Adaptacja metod badania wideofluoroskopowego jaskółki u ludzi do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w modelach choroby myszy
1 marca 2015
To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego badania połykania (VFSS) do użycia z modelami chorób mysich w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji połykania u swobodnie zachowujących się gryzoni, określane najpierw jako wideo fluoroskopowe badanie połykania lub VFSS. Komora karmienia jest skonstruowana tak, aby podczas badania trzymać gryzonie na małej przestrzeni. Drugim krokiem jest przeprowadzenie warunkowania behawioralnego za pomocą rozwiązania testowego, aby zapewnić maksymalne uczestnictwo.
Następnym krokiem jest przeprowadzenie testów VFSS na wstępnie kondycjonowanych myszach. Na koniec filmy są poddawane analizie klatka po klatce w celu ilościowego określenia parametrów jaskółki. Ostatecznie, to nowatorskie narzędzie oceny może być wykorzystane do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w lustrzanych modelach choroby oraz dostarczania funkcjonalnych biomarkerów do wykorzystania w badaniach przedklinicznych.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł wykorzystania komór obserwacyjnych, ponieważ testowanie VFSS na ludziach jest dobrowolne i nieograniczone, a my chcieliśmy ściśle naśladować procedurę kliniczną u ludzi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z podobnymi istniejącymi metodami jest to, że szybko wywołuje ona dobrowolne zachowania żywieniowe u gryzoni, co umożliwia szybkie testowanie wszystkich etapów połykania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy z analizą wideo, ponieważ małe i szybkie ruchy połykania i myszy są trudne do rozpoznania.
Zacznij od zmontowania komór obserwacyjnych, a następnie zmontuj system dostarczania strzykawki, aby dostarczyć roztwór do misek kołkowych podczas testowania. Po zmontowaniu umieść komorę obserwacyjną na zmotoryzowanym podnośniku nożycowym w celu zdalnego pozycjonowania. Główną zaletą zdalnie sterowanego podnośnika nożycowego jest poprawa bezpieczeństwa radiologicznego dla badaczy przy jednoczesnym zachowaniu swobodnie zachowujących się gryzoni w polu widzenia fluoroskopii.
Przygotuj myszy, przyzwyczajając je do komory obserwacyjnej i poddając je nocnemu okresowi regulacji wody. Gdy będziesz gotowy do testowania, wyjmij komorę z klatki i dokładnie ją wyczyść. Użyj markera suchościeralnego, aby oznaczyć każdą oczyszczoną tubkę przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce domowej.
Następnie przygotuj roztwór joheksolu o smaku czekoladowym, aby skonfigurować środowisko fluoroskopii. Użyj zapasowej komory obserwacyjnej i miski na kołki, aby określić optymalną wysokość i pozycję w wiązce fluoroskopu, która umożliwia wizualizację picia w płaszczyźnie bocznej. Ustaw liczbę klatek na sekundę fluoroskopii na 30 klatek na sekundę.
Można użyć wyższej liczby klatek na sekundę, jeśli jest dostępna. Upewnij się, że znacznik kalibracyjny nieprzepuszczający promieni rentgenowskich jest odpowiednio umieszczony na kamerze fluoroskopowej, tak aby był widoczny na monitorze wyświetlacza podczas całego testu. Ten krok jest niezbędny, aby umożliwić kalibrację pomiarów długości w celu zmniejszenia naprężeń spowodowanych obsługą.
Obserwuj klatkę, aż mysz swobodnie wejdzie do komory obserwacyjnej. Po wejściu wyjmij komorę z klatki i delikatnie załóż drugą zaślepkę. Dzięki wielokrotnym testom myszy można łatwo nakłonić do wejścia do komory, gdy jest ona umieszczona przed nimi w klatce lub gdy jest zawieszona za ogon nad otworem komory.
Ustawić komorę obserwacyjną w maszynie do fluoroskopii, aby rozpocząć badanie VFSS w płaszczyźnie bocznej. Następnie użyj systemu dostarczania strzykawki, aby napełnić miskę kołka roztworem iohexolu o smaku czekoladowym. Rozpocznij nagrywanie wideo fluoroskopii.
