Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów
25 lutego 2015
Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie spójnego modelu perfuzji płuc ex vivo na szczurach, który zapewni powtarzalne wyniki. Pierwszym krokiem jest kaniulacja tchawicy i rozpoczęcie wentylacji mechanicznej. Następnie kaniuluje się tętnicę płucną i lewy przedsionek.
Ostatnim krokiem jest usunięcie bloku płucoserca z jamy klatki piersiowej i umieszczenie go w obwodzie perfuzji płuc ex vivo. Ostatecznie czujniki ciśnienia, przetworniki masy ciała i analizator gazometrii krwi są wykorzystywane do pokazywania stanu płuc w czasie rzeczywistym poprzez pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej i innych parametrów. Płodność płuc ex vivo to niezwykła technologia, która pozwoliła nam poszerzyć pulę dawców do przeszczepów płuc.
Przewidujemy, że dzięki tej technologii, która posłuży jako platforma do oceny narządów, możemy poprawić jakość narządów dostarczanych do przeszczepu i ogólne wyniki przeszczepów. Tutaj, w laboratorium Copper, ukuliśmy termin uzbrajanie narządu, a więc ocena, przebudowa lub naprawa, a następnie modyfikowanie narządu w celu poprawy jakości, a tym samym poprawy wyników przeszczepu. Opracowaliśmy solidny i powtarzalny model perfuzji płuc ex vivo na małych zwierzętach i szczurach.
W tym filmie pokażemy kluczowe i krytyczne kroki, które należy podjąć, aby opracować ten model perfuzji płuc ex vivo, który następnie może służyć jako platforma do badań nad perfuzją i transplantacją. Zacznij od skonfigurowania obwodu EVLP i rozprowadzania ciepłego perfuzu ósemki w całym systemie. Ustaw ciepłą kąpiel wodną, wymiennik ciepła i sztuczną klatkę piersiową na 37 stopni Celsjusza.
Przepuść gaz deoksyoksytacyjny przez ósemkę PERFUSE w filtrze gazu, aby upewnić się, że ma około 6% rozpuszczonego tlenu do eksperymentu. Po otwarciu programu do akwizycji danych podłącz przetwornik ciśnienia w tętnicy płucnej, tchawicę, przetwornik różnicy ciśnień, przepływ oddechowy, przetwornik różnicy ciśnień, przetwornik masy płuc i przetwornik prędkości pompy do przetwornika analogowo-cyfrowego. Na koniec ustaw stół operacyjny i przygotuj wszystkie narzędzia operacyjne i materiały potrzebne do zabiegu.
Po sprawdzeniu sedacji za pomocą palca u nogi, uszczypnij, ułóż znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Rozpocznij rejestrowanie danych za pomocą programu do akwizycji danych. Gdy będziesz gotowy, wejdź do jamy brzusznej i wstrzyknij heparynę do żyły głównej dolnej.
Postępując zgodnie ze standardowymi procedurami, kaniuluj tchawicę i podłącz kaniulę do obwodu wentylacyjnego. Włącz wentylator mechaniczny, aby rozpocząć mechaniczną wentylację płuc. Następnie cofnij klatkę piersiową, aby odsłonić płuca, uważając, aby ich nie dotknąć.
Usuń grasicę i przesuń zawartość brzuszną na bok, aby odsłonić żyłę główną dolną lub żyłę krezkową. Po eutanazji należy założyć jedwabny szew za tętnicę płucną i aortę. Przygotowując się do zabezpieczenia kaniuli tętnicy płucnej, należy wykonać dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie na przedniej powierzchni drogi odpływu prawej komory i wprowadzić kaniulę do głównej tętnicy płucnej.
Zabezpiecz jedwabnym szwem, usuń skrzepy z układu naczyniowego płuc, przetłaczając około 15 mililitrów roztworu elektrolitu o niskiej zawartości potasu dodatniego przez tętnicę płucną i na zewnątrz przez wierzchołek serca. Następnie umieść jedwabny szew za sercem i wokół komór. Aby rozszerzyć zastawkę mitralną i ułatwić kaniulację, włóż małą parę kleszczy chirurgicznych do wierzchołka przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka.
Gdy będziesz gotowy, włóż kaniulę do wierzchołka przez zastawkę mitralną i do lewego przedsionka. Zabezpiecz lewą kaniulę przedsionka jedwabnym szwem. Następnie podłącz kaniulę tętnicy płucnej do obwodu EVLP.
