyżyciowej na odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w komorę sterowaną termostatycznie, apochromatyczny obiektyw zanurzeniowy 63X z olejem glicerolowym (NA 1,4), lasery argonowe (488 nm) i HeNe (543 nm, 633 nm) oraz niebieską diodę (405 nm).</li>
	<li>Umieść mysz na stoliku mikroskopu z szkiełkiem nakrywkowym zakrywającym wątrobę twarzą w dół na obiektywie. Ustaw temperaturę komory na 29 °C. Dostosuj ostrość za pomocą autofluorescencji wątroby, aby umożliwić wizualizację sinusoid.</li>
	<li>Aby uwidocznić układ naczyniowy, przygotuj roztwór 500 μg BSA-Alexa 647 rozcieńczony w 100 μl PBS dla każdej myszy. Roztwór ten należy wstrzyknąć dożylnie do żyły ogonowej znieczulonej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G.</li>
	<li>Aby uwidocznić jądra komórek wątroby, należy przygotować roztwór Hoechst 33342 w PBS. Roztwór ten wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 8 mg/kg myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G.</li>
	<li>Użyj normalnego trybu sekwencyjnego, obiektywu zanurzeniowego 63X i skanera z częstotliwością 400 Hz, aby zobrazować jądra komórek wątroby i układ naczyniowy wątroby. Włącz niebieską diodę 405 nm do wzbudzenia Hoechst i laser 633 nm do wzbudzenia BSA-Alexa 647. Włącz laser Argon 488 nm i zdefiniuj duże pasmo akwizycji, aby uwidocznić autofluorescencję wątroby.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wątroby pod mikroskopem przyżyciowym do pomiaru prędkości przepływu krwi
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie LAS mikroskopu (przeglądarka LAS-AF, wersja 3.1.0, kompilacja 8587). Wybierz tryb skanera rezonansowego podczas otwierania oprogramowania mikroskopu.</li>
	<li>Kliknij zakładkę konfiguracji, aby ustawić sprzęt. Kliknij na laser i wybierz laser HeNe 633. Kliknij ustawienia i wybierz rozdzielczość 12-bitową.</li>
	<li>Kliknij menu pobierania. W oknie ustawień ścieżki wiązki wybierz obiektyw 63X i ustaw moc lasera 633 na 100%. Aktywuj parametry wzmocnienia sygnału i wyłączenia, wybierając Alexa-633 z menu rozwijanego PM1-3.</li>
	<li>W zakładce akwizycji wybierz tryb akwizycji 'xyt'. Ustaw szerokość formatu na 1 024 x 1 024. Wybierz prędkość przy 8 000 Hz. Wybierz otwór otworkowy 3 jednostek Airy. Wybierz współczynnik powiększenia równy 3. Nie wybieraj trybu dwukierunkowego.</li>
</ol>
5. Analiza ilościowa prędkości RBC przy użyciu obrazów xyt (Metoda 1)
<ol>
	<li>Kliknij ikonę "Na żywo", aby wyświetlić przepływ krwi w trybie na żywo. Wybierz obszar zainteresowania i wybierz konkretne naczynie krwionośne do analizy. Ustaw interesujące Cię naczynie w pozycji poziomej, regulując współrzędne obrotu "X", "Y" i pola skanowania na panelu sterowania USB.</li>
	<li>Zatrzymaj tryb "Na żywo" po ustawieniu interesującego Cię statku. Zmień szerokość zestawu formatu na 1,024 x 256 w oknie ustawień trybu akwizycji, średnia linii = 1, średnia klatek = 1, wybierz "stosy" 150. Kliknij "start", aby pobrać obrazy.</li>
	<li>W celu ilościowej analizy prędkości RBC przy użyciu obrazów "xyt" otwórz oprogramowanie ImageJ. Wybierz zakładkę "Plik" w ImageJ, kliknij "Otwórz", a następnie wybierz interesujący Cię plik.</li>
	<li>Przejdź do menu "wtyczka" w ImageJ, wybierz opcje importu LOCI i Bio-formatów. W tym oknie wybierz parametry wyświetlania stosu jako "hyperstack". W opcji stack order wybierz opcję: "xyzct". Uwaga: Spowoduje to otwarcie okna ze wszystkimi seriami przejęć.</li>
	<li>Kliknij "Wtyczki" w menu ImageJ i wybierz opcję MTrackJ. Kliknij ikonę "dodaj" w małym oknie i kliknij RBC, aby śledzić. Kliknij ten sam RBC w każdej następnej klatce i kliknij ikonę "zmierz", aby zmierzyć prędkość. 
