Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Ogólnym celem poniższych procedur jest zapewnienie środków umożliwiających badanie przyczyny i skutku magalii komorowej oraz podkreślenie technik, które umożliwiają badanie zdrowia układu komorowego i jego ważnych funkcji barierowych i filtracyjnych w mózgu. Osiąga się to poprzez zbieranie wycinków koronalnych mózgu myszy lub skanów MRI ludzkiego mózgu w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D komór i obliczenia objętości komór jako drugiego etapu tkanka pośmiertna, która obejmuje preparaty en foss powierzchni wierzchołkowej komór, jest barwiona przeciwciałami specyficznymi dla komórek, aby ujawnić integralność komórkową wyściółki komory. Następnie przygotowywany jest montaż organizacji komórkowej na całej powierzchni komory i renderowany na modelu 3D komory, aby pokazać regiony glejozy w porównaniu z nienaruszonymi komórkami dołączonymi.

Wyniki pokazują obszary rozszerzania się komór w oparciu o podłużne modelowanie 3D komór i obszarów, w których warstwa komórek dołączonych błony śluzowej komory nie jest już nienaruszona, ale zastąpiona bliznami glejowymi. Łącząc dane modelowania 3D z danymi immunohistochemicznymi, można wygenerować mapę 3D składu komórkowego wyściółki komory. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę uszkodzenia mózgu, chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i normalne starzenie się, z których wszystkie zwykle wykazują pewien poziom rozszerzania się komór, a tym samym prawdopodobną skoliozę powierzchni komory.

Demonstracją procedur na myszach będzie Richard Wolffer i student studiów licencjackich z naszych procedur laboratoryjnych wykonanych przy użyciu danych z ludzkiego rezonansu magnetycznego i pośmiertnej tkanki ludzkiej zostanie zademonstrowana przez yeun. Obecnie studiuje medycynę, a Rebecca Chu jest studentką w laboratorium. Przygotuj preparaty do obrazowania, ustalając sekcje, barwienie immunologiczne i montując mózg myszy, jak opisano w pisemnej części protokołu Aby rozpocząć procedurę, aby prześledzić boczne komory myszy, włącz pionowy mikroskop fluorescencyjny i komputer, mikroskop powinien być wyposażony w zautomatyzowany stolik i cyfrową kamerę CCD.

Uruchom oprogramowanie do mapowania w trybie fluorescencji, otwórz opcje wyświetlania, aby załadować paski narzędzi i panele puli dokowania potrzebne do śledzenia. Następnie kliknij opcje, wyświetl opcje akcesoriów i wybierz paski narzędzi główny i znacznik w tym samym menu. W panelach puli dokowania wybierz histogram kamery, sterowanie wielokanałowe, ustawienia kamery i akwizycję obrazu.

Zidentyfikuj pierwszy fragment tkanki zawierający komory boczne na podstawie silnej fluorescencji beta S 100, która znakuje komórki dołączone. Wyściełanie komory bocznej. Zorientuj lewą i prawą półkulę, identyfikując małe nacięcie wykonane podczas cięcia.

Teraz utwórz nowy plik danych i wyznacz punkt odniesienia dla ruchu sceny, klikając w oknie obrazu nad lewą komorą boczną. Utrzymuj ten punkt odniesienia w spójnym położeniu względem komór bocznych w plikach śledzenia. Aby ułatwić importowanie konturów do rekonstrukcji seryjnej, wybierz odpowiedni wstępnie ustawiony typ konturu z menu rozwijanego konturu.

Użyj unikalnego koloru dla każdego z tras lewej i prawej bocznej komory. Teraz kliknij wzdłuż całej powierzchni wierzchołkowej wyściółki dołączki, aby prześledzić kontur komory. Przesuwanie okna śledzenia za pomocą strzałek.

Po obrysowaniu konturu kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz zamknij kontur. Powtórz śledzenie dla prawej komory, używając innego koloru. Następnie wybierz odpowiedni znacznik z paska narzędzi znaczników po lewej stronie i kliknij, aby upuścić znacznik na ekranie śledzenia wzdłuż linii środkowej, aby pomóc w wyrównaniu konturów szeregowych do rekonstrukcji 3D.

Powtórz tę procedurę, aby zrobić drugi znak. Zapisz ślady tkankowe, wybierając plik Zapisz plik danych jako i utwórz nowy folder i nazwę pliku, ponumeruj ślady zgodnie z konwencją, numer slajdu, kreska, numer tkanki w celu łatwej identyfikacji śladów z odcinków seryjnych. Następnie powtórz procedurę pokazaną właśnie dla wszystkich odcinków zawierających komorę.

