Name: Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 26 s
Description: Poznaj metody 3D rekonstrukcji komór bocznych mózgu z wykorzystaniem MRI i analizy immunohistochemicznej u myszy i ludzi. Technika ta umożliwia badanie zmian objętościowych oraz integralności komórek wyściełających komory.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

An NINDS Grant NS05033 (JCC) wsparł tę pracę. Programy University of Connecticut RAC, SURF i OUR zapewniły dodatkowe wsparcie.

<ol><li>Del Bigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ependymal+cells%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Ependymal cells: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).</li>
<li>Johanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distributional+nexus+of+choroid+plexus+to+cerebrospinal+fluid%2C+ependyma+and+brain%3A+toxicologic%2Fpathologic+phenomena%2C+periventricular+destabilization%2C+and+lesion+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread.</a> Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).</li>
<li>Roales-Bujan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+acquire+morphological+and+functional+characteristics+of+ependymal+cells+following+disruption+of+ependyma+in+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus.</a> Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).</li>
<li>Cserr, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of the choroid plexus.</a> Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4, 147ra111(2012).</li>
<li>Shook, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventriculomegaly+associated+with+ependymal+gliosis+and+declines+in+barrier+integrity+in+the+aging+human+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain.</a> Aging Cell. , (2013).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342, 373-377 (2013).</li>
<li>Fazekas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+correlates+of+incidental+MRI+white+matter+signal+hyperintensities%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities.</a> Neurology. 43, 1683-1689 (1993).</li>
<li>Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+white+matter+atrophy+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related white matter atrophy in the human brain.</a> Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).</li>
<li>Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+magnetic+resonance+imaging+studies+of+older+adults%3A+a+shrinking+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).</li>
<li>Sener, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callosal+changes+in+obstructive+hydrocephalus%3A+observations+with+FLAIR+imaging%2C+and+diffusion+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Med+Imaging+Graph%22%5BJournal%5D)">Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI.</a> Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).</li>
<li>Sze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foci+of+MRI+signal+%28pseudo+lesions%29+anterior+to+the+frontal+horns%3A+histologic+correlations+of+a+normal+finding%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding.</a> AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).</li>
<li>Tisell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shunt+surgery+in+patients+with+hydrocephalus+and+white+matter+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes.</a> Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).</li>
<li>Valdes Hernandez Mdel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+segmentation+of+brain+white+matter+and+white+matter+lesions+in+normal+aging%3A+comparison+of+five+multispectral+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques.</a> Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).</li>
<li>Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+changes+to+the+subventricular+zone+stem+cell+pool+through+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+neurogenic+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The aging neurogenic subventricular zone.</a> Aging Cell. 5, 139-152 (2006).</li>
<li>Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-mediated+ependyma+repair+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain.</a> J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).</li>
<li>Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+series+of+imaging+studies%3A+longitudinal+MRI+data+in+nondemented+and+demented+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cogn+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults.</a> J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).</li>
<li>Giorgio, A., De Stefano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+brain+volumetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Clinical use of brain volumetry.</a> J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).</li>
<li>Caspers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+variability+in+human+brain+aging+in+a+population-based+German+cohort-rationale+and+design+of+1000BRAINS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS.</a> Front Aging Neurosci. 6, 149(2014).</li>
<li>Keuken, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+7T+MRI+of+structural+age-related+changes+of+the+subthalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).</li>
<li>Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Multimodality imaging techniques.</a> Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+olfactory+bulb+neurons+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The age of olfactory bulb neurons in humans.</a> Neuron. 74, 634-639 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+neuroblasts+in+the+subventricular+zone+and+rostral+migratory+stream+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain.</a> Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).</li>
<li>Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+proliferation+on+the+surface+of+the+adult+rat+striatal+wall+after+focal+ependymal+loss+by+intracerebroventricular+injection+of+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy narzędzia i protokoły, które można wykorzystać do oceny integralności układu komorowego mózgu u myszy i ludzi. Narzędzia te można jednak również zastosować do innych struktur mózgu lub układów narządów, które ulegają zmianom w wyniku urazu, choroby lub w procesie starzenia się 14,21,22. Przedstawione strategie wykorzystują oprogramowanie, które umożliwia wyrównanie przekrojowych i podłużnych sekwencji MRI w celu wygenerowania reprezentacji 3D objętości określonych regionów lub struktur będących p...