	Uwaga: Wygenerowany plik można zapisać w formacie .exl.</li>
	<li>Śledź co najmniej pięć erytrocytów na statek i analizuj co najmniej trzy pojedyncze statki tej samej wielkości.</li>
</ol>
6. Analiza ilościowa prędkości RBC przy użyciu obrazów linii xt (metoda 2)
<ol>
	<li>Kliknij "Na żywo", aby wyświetlić przepływ krwi w trybie na żywo. Wybierz określone naczynie krwionośne do analizy. Ustaw interesujące Cię naczynie w pozycji poziomej. Zatrzymaj tryb "Na żywo" po ustawieniu interesującego Cię statku</li>.
	<li>Wybierz tryb skanowania "xt" i ustaw centralny prześwit wybranego naczynia wzdłuż skanowania linii. Ustaw szerokość formatu na 1,024 x 512, prędkość = 8,000Hz, średnia linii = 32, czas = 512. Kliknij "start" i uzyskaj obrazy linii xt.</li>
	<li>Wygeneruj smugi do analizy ilościowej prędkości RBC, otwierając plik .lif i otwierając interesujący Cię obraz linii xt. W oprogramowaniu LAS-AF wybierz "eksperymenty", otwórz plik .lif i wybierz obraz. Uwaga: Automatycznie otworzy się kimograf.</li>
	<li>Zmierz czas (t, uzyskany na osi Y) wymagany, aby smuga cząstek (wykazująca ciemne odbicie) przebyła określoną odległość (d, uzyskana na osi X) na tym kimografie. Wybierz narzędzie "narysuj linię" i narysuj linię poziomo do smugi. Zanotuj odległość w μm i czas w sekundach wygenerowany w zakładce wyników u dołu obrazu.</li>
	<li>Oblicz prędkość jako V = odległość/czas, korzystając z wartości uzyskanych z kimografu.</li>
	<li>Określ ilościowo co najmniej pięć smug cząstek na obraz xt i co najmniej trzy pojedyncze naczynia o tym samym rozmiarze.</li>
</ol>

<ol><li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+microcirculation%3A+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li>
<li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Newsroom%22%5BJournal%5D)">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li>
<li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+liver+blood+flow%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22HPB.+Surg%22%5BJournal%5D)">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li>
<li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805(2010).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113(2005).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li>
<li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li>
<li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+spleen%3A+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity%2C+flux%2C+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li>
<li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids%2C+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawny rozwój mikroskopii przyżyciowej wątroby myszy otwiera nowe możliwości badania fizjologicznej odpowiedzi na zakażenie in vivo i w czasie rzeczywistym5,9,10. Przepływ krwi w narządach jest krytycznym parametrem fizjologicznym, który często ulega zmianie w wielu chorobach. Jednak stan hemodynamiki wątroby w warunkach fizjologicznych i zakaźnych pozostaje słabo zbadanym obszarem. W tym badaniu zastosowano metody oparte na IVM, które wcześniej zostały przystosowane do badania śledziony i naczyń kr...

Hemodynamika specyficzna dla narządu jest ważną fizjologiczną cechą każdego organu ssaka. Nieprawidłowości w przepływie krwi mogą być konsekwencją stanu zapalnego i oznaką dysfunkcji narządów1. W związku z tym organizacja, struktura i funkcja przepływu krwi pojawiają się jako parametry krytyczne do analizy w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Techniki, które są powszechnie stosowane do analizy przepływu krwi w określonym narządzie, mają kilka ograniczeń, w tym limit rozdzielczości samej techniki (np. obrazowanie dopplerowskie przepływu krwi), zdolność do pomiaru tylko bezwzględnego przepływu krwi (objętość krwi na jednostkę służącą narządowi) (np. optyczna tomografia koherentna) oraz pomiar średnich zmian prędkości w dużej i niejednorodnej populacji naczyń krwionośnych2,3. Układ krążenia wątroby łączy różne podtypy naczyń, które są niejednorodne pod względem wielkości, struktury i funkcji. W tym badaniu technologia obrazowania mikroskopii przyżyciowej (IVM) jest stosowana do oceny hemodynamiki wątroby in vivo, w czasie rzeczywistym, w wysokiej rozdzielczości i równolegle, aby odkryć charakterystykę poszczególnych naczyń krwionośnych składających się na narząd wątroby. Niedawny rozwój tej potężnej techniki obrazowania optycznego pozwala naukowcom na gromadzenie dynamicznych danych o żywych zwierzętach w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Umożliwiając bezpośrednią wizualizację i monitorowanie w czasie rzeczywistym specyficznych i szybkich procesów biologicznych in vivo, IVM daje badaczowi wyjątkową możliwość obrazowania poszczególnych naczyń krwionośnych oraz pomiaru i ilościowego określenia prędkości pojedynczych czerwonych krwinek (RBC) w specjalnie wybranym naczyniu wątrobowym.