Aby wykonać rekonstrukcję 3D komory bocznej. Otwórz program do rekonstrukcji 3D. Następnie kliknij plik Otwórz i wybierz plik konturu pierwszej sekcji seryjnej śledzenia.

Zaimportuj wszystkie ślady konturów lewej i prawej komory, a także wszelkie dodane znaczniki. Wyrównaj kontury zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu. Następnie zaznacz wszystkie kontury w panelu po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk Wizualizacja 3D, aby wyświetlić ostateczną rekonstrukcję 3D.

Ten obraz przedstawia przekrój mózgu myszy koronalnej, w tym komory boczne zarysowane przez immunoreaktywne komórki dołączkowe S 100 beta. Gwiazdka oznacza komory boczne. Nawiasy wyznaczają przyczepność, a podziałka reprezentuje 500 mikronów.

Boczne komory myszy są śledzone jako kontury i ułożone jako sekcje podsegmentów. Obszary wewnątrzkomorowe są eliminowane z zakłócania analizy objętościowej. Zdjęcie przedstawia ostateczną rekonstrukcję 3D konturów komór bocznych.

Kolor żółty reprezentuje kontur całych objętości mózgu obejmujących obszar zainteresowania zawierający komory boczne. Powinieneś dobrze rozumieć, jak tworzyć rekonstrukcje 3D komór pokrojonej tkanki mózgowej Corona Wymienione są protokoły tworzenia rekonstrukcji obrazu 3D i wolumetrycznej kwantyfikacji komór bocznych oraz oceny zmian objętościowych w czasie za pomocą podłużnej analizy nakładki, ważne jest, aby pamiętać, że spójność w MR. Gromadzenie danych R i przetwarzanie po akwizycji są niezwykle ważnymi kryteriami włączenia zestawów danych Aby przeprowadzić segmentację komór, ITK SNAP służy do segmentacji komór na podstawie obrazów MR o wysokiej rozdzielczości T one ważonych. Po uruchomieniu programu otwórz obraz w skali szarości, wybierz żądany plik i otwórz go jako ładny plik.

Następnie przewiń każdą płaszczyznę anatomiczną i zwróć uwagę na nieprawidłowości komorowe, takie jak okolice nosa, duże lub małe rogi skroniowe itp. Następnie w głównym przyborniku kliknij węża, narzędzie ROI. Następnie podziel obszar na segmenty 3D i wybierz opcję regionu intensywności.

Teraz kliknij obraz przed przetwarzaniem i wybierz powyżej. Zapisz maksymalną intensywność za pomocą suwaka. Następnie ustaw próg na 15%maksymalnej intensywności i zapisz tę wartość.

Powinno to podświetlić zwrot z inwestycji na biało. Ustaw parametr gładkości na 10. Kliknij w porządku.

Potem dalej. Następnie dodaj od 10 do 12 małych pęcherzyków do każdej komory. Dwa w rogu przednim czołowym, siedem równomiernie rozmieszczonych wzdłuż górnej powierzchni korpusu komory bocznej, jeden w rogu potylicznym i jeden w rogu skroniowym komory bocznej.

Następnie wybierz parametry i ustaw siłę krzywizny na 0,4. Następnie kliknij symbol odtwarzania, aby rozpocząć aktywną ewolucję konturu. Teraz kliknij aktualizuj siatkę, aby zwizualizować powierzchnię.

Następnie sprawdź automatyczną aktualizację. Zatrzymaj proces segmentacji, gdy wszystkie obszary komory bocznej znajdą się w obszarze zainteresowania. Unikaj włączenia trzeciej komory.

Na koniec kliknij Zakończ i zapisz wyniki segmentacji w sprytnym formacie pliku. Aby uzyskać całkowitą objętość komory, wybierz segmentację, objętość i statystyki, aby uzyskać całkowitą objętość komory za pomocą ustawionej kolorowej etykiety. W tym segmencie podłużne ROI są nakładane za pomocą oprogramowania mango, aby jakościowo i ilościowo wykazać zmiany objętości komór u badanych w czasie.

Po otwarciu oprogramowania kliknij otwórz, otwórz plik załaduj wcześniej zapisany fajny plik. Po załadowaniu pliku obrazu kliknij opcję file load ROI (załaduj zwrot z inwestycji) i załaduj zwrot z inwestycji w punkt czasowy bazowego zwrotu z inwestycji w kolor zielony. Kliknij plik załaduj ROI i załaduj drugi punkt czasowy ROI na czerwono.

Zapisz nakładkę podłużną, wybierając opcję zapisywania pliku ROI, przypisz każdemu obrazowi nazwę pliku zgodnie z konwencją wyświetlaną teraz na ekranie. Następnie otwórz przystawkę ITK. Następnie ponownie otwórz połączony zwrot z inwestycji jako połączony zwrot z inwestycji w obrazie w skali szarości, wybierając obciążenie segmentacyjne z połączonego pliku ROI obrazu, aby uzyskać dane dotyczące objętości podłużnej, uruchom następujący wolumin segmentacji i statystyki.

Etykieta jedna czerwona oznacza objętość ekspansji, etykieta druga zielona oznacza objętość zwężenia, trzy niebieskie oznaczają objętość podstawową, zaczynając od nienaruszonej półkuli, która została utrwalona w 10% Forminie przez maksymalnie sześć tygodni i dokładnie spłukana 0,1 molowym plastrem PBS, 1,5 centymetra grubości przekroje koronalne przez całą półkulę za pomocą dużego noża za pomocą skalpela mikrochirurgicznego. Rozetnij ścianę komory na głębokość jednego centymetra, zachowując jeden ciągły odcinek dla całej ściany bocznej, podziel ścianę w razie potrzeby, aby stworzyć sekcje o odpowiedniej wielkości do barwienia. Dobrze naciąć sekcję po przeciwnej stronie ściany komory.

Aby zidentyfikować górną dolną orientację, wykonaj chemię immunohisto i zamontuj sekcje zgodnie z pisemnym protokołem. Pod lunetą sekcyjną zabezpiecz tkankę za pomocą szpilek z mikrochirurgicznym nożem do kłucia, utwórz jednolicie cienki odcinek ściany bocznej komory i zamontuj penisa na boku na szkiełku Gdy szkiełka są całkowicie suche, zbadaj skrawki za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Ustaw płaszczyznę ogniskową obrazowania na powierzchni komory, jak określono za pomocą beta-kateniny, markera przylegania wierzchołkowego.

Białka połączeniowe komórek dołączanych. Następnie nakreśl obszary pokrycia komórek dołączonych i astroglejozy powierzchniowej zgodnie z barwieniem GFAP na powierzchni komory, aby udokumentować i zmontować całą powierzchnię komory. Użyj nakładających się obrazów całej powierzchni, aby utworzyć montaż obrazów szeregowych.

Otwórz program Adobe Photoshop i użyj interaktywnego układu automatyzacji automatycznego wyłaniania plików, aby wybrać obrazy do nałożenia, w razie potrzeby wprowadzając ręczne korekty. Utwórz nową warstwę do śledzenia montażu, aby wygenerować kreskówkową reprezentację nienaruszonego. W zależności od pokrycia komórek lub skoliozy G powierzchni komory, skompiluj wszystkie sekcje, aby zrekonstruować mapę ściany komory i połączyć z odpowiednim regionem na rekonstrukcji MRI.

To jest montaż obrazów MR człowieka. Komora boczna została zdefiniowana na czerwono jako obszar zainteresowania. Rekonstrukcja obrazu 3D, jak pokazano tutaj, pozwala na wolumetryczną kwantyfikację i jakościową wizualizację komory bocznej.

Obraz ten przedstawia ocenę podłużnego rozszerzania się komory u pacjenta w podeszłym wieku. Podłużne rezonanse magnetyczne z wielu punktów można wyrównać i nałożyć na siebie, aby uwidocznić i określić ilościowo rozszerzanie się objętości komór u pacjentów w czasie. Te trzy ostatnie obrazy pokazują ocenę immunohistochemiczną i mapowanie regionalne powierzchni komory bocznej człowieka. Tu.

Obszary nienaruszonych komórek dołączkowych zarysowane przez beta catine i barwienie mają wygląd kostki brukowej, jak wskazano gwiazdką, i są wyznaczone przerywaną linią od obszarów astroglejozy na powierzchni komory nakreślonych przez barwienie GFAP. Seryjne obrazy konfokalne są nakładane w celu wygenerowania montażu regionalnego i śledzone za pomocą programu Adobe Photoshop lub kreskówkowej reprezentacji organizacji komórkowej na powierzchni komory. Ten kreskówkowy obraz montażu jest odwzorowywany na powierzchni komory na odpowiedniej rekonstrukcji 3D komory opartej na rezonansie magnetycznym.

Jak pokazano, zielony kolor oznacza nienaruszony dodatek i czerwone obszary glejozy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować staranną dokumentację każdej próbki tkanki w celu przeprowadzenia seryjnej rekonstrukcji i mapowania integralności komórkowej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak subsegmentacja komór bocznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspansji specyficznej dla regionu w czasie.