Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych
19 stycznia 2015
Ten protokół opisuje pomiar izometrycznego skurczu w izolowanym preparacie mięśni gładkich, przy użyciu systemu izolowanej kąpieli tkankowej i komputerowej akwizycji danych.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar napięcia mięśni gładkich. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie i przygotowanie tkanek. Drugim krokiem jest zamontowanie tkanki w izolowanej kąpieli tkankowej.
Następnie badana jest żywotność tkanki i wykonywane są izometryczne pomiary skurczu. Ostatecznie preparat do kąpieli tkankowej izolowanej służy do badania funkcji receptora, sygnalizacji receptora i reaktywności mięśni gładkich. Ogólnie rzecz biorąc, głównymi zaletami tej techniki są elastyczność systemu, szybkość osiągania wyników i utrzymanie całej tkanki w stanie nienaruszonym.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania W każdej dziedzinie, w której wykorzystuje się leki do zakłócania sygnalizacji receptorów lub duszy mięśni gładkich, Istnieje kilka preparatów, na które należy zwrócić uwagę. Bardzo ważne jest, aby podgrzać system kąpieli tkankowej do 37 stopni Celsjusza poprzez włączenie recyrkulacyjnej łaźni wodnej. Woda musi wpływać do każdego elementu na najniższym połączeniu kolczastym i wypływać na najwyższym połączeniu kolczastym.
Każdy komponent musi być połączony. Przetworniki siły powinny być skalibrowane i muszą być również włączone co najmniej 15 minut przed eksperymentem, aby doprowadzić ich temperaturę do równowagi. Następnie, podłączając gaz, sprawdź, czy nie ma wycieków, a następnie zwiększ ciśnienie w systemie.
Po napełnieniu układu roztworem należy go zalać i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Uzasadnione jest również przetestowanie aeratorów do kąpieli tkankowej. Dobre napowietrzenie skutecznie rozprowadzi leki, ale nie zdestabilizuje tkanki bezpośrednio przed eksperymentem.
Wypreparuj tkankę. Po znieczuleniu szczura utwórz odmę opłucnową za pomocą nożyczek. Przekleństwo wzdłuż przepony na dole klatki piersiowej.
Następnie przeciąć od dołu klatki piersiowej do mostka i przeciąć tkankę na pół. Oczyść narządy nad kręgosłupem, aby zlokalizować aortę, która znajduje się bezpośrednio wzdłuż kręgosłupa. Teraz przetnij wszystkie połączenia z aortą i przetnij aortę prostopadle do kręgosłupa na poziomie przepony.
Następnie delikatnie przytrzymaj aortę i wypreparuj aortę z kręgosłupa. Zacznij w dolnej części przepony przylegającej do kręgosłupa i pracuj w kierunku serca. Uważaj tylko, aby nie ciągnąć ani nie szarpać tkanki aorty, ponieważ może to natychmiast ją uszkodzić.
Umieść aortę w naczyniu preparacyjnym zawierającym PSS. Teraz weź drut i ustaw mały kąt 90 stopni. Na jednym końcu zakotwicz kątowy koniec drutu w podstawie naczynia preparacyjnego.
Następnie ostrożnie wkręć drut doprowadzający w światło aorty i wsuń aortę na drut. Gdy wolny koniec drutu stanie się widoczny, delikatnie go zegnij i wepchnij w podkład, stabilizując w ten sposób tkankę. Teraz za pomocą małych nożyczek i kleszczy Venus usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową i inne obce tkanki, aż aorta piersiowa stanie się biała i nieco włóknista.
Po oczyszczeniu z nadmiaru tkanek ostrożnie usuń czystą aortę z drutu. Zakończ tę sekcję, przecinając aortę na pierścienie o szerokości od trzech do pięciu milimetrów. Reach pierścień aortalny.
Przygotuj dwa haczyki na chusteczki z szwami, aby zabezpieczyć je w komorze kąpieli. Jeden haczyk powinien mieć szew z małą zawiązaną pętelką do przymocowania do pręta. Drugi haczyk wymaga kawałka szwu o długości od 10 do 14 centymetrów.