Gdy mysz zacznie pić podczas testu, użyj zdalnie sterowanego stołu podnośnego, aby wyregulować położenie komory obserwacyjnej tak, aby mechanizm połykania był widoczny w polu view. Wstrzymaj nagrywanie za każdym razem, gdy mysz odwróci się od miski na kołki, aby zminimalizować czas ekspozycji na promieniowanie. Wznów nagrywanie, gdy mysz powróci do miski na kołki, w razie potrzeby napełnij miskę na kołki.
Celem jest zarejestrowanie kilku długich napadów ciągłego picia, co jest typowe dla większości myszy. W ciągu pierwszych dwóch minut testowania przerwij testowanie, jeśli mysz nie wypije w ciągu pięciu minut, zwróć myszy niespełniające wymagań do klatki domowej w celu ponownego przetestowania w późniejszym czasie tego samego dnia. Nie przekraczaj 24-godzinnej regulacji wody.
Podczas testowania wielu myszy z tej samej klatki domowej. Wyczyść miskę na kołki i rurkę suchym ręcznikiem papierowym między myszami. W razie potrzeby przytnij końcówkę rurki PE.
W przypadku żucia podczas badania, w razie potrzeby wyczyść komorę obserwacyjną, aby usunąć wszelkie rozpryskiwane joheksol ze ścianek komory. Opłucz komorę wodą z kranu i osusz ręcznikiem papierowym. Użyj oprogramowania do edycji wideo, które umożliwia analizę klatka po klatce nagrań fluoroskopowych wideo.
Aby określić ilościowo interesujące parametry połykania, co najmniej dwóch przeszkolonych recenzentów powinno przeanalizować każdy film w sposób zaślepiony. Główny recenzent ogląda każdy film, aby zidentyfikować i przeanalizować od trzech do pięciu długich napadów picia. Kryterium to opiera się na opublikowanych badaniach połykania nieobjętych radiografią, które wykazały, że parametr ten jest wystarczający do analizy statystycznej.
Następnie recenzent pomocniczy niezależnie analizuje od trzech do pięciu pomiarów na parametr połykania dla każdej myszy, które zostały wstępnie zidentyfikowane i przeanalizowane przez głównego recenzenta. Rozbieżności recenzentów są następnie identyfikowane dla każdej myszy i ponownie analizowane, aż do osiągnięcia 100% konsensusu. Niekwestionowane wartości dla każdego parametru swallow są następnie uśredniane w celu uzyskania średniej wartości dla każdej myszy.
Jeżeli dla parametru jaskółki uzyskano mniej niż trzy miary, należy wprowadzić brakującą wartość w statystycznej bazie danych dla tej miary. Przykłady te uzyskano przy użyciu niskoenergetycznego systemu fluoroskopowego. Jeden z nich pozwala na wizualizację całej głowy i bliższego odcinka piersiowego.
Punkt spustowy jaskółki jest wyśrodkowany w polu widzenia. Pozycja druga umożliwia wizualizację od punktu spustowego połykania do połączenia żołądkowo-przełykowego. Zwróć uwagę, że bolus przechodzi przez dystalny przełyk nawet przy najmniejszym ustawieniu powiększenia.
Struktury kostne głowy i szyi są łatwo widoczne za pomocą systemu fluoroskopii niskoenergetycznej. Struktury anatomiczne są również badane w większym powiększeniu, aby umożliwić ilościowe określenie kilku dodatkowych parametrów połykania. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne wstępne wyniki dla dwóch parametrów połykania VFSS, szybkości połykania i częstości połykania między połknięciami, które były znacznie wolniejsze dla myszy SOD one w porównaniu z myszami w wieku C 57.
Interwał połykania między myszami i grupą kontrolną nie różnił się istotnie między grupami. Po opanowaniu przechwytywanie wideo można wykonać w niecałe dwie minuty na masę, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby w ciągu kilku godzin od przygotowania użyć roztworu testowego o smaku czekoladowym, aby zapobiec zmianom lepkości i smakowitości, które mogą prowadzić do zachowań unikających.
Ta nowa technika toruje drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania naturalnych zachowań związanych z karmieniem i połykaniem u zdrowych gryzoni i modeli chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przeprowadzać testy VFSS swobodnie zachowujących się gryzoni Aby określić ilościowo typowe zachowania żywieniowe i funkcję połykania, nie zapominaj, że praca ze sprzętem emitującym promieniowanie może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności dotyczących promieniowania dotyczących czasu, odległości i ekranowania.