Upewnij się, że przewód doprowadzający wychodzący z obwodu jest zalany bezpiecznikiem ósmym. Aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do serca i płuc, włącz główną pompę perystaltyczną i ustaw ją na niską prędkość. Umożliwi to przepuszczenie perfuzji ósemki przez tętnicę płucną i wyjście lewą komorą do jamy klatki piersiowej.
Monitoruj ciśnienie w tętnicy płucnej, aby upewnić się, że nie wznosi się ona w górę, co wskazuje na zablokowanie lub słabą kaniulację. Gdy będziesz gotowy, wyłącz pompę perystaltyczną. Podłącz kaniulę tętnicy płucnej do obwodu perfuzji płuc ex vivo.
Nie podłączaj lewej kaniuli przedsionka do obwodu, dopóki blok płuco-serce nie zostanie usunięty z organizmu. Usuń blok płuca serca, zaciskając przełyk hemostatem i przecinając poniżej zacisku, tak aby przełyk mógł być używany do podnoszenia struktur krążeniowo-oddechowych, wypreparowania otaczającej tkanki i przecięcia aorty zstępującej i naczyń pomocniczych, aby uwolnić blok płuca serca, podnosząc go przez przełyk. Przeciąć tchawicę, aby uwolnić blok płuco-serce i umieścić go w wyznaczonym miejscu w obwodzie EVLP.
Następnie podłącz lewą kaniulę przedsionka do przewodu odpływowego i uruchom pompę perystaltyczną. Aby rejestrować dane dotyczące wentylacji i monitorować ciśnienie, szybko wyjmij przewód wentylacyjny z górnej części aparatu EVLP i przymocuj obudowę do czujników ciśnienia. Następnie ponownie włóż przewód wentylacyjny na górę aparatu EVLP.
Upewnij się, że pułapka bąbelkowa jest odpowiednio wypełniona perfuse ósemką. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do płuc w ciągu pierwszych 15 minut, powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na pożądane poziomy eksperymentalne. Zwiększ natężenie przepływu perfuzji do pożądanej szybkości i ciśnienia również w tej początkowej fazie rozruchu.
Zaleca się zaprogramowanie respiratora tak, aby wykonywał przerywane oddechy boczne, aby ułatwić ruch płynu z przestrzeni płuc i opóźnić wystąpienie obrzęku. Zdefiniuj czas zerowy jako czas, w którym parametry wentylacji są na poziomie objętości oddechowej wynoszącej cztery mililitry na kilogram dodatni. Zakończ ciśnienie wydechowe na dwóch centymetrach.
Parametry H2O i perfuzji są na oczekiwanym poziomie i pozostają stałe. W razie potrzeby należy pobrać osiem próbek z portu próbki, błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i zanotować czas pobrania próbek. Po zakończeniu eksperymentu wyizoluj wszystkie niezbędne fragmenty anatomiczne do pobrania i albo błyskawicznie zamroź je w ciekłym azocie, albo umieść w roztworze utrwalającym do dalszych badań.
Masa płuc samców szczurów Sprague dolly nie zmieniła się znacząco w ciągu 60 minut perfuzji płuc ex vivo po pierwszych 10 minutach. Nie stwierdzono również zmian w ciśnieniu tętniczym płucnym. Podobnie, opór naczyniowy płuc nie uległ zmianie przez cały czas trwania badania.
Po godzinie wentylacji przy dużych objętościach oddechowych i wysokich stężeniach cytokin prozapalnych peep wzrosły w ósemce PERFUSE, podczas gdy stężenia cytokin przeciwzapalnych pozostały niezmienione. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć kluczowe kroki niezbędne do stworzenia modelu rozrostu płuc dla małych zwierząt ex Viva u szczurów w swoim laboratorium.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje opracowanie szczurzego modelu ex vivo perfuzji płuc (EVLP), którego celem jest poprawa wyników transplantacji płuc. Model ten umożliwia ocenę stanu płuc w czasie rzeczywistym, co pozwala na poszerzenie puli dawców.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia transplantacji
- Perfuzja płuc ex vivo
- Konserwacja organów
Wstęp
- Technologia perfuzji płuc ex vivo umożliwia lepszą ocenę płuc dawcy.
- Posiada ona potencjał do poprawy wyników transplantacji poprzez ocenę jakości narządu.
- Opracowanie powtarzalnego modelu zwierzęcego jest kluczowe dla postępu badań.
- Laboratorium Coppera dąży do udoskonalenia technik oceny narządów.
Cel badania
- Stworzenie spójnego modelu szczura do perfuzji płuc ex vivo.
- Ułatwienie badań nad transplantacją płuc oraz poprawą jakości organów.
- Zaprezentowanie kluczowych etapów konfiguracji modelu EVLP.
Zastosowane metody
- Kaniulacja tchawicy, tętnicy płucnej i lewego przedsionka.
- Zastosowanie czujników ciśnienia i systemów akwizycji danych do monitorowania w czasie rzeczywistym.
- Konfiguracja układu do perfuzji w ciepłej temperaturze i utrzymanie warunków fizjologicznych.
- Krok po kroku wykonanie procedur chirurgicznych w celu pobrania płuc.
Główne wyniki
- Skuteczne opracowanie szczurzego modelu EVLP z powtarzalnymi wynikami.
- Monitorowanie stanu płuc w czasie rzeczywistym podczas perfuzji.
- Prezentacja technik poprawiających jakość organów do transplantacji.
- Potencjał poprawy wyników transplantacji płuc dzięki zastosowaniu tego modelu.
Wnioski
- Szczurzy model EVLP jest cennym narzędziem w badaniach nad transplantacją płuc.
- Udoskonalenia tego modelu mogą prowadzić do lepszej oceny i zachowania narządów dawców.
- Niniejsze badanie przyczynia się do trwających wysiłków na rzecz zwiększenia wskaźników sukcesu przeszczepów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie powtarzalnego modelu ex vivo perfuzji płuc (EVLP) szczura zapewnia platformę przedkliniczną do oceny strategii konserwacji płuc oraz oceny jakości narządu przed transplantacją. Model ten wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku interwencji terapeutycznych celujących w uszkodzenia płuc indukowane wentylacją oraz inne patologie istotne dla optymalizacji płuc dawcy. Dzięki możliwości monitorowania parametrów płucnych w czasie rzeczywistym, system ten zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach procesów badawczych koncentrujących się na biologii transplantacji i regeneracji narządów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów uszkodzenia i regeneracji płuc w kontrolowanych warunkach perfuzji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu, umożliwiając ocenę szlaków molekularnych w nienaruszonym systemie narządowym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia istotny dla przebiegu choroby system przygotowania zwalidowanych układów biologicznych do testowania związków mających na celu poprawę jakości płuc.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testu poprzez pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej, masy płuc oraz parametrów gazometrycznych krwi w czasie rzeczywistym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modelowanie uszkodzenia płuc indukowanego wentylacją (VILI) w celu oceny odpowiedzi patofizjologicznych i testowania potencjalnych strategii łagodzących.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez utrzymanie warunków fizjologicznych podczas perfuzji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model EVLP u szczurów integruje się z kontinuum odkryć, wspierając testowanie hipotez we wczesnych badaniach biologicznych, umożliwiając przygotowanie testów do przesiewania związków oraz dostarczając ilościowych wyników niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w rozwoju przedklinicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli szlaków sygnałowych w procesach uszkadzania i naprawy płuc.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów, takich jak ciśnienie płucne i masa płuc, w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia akwizycję danych w czasie rzeczywistym za pomocą czujników ciśnienia, przetworników masy oraz analizy gazów krwi w celu oceny funkcji płuc.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie VILI, patologii o istotnym znaczeniu klinicznym w transplantologii płuc.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania roztworów konserwujących, strategii wentylacyjnych oraz środków farmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w odpowiedzi płuc na interwencje.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom kaniulacji, perfuzji i monitorowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka w badaniach nad konserwacją organów, redukując liczbę niepowodzeń na późnych etapach rozwoju transplantacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów w oparciu o funkcjonalne wyniki płuc, a nie o markery zastępcze.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kanulacji mikronaczyniowej oraz anatomii serca i płuc w modelach gryzoni.
- Zależność od aparatury, w tym pomp perystaltycznych, przetworników ciśnienia, czujników wagi oraz analizatorów gazometrycznych.
- Konieczność standaryzacji parametrów perfuzji, ustawień wentylatora i protokołów pozyskiwania danych pomiędzy zespołami.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy przenoszeniu metody z modelu szczura na większe modele ssaków lub ocenę płuc u ludzi.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak złożoność techniczna ekstrakcji bloku serce-płuca oraz zachowanie sterylności podczas perfuzji.
