Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Celem poniższego eksperymentu jest możliwość zobrazowania makrocząsteczek w stanie zamrożonym uwodnionym za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Osiąga się to poprzez błyskawiczne zanurzenie siatki z próbką na kriogenie w celu uzyskania cienkiej zeszklonej próbki. W drugim etapie próbka jest wystawiana na działanie wiązki elektronów, która utworzy obraz projekcyjny makrocząsteczek.

Następnie obrazy są przetwarzane na komputerze w celu uzyskania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki. Wyniki pokazują bardzo szczegółową strukturę 3D makrocząsteczki, jej potwierdzenie oraz lokalizację 3D jej partnerów molekularnych. Główną zaletą tej techniki, innych metod przygotowania próbek do elektromikroskopii, jest to, że jest to jedna z głównych zalet.

W krioterapii obraz jest tworzony bezpośrednio przez elektrony w makrocząsteczce. To wierniej oddaje jego zbliżoną do rodzimej struktury. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Przygotowanie siatki kriogenicznej i przeniesienie jej do mikroskopu elektronowego jest trudne do nauczenia ze względu na dodatkowe komplikacje podczas pracy w temperaturach kriogenicznych, Cykl rozgrzewki jest stosowany na początku sekwencji pompowania i po sesji krioelektromagnetycznej. Aby rozpocząć tę procedurę, włóż uchwyt kriogeniczny do jednego z portów pompowych przepompowni. Uruchom opcję cyklu rozgrzewki.

W sterowniku zimnego stopnia otwórz przepustnicę V dwa, a gdy podciśnienie w przepompowni turbo ustabilizuje się i odczyta 10 do minus trzy tury, lub lepiej otwórz przepustnicę V jeden. Gdy temperatura w uchwycie ustabilizuje się powyżej temperatury pokojowej i cykl rozgrzewania zostanie zakończony. Obniża V jeden i zatrzymuje cykl.

Następnie uruchom opcję cyklu ze light i wybierz niezbędny czas, aby uzyskać dobrą próżnię w zakresie od jednego do dwóch razy 10 do minus czterech torów. Gdy próżnia osiągnie 10 do minus trzech, aby zakres, otwórz zawór spustowy DU B trzy i zawór na uchwycie krio. Po zakończeniu cyklu podnieś zawory w odwrotnej kolejności, w jakiej zostały otwarte.

Za pomocą pęsety zostaw kawałek MICA, aby odsłonić dwie nowe powierzchnie. Umieść nowe odsłonięte powierzchnie miki stroną zadrukowaną do góry na białym kartce papieru na szalce Petriego. Po umieszczeniu szalki Petriego w słoiku parownika węglowego, wykonaj sekwencję pompowania w dół, aż próżnia spadnie poniżej 10 do minus sześciu, aby pokryć mikę cienką warstwą węgla.

Następnie przenieś cienki węgiel na siatkę. Że kawałek powlekanej miki o wymiarach 0,5 na jeden centymetr i unosić węgiel na płaską powierzchnię przefiltrowanej wody dejonizowanej. Za pomocą pęsety umieść świętą stronę siatki z węgla w kontakcie z górną powierzchnią pływającej warstwy węgla i podnieś ją.

Umieść siatkę stroną z włókna węglowego skierowaną do góry na szklanym szkiełku o wymiarach 7.5 na 2.5 centymetra pokrytym folią zasilającą. Następnie umieść szkiełko szklane w komorze urządzenia do wyładowywania jarzeniowego i zamknij komorę. Napompuj słoik z dzwonkiem i rozpal go.

Rozładowuj przez 20 sekund przy natężeniu 25 miliamperów i siedem razy 10 do minus dwóch milibarów. W tym momencie włącz urządzenie do zamrażania wgłębnego. Pociągnij pojemnik Ethana w dół, napełniając zbiornik ciekłym azotem.

Gdy ciekły azot przestanie wrzeć, umieść końcówkę rurki wychodzącej ze zbiornika Ethana w komorze wewnętrznej i bardzo powoli otwórz zawór. Skroplić etan w komorze wewnętrznej i napełnić go do jednego milimetra od góry. Włącz wilgotność.

Następnie załaduj siatkę na pęsetę i załaduj od trzech do pięciu mikrolitrów próbki na węglową powierzchnię świętej siatki. Po odczekaniu, aż próbka wchłonie się do siatki, wykonaj blotting Aby uzyskać cienką warstwę płynnego rumieńca, zamroź siatkę, zanurzając ją w ciekłym etanie. Ostrożnie wyjmij zespół siatki pęsety z ciekłego etanu i przenieś go do zewnętrznej komory zawierającej ciekły azot.

Następnie przenieś siatkę do małego pudełka z siatką zanurzonego w ciekłym azocie. W tym momencie włóż uchwyt kriogeniczny do stacji roboczej do kriotransferu. Napełnij uchwyt kriogeniczny i naczynie stacji roboczej ciekłym azotem.

Szybko przenieś skrzynkę kriokratyczną, w której znajduje się zamrożona, uwodniona siatka, do ciekłego azotu w stacji roboczej. Po otwarciu pudełka z siatką krio weź zamrożoną, uwodnioną siatkę i umieść ją w gnieździe uchwytu na próbkę. Następnie umieść pierścień zaciskowy na górze siatki i delikatnie dociśnij go końcem narzędzia do pierścienia zaciskowego, aż zostanie mocno osadzony na miejscu.

Następnie zamknij migawkę kriogeniczną. Uzupełnij środek przeciw zanieczyszczeniom TEM ciekłym azotem. Ponownie przechyl stolik mikroskopu do minus 60 stopni.

Następnie rozpocznij cykl śluzy powietrznej PrepU na mikroskopie. Po zakończeniu sekwencji powietrznej śluzy pompy, włóż uchwyt chóru do śluzy powietrznej i podłącz przewód sterujący zimnego stage do uchwytu, aby monitorować temperaturę. Po zgaszeniu czerwonego światła obróć uchwyt do pozycji zerowej stopnia, aby włożyć go do kolumny wysokiego podciśnienia T EM.

Cofnij żaluzję kriogeniczną i otwórz zawory kolumny. Aktywuj program niskiej dawki w trybie wyszukiwania. Wyśrodkuj stolik i ustaw wysokość centryczną za pomocą woblera alpha, aby rozkołysać scenę o plus minus 15 stopni, wybierz odpowiedni otwór i umieść go na środku pola za pomocą kontrolera stolika XY.

Przełącz się w tryb ostrości i ustaw ostrość obrazu. Następnie pod ostrością obraz od 0,5 do 4,5 mikrona. Przełącz się w tryb ekspozycji i nagraj obraz.

Na koniec wróć do trybu wyszukiwania, aby wybrać następny otwór i powtórz sekwencję. Obrazy mikroskopowe uzyskane metodami barwienia ujemnego i krio-EM dla czterech reprezentatywnych próbek o różnych cechach strukturalnych są tutaj porównywane: ujemnie barwione kapsydy wirusa związane z adenowirusem ujawniają cząstki wirusopodobne, a krio-EM pokazuje, że są puste. Obrazy wirusa mozaiki tytoniu pokazują spiralne pręciki z centralnym kanałem wypełnionym plamą w barwieniu negatywowym i pustym na obrazach kriogenicznych.

KLH montuje się w charakterystycznych beczkach pokazujących sześć prążków zarówno na obrazach negatywowych, jak i kriogenicznych. Prostokątne widoki boczne oraz widoki okrągłe i na ujawniają pustkę w strukturze przez krioEM w receptorze odyny. Skomplikowane cechy powierzchni, takie jak centralny krzyż i centralne zagłębienie, objawiają się nagromadzeniem plam przez barwienie ujemne oraz jako obszary o niższej gęstości przez kriolumin.

Typowymi przykładami artefaktów kriogenicznych EM są lód krystaliczny, zanieczyszczenie lodem, astygmatyzm i struktury przypominające pajęczynę. Analiza pojedynczych cząstek i rekonstrukcja 3D zamrożonego uwodnionego receptora ine ujawniają jego czterokrotną symetryczną strukturę. Domena cytoplazmatyczna tworzy kwadratowy pryzmat i zawiera kilka powtarzalnych domen gruczołowych tworzących strukturę podobną do rusztowania.

Przy rozdzielczości 10 angstremów możliwa jest wizualizacja alfa HELOC 3D. Mapowanie różnic może ujawnić położenie ważnych ligandów. Zmiany potwierdzające zapewniają dynamiczny widok makrocząsteczki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wysokiej jakości próbki krio-EM. Cryo EM, w połączeniu z przetwarzaniem obrazu, umożliwiło naukowcom zbadanie struktury, podjednostek, organizacji i dynamiki konformacyjnej maszyn makromolekularnych.