Przegląd
To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody badania połykania człowieka za pomocą wideofluoroskopii (VFSS) do zastosowania w modelach chorób u myszy, ułatwiając translacyjne badania nad dysfagią. Procedura ma na celu ocenę funkcji połykania u swobodnie zachowujących się gryzoni, w sposób bliski praktykom klinicznym u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowania
- Badania translacyjne
Tło
- VFSS to standardowa metoda oceny połykania u ludzi.
- Badanie ma na celu replikację technik VFSS w modelach gryzoni.
- Metoda pozwala na obserwację dobrowolnych zachowań żywieniowych.
- Stanowi platformę do wykrywania dysfagii w modelach chorobowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody badania połykania u gryzoni.
- Stworzenie funkcjonalnych biomarkerów dla badań przedklinicznych.
- Poprawa rozumienia mechanizmów dysfagii w modelach chorobowych.
Stosowane metody
- Budowa komory karmiącej do ograniczenia ruchu gryzoni podczas testów.
- Kondycjonowanie zachowań z użyciem testowego roztworu, aby zapewnić udział.
- Analiza klatka po klatce wideo z VFSS w celu ilościowego określenia parametrów połykania.
- Użycie pilotowego podnośnika nożycowego dla lepszej bezpieczeństwa promieniowania.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem wywoływała dobrowolne zachowania żywieniowe u gryzoni.
- Ilościowa analiza parametrów połykania została osiągnięta poprzez analizę wideo.
- Konsensus wśród recenzentów zapewnił dokładne pomiary parametrów połykania.
- Technika wykazała potencjał w identyfikacji dysfagii w modelach u myszy.
Wnioski
- Ta nowatorska adaptacja VFSS jest skuteczna w badaniu dysfagii u gryzoni.
- Metoda dostarcza cennego narzędzia do przedklinicznych badań nad dysfagią.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę ramę do eksploracji dysfagii w różnych kontekstach chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Adapting human videofluoroscopic swallow study (VFSS) methods to murine models enables early detection of dysphagia phenotypes in preclinical disease models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative and neuromuscular drug development. This approach provides functional biomarkers that bridge behavioral assays with clinical endpoints, improving predictive confidence in lead identification and preclinical progression decisions. By quantifying swallow physiology in freely behaving rodents, the method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying swallow physiology as a functional readout of brainstem and neuromuscular circuit integrity.
- Operational Value: Enables behavioral conditioning and voluntary feeding in confined spaces, reducing stress-induced variability in murine phenotyping.
- Scientific Value: Supports biological de-risking of targets involved in swallowing control, such as SOD1 in ALS models, by linking genetic manipulation to measurable dysphagia phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by standardizing swallow parameter quantification via frame-by-frame video analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through blinded dual-reviewer consensus and defined drinking bout criteria.
- Scientific Value: Highlights screening readiness and scalability by enabling rapid testing of multiple mice per session with remote-controlled chamber positioning.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by detecting genotype-specific differences in swallow rate and inter-swallow interval in SOD1 mice versus controls.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by providing quantifiable VFSS parameters that correlate with disease progression.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying 13 consistently quantifiable swallow parameters using low-energy fluoroscopy, nearly doubling the detection sensitivity compared to high-energy systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of targets affecting bulbar function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by quantifying swallow mechanics as a proxy for neural circuit function in disease models.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through standardized protocols, blinded analysis, and consensus-driven parameter measurement.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including swallow rate, inter-swallow interval, and bolus transit timing derived from frame-by-frame VFSS video analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by demonstrating genotype-dependent differences in swallow physiology that mirror clinical dysphagia endpoints.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized chamber design, flavored contrast agent protocols, and remote-operated imaging setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in brainstem-mediated phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of swallow phenotyping across murine cohorts and laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying dysphagia early in preclinical pipelines.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on functional biomarker data from VFSS in disease models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neurobehavioral testing, video fluoroscopy operation, and frame-by-frame video analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include fluoroscopy systems (preferably low-energy for high-resolution murine imaging), remote-controlled positioning tables, and video editing software for blinded review.
- Cross-team standardization requirements involve harmonizing chamber design, contrast agent preparation (e.g., chocolate-flavored iohexol), and drinking bout selection criteria across sites.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting chamber size, contrast agent palatability, and positional protocols for different rodent strains and disease severities.
- Practical limitations supported by source material include dependency on fluoroscope energy level for parameter detectability, with high-energy systems limiting quantification to seven parameters versus thirteen with low-energy systems.
