Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie trójwymiarowych kultur komórkowych i analiza za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie trójwymiarowych kultur komórkowych i umożliwienie im wzrostu do pożądanych rozmiarów. Drugim krokiem jest zebranie i zatopienie trójwymiarowych kultur komórkowych w żelatynie.

Następnie trójwymiarowe hodowle komórkowe są krojone w plastry w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza za pomocą kriostatu i umieszczane na szkiełkach przewodzących. Ostatnim krokiem jest analiza wycinków za pomocą instrumentu Maldi MSI i przeprowadzenie analizy wykrytych cząsteczek. Ostatecznie obrazowanie za pomocą spektrometrii mas służy do pokazania zmian w rozmieszczeniu analitów wielu różnych klas biomolekuł w trójwymiarowej hodowli komórkowej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi masami, takimi jak mikroskopia lub radiografia automatyczna, jest to, że obrazowanie masowe umożliwia wykrywanie i lokalizację wielu analiz, takich jak białka, leki lipidowe, oraz metabolizowanie w jednym eksperymencie bez antyznakowania. Procedurę zademonstruje Dorothy Alf Wheat craft, ja, postdoc i Shin Li, doktorant z laboratorium Hammana Przed rozpoczęciem tej procedury hodowla i odpowiednia linia komórkowa, taka jak HCT jedna 16 linia komórkowa raka jelita grubego w dwuwymiarowej hodowli jednowarstwowej. Następnie dodaj 0,19 grama aros do 10 mililitrów standardowego podłoża w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów.

Upewnij się, że miesza się przez delikatne mieszanie, a następnie autoklaw agros w łaźni wodnej przez 20 minut za pomocą aspiratu wielopipetowego. 50 mikrolitrów mieszaniny pożywki Agros do 60 centralnych dołków płaskodennej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Ponieważ studzienki na obwodowych krawędziach płytki mają nieco wyższe szybkości parowania przy 200 mikrolitrach jednego x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej zamiast aros do tych krawędzi.

Po dodaniu mieszaniny aros do wewnętrznych studzienek odłóż płytkę do ostygnięcia do około 37 stopni Celsjusza przed dodaniem komórek. W tym momencie, w 200 mikrolitrach odpowiedniego roztworu komórkowego do pokrytej aros 96-dołkowej płytki, przykryj płytkę i umieść w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni komórki CS w celu wzrostu komórek. Po inkubacji zmień pożywkę, ostrożnie odsysając stare pożywki z okolic małej trójwymiarowej hodowli komórkowej na dnie aros.

Następnie delikatnie dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki do trójwymiarowej hodowli komórkowej. Przygotuj roztwór około 175 miligramów na mililitr żelatyny w wodzie o wysokiej czystości. Żelatynę energicznie wymieszać, gdy roztwór stanie się lepki i trudny do manipulowania.

Umieść probówkę w łaźni wodnej w temperaturze około 60 stopni Celsjusza, aż roztwór stanie się klarowny i łatwy do przyswojenia. Używając dwumililitrowej pipety serologicznej, wlej 0,6 mililitra ciepłego roztworu żelatyny do dołków 24-dołkowej płytki z płaskim dnem. Umieść umyte trójwymiarowe kultury komórkowe bezpośrednio na warstwie żelatyny za pomocą innej dwumililitrowej pipety, aby uniknąć pęknięcia trójwymiarowej struktury.

Po umieszczeniu kultur komórkowych na powierzchni warstwy żelatyny należy ostrożnie nacisnąć na nie kolejne 0,6 mililitra ciepłej mieszaniny żelatyny, aby nie zaburzyć ich położenia. Po tym zamrożeniu. Żelatyna osadzała trójwymiarowe kultury komórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po wyjęciu z zamrażarki płytki 24-dołkowej zawierającej kultury komórkowe, ogrzej dno płytki ręką, aż pęseta będzie mogła delikatnie zsunąć się po boku dołka. Dalej płynnie. Przesuń pęsetę wokół dysku, uwalniając żelatynę bez rozmrażania środka.

Dodaj kroplę wody do wspornika kriostatu i przyklej krążek żelatyny do podłoża. Następnie umieść w kriostacie do zamrożenia. Po zmierzeniu się z nadmiarem żelatyny w celu odsłonięcia trójwymiarowych kultur komórkowych, powoli pokrój je płynnym ruchem w sekcjach od 12 do 16 mikrometrów.

Po rozmrożeniu plastrów zamontuj je na szkiełkach pokrytych tlenkiem indu i tytanu. Po oznaczeniu szkiełek przechowuj je w suchym pojemniku w celu wykrycia nienaruszonego białka. Umyj plastry w zimnym acetonie, aby usunąć małe cząsteczki, takie jak lipidy, które mogłyby zamaskować sygnał.

Przygotować matrycę w roztworze rozpuszczalnika organicznego i wody z 0,1% kwasem trichlorooctowym. Użyj strzykawki z cienką końcówką, aby nałożyć 0,5 mikrolitra roztworu matrycy na trójwymiarowy wycinek kultury komórkowej. Po pozostawieniu matrycy do krystalizacji, wysuszyć szkiełka w suchym roztworze przez co najmniej 30 minut przed podaniem Maldi MSI.

Analiza W tym momencie zamontuj szkiełka w adapterze wykonanym tak, aby bezpiecznie trzymać szkiełka o wymiarach 75 milimetrów na 25 milimetrów, aby zobrazować trójwymiarowe wycinki kultur komórkowych. Następnie załaduj adapter suwakowy do instrumentu. Po opracowaniu odpowiednich metod pozyskiwania danych należy dostosować zakres mas dla akwizycji danych o małych cząsteczkach w zakresie 101 000 współczynnika ładunku głównego i dla białek w zakresie 8 020 5 000 stosunku ładunku głównego.

Następnie dostosuj moc lasera, częstotliwość, liczbę strzałów laserowych i rozmiar plamki, używając roztworu kalibracyjnego i pobliskiego trójwymiarowego wycinka hodowli komórkowej. Zapisz tę metodę do użycia w oprogramowaniu do obrazowania dostarczonym przez producenta urządzenia. Opracowanie metod pozyskiwania danych o białkach dla wybranego zakresu masy, jak opisano wcześniej.

Następnie skonfiguruj określone parametry instrumentu MS za pomocą oprogramowania do obrazowania. Po wybraniu parametrów instrumentu i ustawieniu pozycji metody sterowania instrumentem, gdzie zeskanować hodowlę komórkową 3D. Następnie wybierz trzy odpowiednie punkty uczenia na próbce, przesuwając laser do każdego z nich.

Z kolei uzyskaj zdjęcie optyczne z oprogramowania sterującego laserem maldi TOF za pomocą print screen. Następnie rozpocznij proces obrazowania z poziomu oprogramowania do obrazowania i uzyskaj widma masy z każdego wycinka w celu ukierunkowanej analizy. Wykonaj ręczną analizę widm, klikając masę w średnim spektrum.

Na koniec przeprowadź analizę statystyczną z wyodrębnionymi zestawami danych w oprogramowaniu matematycznym. Obrazowanie za pomocą spektrometrii mas może ujawnić wiele różnych rozkładów molekularnych w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Korzystając z wcześniej opisanej metody, można śledzić gatunki od małych cząsteczek do dużych białek w całej kulturze.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować, kroić i analizować trójwymiarowe kultury komórkowe za pomocą obrazowania spektrometrii mas.