Aby zawiązać węzeł, ostrożnie przymocuj parę tych haczyków na tkanki do każdego pierścienia aorty. Uważaj, aby nie zaplątać haczyków. Następnie przenieś każdy kawałek tkanki do naczynia PSS o temperaturze pokojowej z uchwytem na chusteczki przymocowanym do stojaka na pierścionki.
Następnie wsuń zawiązaną pętlę na kołek pręta i użyj długiego kawałka szwu, aby przytrzymać tkankę. Następnie włóż pręt do komory i upewnij się, że pręt jest dobrze zamocowany. Teraz przywiąż szew z pozostałego haczyka do przetwornika siły.
Pozostaw wystarczająco dużo luzu w szwie, aby napięcie między przetwornikiem siły a tkanką można było regulować za pomocą mikrometru. Powtórz ten proces dla każdego pierścienia w każdej komorze. Teraz ustaw napięcie pasywne.
Użyj mikrometru, aby zwiększyć napięcie do dwóch gramów i poczekaj, aż napięcie tkanki przestanie rosnąć. Następnie zwiększ napięcie o kolejne dwa gramy i ponownie poczekaj na zmianę napięcia. Skończyć.
Napięcie powinno teraz wynosić około 3,2 grama. Powtórz ten proces na każdym pierścieniu w każdej komorze. Po ustawieniu wszystkich napięć pasywnych pozwól tkankom zrównoważyć się przez godzinę.
W tym czasie należy wymieniać PSS co 15 minut i dokonywać innych przygotowań do eksperymentu, takich jak przygotowanie leków pod koniec okresu równowagi. Umyj chusteczkę po raz ostatni, zapisz dane i ponownie wprowadź wszystkie dane. Następnie, postępując zgodnie ze szczegółami w protokole tekstowym, podejmij wstępne wyzwanie.
Pamiętaj, aby udokumentować te działania w oprogramowaniu. Po początkowym wyzwaniu zmiana napięcia ustabilizuje się. Następnie wypłucz lek prowokacyjny, aby ton tkanki osiągnął linię podstawową.
Pozwól tkance spocząć na tym podstawowym tonie przez około 10 minut, teraz do jednej kąpieli w pojeździe w tym przypadku, wody do drugiej. Dodać do kąpieli wystarczającą ilość prazycyny o stężeniu pięciu nanomolowych. Pozwól kąpielom tkankowym inkubować przez godzinę bez mycia.
W międzyczasie napraw fenol rine w szerokim zakresie stężeń wzdłuż krzywej logarytmicznej. Po godzinie dodać do kąpieli agonistę fenyloryny w rosnących stężeniach, aby uzyskać skumulowaną odpowiedź stężenia. Po każdym dodaniu poczekaj, aż odpowiedź tkanek osiągnie plateau, zanim dodasz kolejne stężenie.
Kontynuuj dodawanie, aż przestaną zmieniać odcień tkanki lub aż cała krzywa odpowiedzi ustabilizuje się. Zamiast tego aortę piersiową inkubowano w antagoniście receptora adrenergicznego alfa jednego POZ sim przez godzinę przed dodaniem agonisty alfa jednego adrenergicznego fenyloryny do kąpieli tkankowej i wygenerowaniem kumulatywnych krzywych odpowiedzi skurczowej na maksymalne i połowy maksymalnych skurczów fenyloryny. Na samym pojeździe tkanki kontrolne są oznaczone kolorem zielonym.
Połowa maksimum określa skuteczne stężenie leku. Te same wymiary dla tkanki poddanej działaniu raziny są widoczne w kolorze czarnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć funkcję mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej.
Przegląd
Ten protokół opisuje pomiar skurczu izometrycznego w izolowanej mięśniówce gładkiej z wykorzystaniem systemu kąpieli tkankowej. Szczegółowo opisuje przygotowanie i badanie tonusu mięśni gładkich, podkreślając znaczenie utrzymania żywotności tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Fizjologia
- Farmakologia
Tło
- Pomiar skurczu izometrycznego jest kluczowy dla zrozumienia funkcji mięśni gładkich.
