Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar napięcia mięśni gładkich. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie i przygotowanie tkanek, a następnie zamocowanie tkanki w izolowanej kąpieli tkankowej.

Następnie sprawdza się żywotność tkanki i dokonuje pomiarów skurczu izometrycznego. Ostatecznie preparat tkanki izolowanej w kąpieli służy do badania funkcji receptorów, sygnalizacji receptorowej oraz reaktywności mięśni gładkich. Ogólnie rzecz biorąc, głównymi zaletami tej techniki są elastyczność systemu, szybkość uzyskiwania wyników oraz zachowanie ciągłości całej tkanki.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, w której wykorzystuje się leki do oddziaływania na sygnalizację receptorową lub mięśnie gładkie. Należy zwrócić szczególną uwagę na kilka aspektów przygotowania. Niezbędne jest wstępne podgrzanie systemu kąpieli tkankowej do 37 °C poprzez włączenie recyrkulacyjnej kąpieli wodnej. Woda musi wpływać do każdego elementu przez najniższe złącze kolczaste i wypływać przez najwyższe złącze kolczaste.

Każdy komponent musi zostać podłączony. Przetworniki siły należy skalibrować i uruchomić co najmniej 15 minut przed eksperymentem, aby ich temperatura ustabilizowała się. Następnie, podczas podłączania gazu, należy sprawdzić szczelność układu, a następnie go nadmuchać.

Po napełnieniu układu roztworem należy go zaprawić i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wskazane jest również przetestowanie napowietrzaczy komory z tkanką. Prawidłowe napowietrzanie zapewni skuteczne rozprowadzenie leków, nie destabilizując jednocześnie tkanki bezpośrednio przed eksperymentem.

Przeprowadź sekcję tkanki. Po znieczuleniu szczura, za pomocą nożyczek wywołaj odmę opłucnową. Przetnij przeponę u dołu klatki piersiowej.

Następnie wykonaj nacięcie od dołu klatki piersiowej do mostka i rozdziel tkanki. Usuń organy znad kolumny kręgowej, aby odsłonić aortę, która biegnie bezpośrednio wzdłuż kręgosłupa. Teraz przetnij wszystkie połączenia z aortą i odetnij aortę prostopadle do kręgosłupa na wysokości przepony.

Następnie delikatnie chwyć aortę i oddziel ją od kręgosłupa. Zacznij w dolnej części przepony, w sąsiedztwie kręgosłupa, i kieruj się w stronę serca. Należy zachować ostrożność, aby nie ciągnąć ani nie szarpać tkanki aorty, ponieważ może to doprowadzić do jej natychmiastowego uszkodzenia.

Umieść aortę w szalce do sekcji zawierającej PSS. Następnie weź drut i zagnij go pod niewielkim kątem 90 stopni. Jeden z końców, ten zagięty, przymocuj do podstawy szalki do sekcji.

Następnie ostrożnie wprowadź drut prowadzący do światła aorty i nasuń aortę na drut. Gdy wolny koniec drutu stanie się widoczny, delikatnie go zagnij i wciśnij w podstawę, stabilizując w ten sposób tkankę. Teraz, używając małych nożyczek naczyniowych i pincety, usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową oraz inne zbędne tkanki, aż aorta piersiowa stanie się biała i lekko włóknista.

Po usunięciu nadmiaru tkanek ostrożnie zdejmij oczyszczoną aortę z drutu. Zakończ ten etap, przecinając aortę na pierścienie o szerokości od trzech do pięciu milimetrów. Otrzymano pierścień aorty.

Przygotowano dwa haki tkankowe z szwami w celu ich przymocowania w komorze kąpieli. Jeden hak powinien posiadać szew z małą zawiązaną pętlą do przymocowania do pręta. Drugi hak wymaga fragmentu szwu o długości od 10 do 14 cm.

Aby zawiązać węzeł, ostrożnie przymocuj parę takich haków tkankowych do każdego pierścienia aortalnego. Należy uważać, aby nie poplątać haków. Następnie przenieś każdy fragment tkanki do naczynia z PSS o temperaturze pokojowej, w którym uchwyt tkankowy jest przymocowany do statywu.

Następnie nasuń zawiązany pętlę na kołek pręta i użyj długiego odcinka nici chirurgicznej, aby unieść tkankę. Potem umieść pręt w komorze i upewnij się, że jest on stabilnie zamocowany. Teraz przywiąż nić z pozostałego haczyka do przetwornika siły.

Pozostaw odpowiedni luz w szwie, aby naprężenie między przetwornikiem siły a tkanką mogło być regulowane za pomocą mikrometru. Powtórz ten proces dla każdego pierścienia w każdej komorze. Następnie ustaw napięcie bierne.

Użyj mikrometru, aby zwiększyć naprężenie do 2 g i poczekaj, aż naprężenie tkanki przestanie rosnąć. Następnie zwiększ naprężenie o kolejne 2 g i ponownie poczekaj na zmianę naprężenia. To koniec.

Napięcie powinno teraz wynosić około 3,2 g. Powtórz ten proces dla każdego pierścienia w każdej komorze. Po ustawieniu wszystkich napięć pasywnych pozostaw tkanki na godzinę w celu wyrównania stanu równowagi.

W tym czasie wymieniaj PSS co 15 minut i dokonuj pozostałych przygotowań do eksperymentu, takich jak przygotowanie leków przed końcem okresu równoważenia. Przepłucz tkankę po raz ostatni, zapisz dane i zresetuj wszystkie parametry wejściowe. Następnie, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, przeprowadź wstępną stymulację.

Należy pamiętać o udokumentowaniu tych działań w oprogramowaniu. Po początkowej stymulacji zmiana napięcia osiągnie poziom plateau. Następnie należy wypłukać lek stymulujący, aby napięcie tkanki powróciło do poziomu bazowego.

Pozostawić tkankę w tym napięciu bazowym przez około 10 minut, a następnie przenieść jedną do kąpieli z nośnikiem, w tym przypadku wodą, a drugą do drugiej kąpieli. Dodać odpowiednią ilość prazosyny, aby uzyskać stężenie 5 nM w kąpieli. Inkubować tkanki w kąpielach przez godzinę bez przemywania.

W międzyczasie przygotuj roztwór fenolu w szerokim zakresie stężeń zgodnie z krzywą logarytmiczną. Po godzinie dodaj do kąpieli agonistę fenolu w rosnących stężeniach, aby uzyskać kumulacyjną odpowiedź stężeniową. Po każdym dodaniu odczekaj, aż odpowiedź tkankowa osiągnie plateau, przed dodaniem kolejnego stężenia.

Kontynuuj dodawanie kolejnych dawek, dopóki nie przestaną one zmieniać napięcia tkanki lub do momentu osiągnięcia plateau całej krzywej odpowiedzi. Aortę piersiową inkubowano w obecności antagonisty receptorów alfa-1 adrenergicznych POZ sim przez jedną godzinę przed dodaniem do kąpieli tkankowej agonisty receptorów alfa-1 adrenergicznych phenyl rine w celu wygenerowania kumulacyjnych krzywych odpowiedzi skurczowej oraz wyznaczenia maksymalnego i połowicznego maksymalnego skurczu wywołanego przez phenyl rine. Tkanki kontrolne traktowane samym nośnikiem zaznaczono kolorem zielonym.

Wartość połowy maksimum określa stężenie efektywne leku. Te same pomiary dla tkanki traktowanej razynem przedstawiono na czarno. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej.