Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie trójwymiarowych kultur komórkowych i analiza z wykorzystaniem obrazowania spektrometrią mas. Jest to realizowane poprzez uprzednie stworzenie trójwymiarowych kultur komórkowych i doprowadzenie ich do pożądanej wielkości. Drugim krokiem jest zebranie i zatopienie trójwymiarowych kultur komórkowych w żelatynie.

Następnie trójwymiarowe hodowle komórkowe są krojone w temperaturze -30 °C przy użyciu kriostatu i montowane na szkiełkach przewodzących. Ostatnim krokiem jest analiza przekrojów za pomocą instrumentu do MALDI MSI oraz analiza wykrytych cząsteczek. W rezultacie obrazowanie spektrometrią mas jest wykorzystywane do wykazania zmian w rozkładzie analitów wielu różnych klas biomolekuł w obrębie trójwymiarowej hodowli komórkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia masowa czy autoradiografia, jest to, że obrazowanie spektrometrią mas pozwala na detekcję i lokalizację wielu analitów, takich jak białka, lipidy, leki i metabolity, w jednym eksperymencie bez konieczności znakowania przeciwciałami. Procedurę zademonstrują Dorothy Alf Wheatcraft, ja sam, postdoc, oraz Shin Li, doktorant z laboratorium Hammana. Przed rozpoczęciem tej procedury należy wyhodować odpowiednią linię komórkową, np. linię komórek raka jelita grubego HCT 116, w dwuwymiarowej hodowli monowarstwy. Następnie dodać 0,19 g aros do 10 ml standardowej pożywki w 50 ml probówce stożkowej.

Zapewnij włączenie poprzez delikatne mieszanie, a następnie autoklawuj podłoża Agros w łaźni wodnej przez 20 minut. Za pomocą wielokanałowej pipety nanieś 50 µL mieszaniny pożywki Agros do 60 środkowych studzienek płaskodennej płytki hodowlanej z 96 studzienkami. Ponieważ w studzienkach znajdujących się na obrzeżach płytki tempo parowania jest nieco wyższe, nanieś do tych brzegowych studzienek 200 µL jednokrotnego roztworu PBS zamiast podłoża Agros.

Po dodaniu mieszaniny aros do wewnętrznych studni, odstawić płytkę do schłodzenia do około 37 °C przed dodaniem komórek. Następnie do pokrytej aros płytki 96-dołkowej dodać 200 µL odpowiedniego zawiesiny komórek, przykryć płytkę i umieścić w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu wzrostu komórek. Po inkubacji wymienić pożywkę, ostrożnie aspirując starą pożywkę z obszaru wokół małej trójwymiarowej hodowli komórkowej na dnie aros.

Następnie ostrożnie dodaj 200 µL świeżej pożywki na trójwymiarową hodowlę komórkową. Przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu około 175 mg/mL w wodzie wysokiej czystości. Wymieszaj żelatynę energicznie, gdy roztwór stanie się lepki i trudny do manipulowania.

Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze około 60 °C i ogrzewaj, aż roztwór stanie się klarowny i łatwy do aspiracji. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml nanieś 0,6 ml ciepłego roztworu żelatyny do dołków 24-dołkowej płytki z płaskim dnem. Natychmiast umieść wypłukane trójwymiarowe hodowle komórkowe na warstwie żelatyny, używając innej pipety 2 ml, aby uniknąć przerwania struktury trójwymiarowej.

Po umieszczeniu kultur komórkowych na powierzchni warstwy żelatyny, ostrożnie nanieś pipetą kolejne 0,6 ml ciepłej mieszaniny żelatyny, aby nie zaburzyć ich położenia. Następnie zamroź trójwymiarowe kultury komórkowe zatopione w żelatynie w temperaturze -80 °C.

Po wyjęciu z zamrażarki płytki 24-dołkowej z hodowlami komórkowymi, ogrzewaj dno płytki dłonią, aż pęseta będzie mogła gładko wysunąć się wzdłuż ścianki dołka. Następnie płynnie przesuń pęsetą wokół krążka, uwalniając żelatynę bez rozmrażania centrum.

Nanieś kroplę wody na podkładkę do kriotomu i przytwierdź do niej dysk żelatynowy. Następnie umieść próbkę w kriotomie w celu zamrożenia. Po usunięciu nadmiaru żelatyny w celu odsłonięcia trójwymiarowych kultur komórkowych, wykonuj powolne cięcia płynnym ruchem, otrzymując skrawki o grubości od 12 do 16 µm.

Po rozmrożeniu przekrojów należy przymocować je do szkiełek przedmiotowych powlekanych tlenkiem indu i tytanu. Po oznakowaniu szkiełek należy przechowywać je w eksyكاته w celu zachowania nienaruszonej struktury białek do ich późniejszej detekcji. Przekroje należy przemyć zimnym acetonem, aby usunąć małe cząsteczki, takie jak lipidy, które mogłyby maskować sygnał.

Przygotuj matrycę w roztworze rozpuszczalnika organicznego i wody z 0,1% kwasu trichlorooctowego. Użyj strzykawki z cienkim igłowcem, aby nanieść 0,5 µL roztworu matrycy na przekrój trójwymiarowej hodowli komórkowej. Po doprowadzeniu do krystalizacji matrycy wysusz preparaty w deskryka-torze przez co najmniej 30 minut przed analizą Maldi MSI.

Na tym etapie analizy umieść preparaty w adapterze przeznaczonym do bezpiecznego utrzymania szkiełek o wymiarach 75 mm na 25 mm, aby zobrazować trójwymiarowe plastry hodowli komórkowych. Następnie wprowadź adapter ze szkiełkami do instrumentu. Po opracowaniu odpowiednich metod akwizycji danych, ustaw zakres mas dla akwizycji danych o małych cząsteczkach między 101 000 m/z a dla białek między 8 020 a 5 000 m/z.

Następnie, wykorzystując roztwór kalibracyjny oraz znajdujący się w pobliżu poświęcalny trójwymiarowy plaster hodowli komórkowej, należy dostosować moc lasera, częstotliwość i liczbę impulsów laserowych oraz rozmiar plamki. Metodę tę należy zapisać do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu obrazującym dostarczonym przez producenta urządzenia. Należy opracować metody pozyskiwania danych białkowych dla wybranego zakresu mas, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Następnie należy skonfigurować specyficzne parametry instrumentu MS za pomocą oprogramowania do obrazowania. Po wybraniu parametrów instrumentu i ustawieniu pozycji metody sterowania instrumentem, określając obszar skanowania hodowli komórkowej 3D, należy wybrać trzy odpowiednie punkty nauczania (teach points) na próbce, przesuwając laser do każdego z nich.

Następnie uzyskaj fotografię optyczną z oprogramowania sterującego laserem MALDI-TOF, korzystając z funkcji print screen. Następnie uruchom proces obrazowania w oprogramowaniu do obrazowania i uzyskaj widma mas z każdego plastra do analizy celowanej. Przeprowadź manualną analizę widm, klikając wybraną masę w widmie średnim.

Na koniec przeprowadź analizę statystyczną wyekstrahowanych zestawów danych w oprogramowaniu matematycznym. Obrazowanie spektrometrią mas ma potencjał do ujawniania wielu różnych rozkładów molekularnych w trójwymiarowych kulturach komórkowych. Stosując opisaną wcześniej metodę, można śledzić obecność cząsteczek o różnej wielkości, od małych cząsteczek po duże białka, w całej kulturze.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania, krojenia i analizy trójwymiarowych kultur komórkowych za pomocą obrazowania spektrometrią mas.