- Izolowany system kąpieli tkankowej umożliwia kontrolowane eksperymenty.
- Głównymi zaletami tej techniki są elastyczność i szybkie wyniki.
- Ta metoda może odpowiedzieć na pytania dotyczące sygnalizacji receptorów i reaktywności mięśni gładkich.
Cel badania
- Pomiar tonusu mięśni gładkich w izolowanych preparatach.
- Ocena funkcji receptorów i sygnalizacji w mięśniach gładkich.
- Ocena wpływu środków farmakologicznych na reaktywność mięśni.
Zastosowanie metod
- Sekcjonowanie i przygotowanie tkanki z aorty szczura.
- Montaż tkanki w izolowanej kąpieli tkankowej.
- Kalibracja przetwornika siły i konfiguracja systemu.
- Pomiar skurczu izometrycznego w odpowiedzi na agonisty.
Główne wyniki
- Skuteczna pomiar skurczu izometrycznego w pierścieniach aorty.
- Ustanowienie krzywych koncentracja-odpowiedź dla fenylefryny.
- Porównanie odpowiedzi skurczu w tkankach leczonych i kontrolnych.
- Identyfikacja skutecznych stężeń środków farmakologicznych.
Wnioski
- Izolowany system kąpieli tkankowej jest skuteczny w badaniu dynamiki mięśni gładkich.
- Ta metoda dostarcza informacji na temat skurczu pośredniczonego przez receptory.
- Wyniki mogą informować o interwencjach farmakologicznych ukierunkowanych na mięśnie gładkie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The isolated tissue bath assay enables precise measurement of smooth muscle contractility, providing critical data for target validation in cardiovascular and metabolic disease programs. By quantifying agonist potency and antagonist efficacy in intact tissue, this method supports mechanistic de-risking of pharmacological interventions before lead optimization. Its reproducibility and scalability make it a valuable tool for early discovery workflows requiring functional validation of vascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates receptor signaling pathways through concentration-response analysis of contractile agonists.
- Operational Value: Enables functional validation of targets such as adrenergic receptors in a physiologically relevant tissue context.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying drug effects on tissue tone and contractile response.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible isometric contraction data suitable for compound screening cascades.
- Standardization: Supports development of standardized protocols for evaluating vascular reactivity across laboratories.
- Scalability: Compatible with various tissue sizes, enabling cross-species extrapolation from rodent to large animal models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models vascular smooth muscle function in hypertension and atherosclerosis research.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical efficacy by maintaining tissue integrity and physiological responsiveness.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical candidate selection based on functional contractility data rather than binding affinity alone.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated tissue bath functions as a discovery-stage assay that informs target selection and lead identification by providing functional readouts of receptor-mediated smooth muscle responses.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about receptor function and signaling in native tissue environments.
- Screening: Delivers EC50 and Emax values that enable rank-ordering of compounds by potency and efficacy.
- Analytics: Produces concentration-response curves that support quantitative comparison of pharmacological agents.
- Translational Research: Maintains physiological relevance to support extrapolation to disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating vascular targets across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into receptor-mediated contractions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible outputs through computer-based data acquisition and analysis.
- Strategic Value: Improves prediction of clinical translatability by assessing drug effects in intact tissue.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on functional vascular activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, mounting, and viability testing.
- Dependent on force transducers, analog-to-digital converters, and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates standardized solutions (e.g., PSS) and equilibration protocols to ensure data consistency.
- Must account for tissue-specific contractile properties when extrapolating across models.
- Limited to ex vivo tissue viability windows, requiring timely experimentation post-dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Notes on Preparing the System
2:17
Preparing the Aortic Rings
4:31
Setting-up the Aortic Rings in the Tension Apparatus
6:31
Initial Challenge and Experimentation
8:00
Results: Scoring the Half-maximum Values for Phenylephrine
8:45
Conclusion