W tym badaniu wdrożyliśmy technikę IVM w wątrobie myszy, aby zbadać wpływ zakażenia myszy przez hepatotropowego pasożyta Leishmania na hemodynamikę wątroby. L. donovani jest środkiem odpowiedzialnym za leiszmaniozę trzewną, ciężką chorobę charakteryzującą się ostrymi i przewlekłymi reakcjami zapalnymi oraz patologią obecną w wielu narządach, w tym śledzionie i wątrobie. W eksperymentalnym mysim modelu leiszmaniozy trzewnej infekcja wątroby ustępuje samoistnie, podczas gdy infekcja śledziony postępuje4. Te skutki zakażenia Leishmania w odniesieniu do poszczególnych narządów nadal nie są w pełni zrozumiałe. Badania nad hemodynamiką wątroby i śledziony w warunkach patologicznych rzucą nowe światło na interakcje gospodarz-pasożyt i patogenezę chorób.
Nasz eksperymentalny system modelowy opiera się na naświetlaniu i obrazowaniu wątroby znieczulonej myszy, która otrzymała dożylne wstrzyknięcie określonych barwników fluorescencyjnych w celu znakowania wewnątrznaczyniowej wątroby. Wątroba jest narządem sprzyjającym do mikroskopii przyżyciowej. Po wykonaniu małego nacięcia w jamie brzusznej, wątroba jest delikatnie uzewnętrzniana i umieszczana na mokrej gazie, a następnie na szkiełku nakrywkowym w celu zmniejszenia wszelkich artefaktów ruchowych spowodowanych biciem serca i oddychaniem. Wątroba jest następnie umieszczana w polu widzenia soczewki mikroskopu. W porównaniu ze śledzioną i węzłem chłonnym, które wymagają użycia dwóch mikroskopii fotonowych do badań IVM, zaletą wątroby jest jej jednorodna architektura/anatomia 3D, która pozwala na użycie konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego, o maksymalnej głębokości penetracji około 50 μm, do obrazowania mikroskopowego przyżyciowego5-8.
To badanie opisuje dwie niezależne metody obrazowania do ilościowego pomiaru prędkości RBC i prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych. W pierwszej metodzie przepływ krwi w wątrobie jest uzyskiwany przy użyciu trybu dwuwymiarowego xy w czasie. Uzyskane dane xyt są analizowane za pomocą wtyczki MtrackJ w darmowym oprogramowaniu ImageJ, która pozwala na śledzenie poszczególnych RBC w czasie. W drugiej metodzie wybiera się pojedyncze naczynie krwionośne i odpowiada mu przepływ krwi za pomocą trybu szybkiej akwizycji skanowania liniowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Naczynie będące przedmiotem zainteresowania jest skanowane z wysoką częstotliwością wzdłuż jego osi środkowej przez linię osiową. Prędkość przepływu krwi jest następnie określana ilościowo na podstawie różnicy w kontraście między nieznakowanymi ciemnymi erytrocytami a fluorescencyjnie znakowanym osoczem. Intensywności fluorescencji erytrocytów i osocza uzyskanych wzdłuż skanu liniowego są wykreślane w czasie w celu uzyskania smug, których kąty są proporcjonalne do prędkości pojedynczego RBC.
Celem tego artykułu jest dostarczenie prostej i powtarzalnej metody obrazowania i pomiaru prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych wątroby oraz udostępnienie podstawowych narzędzi do skutecznego przeprowadzenia operacji na myszach, IVM i ilościowych analiz prędkości poszczególnych krwinek czerwonych. Takie podejście pozwoli naukowcom uzyskać nowe informacje na temat prędkości krwi w warunkach patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Alexa 647</td><td>lifetechnologies</td><td>A34785</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-FITC 500 mol wt</td><td>SIGMA</td><td>46947</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>PanPharma</td><td>20434</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer</td><td>KP07KEU</td><td></td></tr><tr><td>Vetedine</td><td>Pharma Animal</td><td>6869029</td><td></td></tr><tr><td>Ciecz cyjanoakrylowa</td><td>Cyanolit</td><td>5833300005</td><td></td></tr><tr><td>Rama szkiełka nakrywkowego: Szkiełko membranowe do części mikrodystrekcyjnej N&deg;: 5013</td><td>Maszyny molekularne</td><td>50103</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe DiaPath 24x60 ep: 1,6 mm</td><td>DiaPath</td><td>61061</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Przeglądarka TCS-SP5</td><td></td></tr><tr><td>LAS-AF&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Leica</td><td>w wersji 3.1.0 buid 8587</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) to potężna technika obrazowania optycznego, która umożliwiła wizualizację, monitorowanie i kwantyfikację różnych zdarzeń biologicznych w czasie rzeczywistym i na żywych zwierzętach. Technologia ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat procesów fizjologicznych i zjawisk wywoływanych przez patogeny w określonych narządach.
W tym badaniu, IVM jest stosowany do wątroby myszy, a protokoły są zaprojektowane do obrazowania in vivo układu krążenia wątroby i pomiaru prędkości czerwonych krwinek (RBC) w poszczególnych naczyniach wątrobowych. Aby uwidocznić różne podtypy naczyń, które charakteryzują narząd wątroby i wykonywać pomiary prędkości przepływu krwi, myszom C57Bl / 6 wstrzykuje się dożylnie odczynnik fluorescencyjny do osocza krwi, który znakuje naczynia krwionośne związane z wątrobą. IVM umożliwia pomiar in vivo, w czasie rzeczywistym, prędkości RBC w konkretnym naczyniu będącym przedmiotem zainteresowania. Ustalenie tej metodologii umożliwi badanie hemodynamiki wątroby w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ostatecznie ta metodologia oparta na obrazowaniu będzie ważna dla badania wpływu infekcji L. donovani na hemodynamikę wątroby.
Ta metoda może być zastosowana do innych modeli zakaźnych i narządów myszy i może być dalej rozszerzona do przedklinicznych testów wpływu leku na stan zapalny poprzez ilościowe określenie jego wpływu na przepływ krwi.

Specyficzną organizację architektoniczną zatok wątrobowych można zwizualizować w oparciu o właściwości autofluorescencyjne tego narządu (Rysunek 1, panel B i C, kolor zielony), domięśniowe wstrzyknięcie Hoechst w celu znakowania jąder hepatocytów (Rysunek 1B, kolor niebieski) oraz dożylne wstrzyknięcie fluorescencyjnej BSA do barwienia układu krążenia wątroby (Rysunek 1C, kolor czerwony). Wątroba składa się z kilku różnych podtypów naczyń o odmiennych funkcjach i struktu...

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie obrazowania mikroskopowego in vivo wątróbki myszy w celu pomiaru prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach wątrobowych. Jest to realizowane poprzez uprzednie odsłonięcie wątroby i dożylne wstrzyknięcie fluorescencyjnego odczynnika plazmy w celu znakowania naczyń krwionośnych wątroby. Następnie, za pomocą mikroskopii konfokalnej, w czasie rzeczywistym wizualizowano sinusoidy wątrobowe oraz przemieszczające się do nich erytrocyty.W ostatnim kroku wybierane są interesujące naczynia wątrobowe w celu pomiaru prędkości przepływu krwi; filmy obrazujące przepływ krwi w wątrobie są rejestrowane z wysoką prędkością i rozdzielczością. Ostatecznie można określić prędkość przepływu krwi w poszczególnych naczyniach w normalnych warunkach fizjologicznych oraz po zakażeniu leiszmaniozą. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak ultradźwiękowe TOLA i optyczna koherentna tomografia, jest zapewnienie większej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w połączeniu z możliwością jednoczesnego pomiaru kilku innych parametrów.Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat hemodynamiki wątroby podczas infekcji mikrobio

intravital-microscopy-imaging-liver-following-leishmania-infection-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie mikroskopu intravitalnego wątroby po zakażeniu Leishmania: Ocena hemodynamiki wątroby

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego wątroby myszy do pomiaru prędkości przepływu krwi w naczyniach wątrobowych. Technika ta umożliwia wizualizację erytrocytów w sinusoidach wątrobowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Przeglądaj więcej filmów