Monowarstwa komórek wyściółki wyściela układ komorowy mózgu, zapewniając dwukierunkową barierę i funkcje transportowe między płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) a płynem śródmiąższowym (ISF) 1-3. Funkcje te pomagają utrzymać mózg wolny od toksyn i w równowadze fizjologicznej 2,3. U ludzi utrata części tej wyściółki w wyniku urazu lub choroby nie wydaje się powodować wymiany regeneracyjnej, jak ma to miejsce w przypadku innych wyściółki nabłonkowej; Wydaje się raczej, że utrata pokrycia komórek wyściółki powoduje astroglejozę okołokomorową z siatką astrocytów pokrywającą obszary pozbawione komórek wyściółki na powierzchni komory. Przewiduje się, że utrata tej warstwy nabłonkowej 1,2,4-7 będzie miała poważne reperkusje dla ważnych mechanizmów wymiany i oczyszczania płynów CSF/ISF.
Wspólną cechą starzenia się człowieka jest powiększenie komór bocznych (ventriculomegalia) i związany z tym obrzęk okołokomorowy, co zaobserwowano za pomocą MRI i odzyskiwania inwersji osłabionej płynem MRI (MRI/FLAIR) 8-14. Aby zbadać związek między powiększeniem komór a organizacją komórkową wyściółki komory, pośmiertne sekwencje MRI człowieka dopasowano do preparatów histologicznych tkanki okołokomorowej komór bocznych. W przypadku powiększenia komór znaczne obszary glejozy zastąpiły pokrycie komórkami wyściółki wzdłuż ściany komory bocznej. Gdy ekspansja komory nie została wykryta za pomocą analizy objętości opartej na MRI, wyściółka komórek wyściółki była nienaruszona, a glejoza nie została wykryta wzdłuż wyściółki komory 6. To kombinatoryczne podejście stanowi pierwszą kompleksową dokumentację szczegółowo opisującą zmiany w integralności komórkowej wyściółki komory bocznej przy użyciu całościowego przygotowania porcji lub całej ściany komory bocznej oraz modelowania 3D objętości komór 6. Niektóre choroby (choroba Alzheimera, schizofrenia) i urazy (urazowe uszkodzenie mózgu) wykazują powiększenie komór jako wczesną cechę neuropatologiczną. Przewiduje się, że denuzja obszarów wyściółki komórki wyściółki zakłóca normalne funkcjonowanie komórek wyściółki i narusza równowagę homeostatyczną między wymianą płynu CSF / ISF a substancją rozpuszczoną. Tak więc dokładniejsze badanie zmian w układzie komorowym, jego składzie komórkowym i konsekwencjach dla leżących poniżej lub sąsiednich struktur mózgu ostatecznie zacznie ujawniać więcej na temat neuropatologii związanej z powiększeniem komór.
Brak danych do obrazowania multimodalnego, a w szczególności sekwencji danych podłużnych, wraz z ograniczonym dostępem do odpowiednich histologicznych próbek tkanek utrudnia analizę patologii ludzkiego mózgu. Modelowanie fenotypów występujących w starzeniu się lub chorobie człowieka można często osiągnąć za pomocą modeli mysich, a modele zwierzęce stają się jednym z naszych najlepszych sposobów na zbadanie pytań dotyczących inicjacji i progresji choroby u człowieka. Kilka badań na zdrowych młodych myszach opisało cytoarchitekturę ścian komór bocznych i leżącej pod nimi niszy komórek macierzystych 4,7-15. Badania te zostały rozszerzone o modelowanie 3D i analizę komórkową ścian komór poprzez starzenie się 6,15. U starszych myszy nie obserwuje się ani glejozy okołokomorowej, ani powiększenia komór, raczej myszy wykazują stosunkowo solidną niszę komórek macierzystych strefy podkomorowej (SVZ) przylegającą do nienaruszonej wyściółki komórek wyściółki 6,15. Tak więc uderzające różnice specyficzne dla gatunku istnieją zarówno w ogólnym utrzymaniu, jak i integralności wyściółki komory bocznej podczas procesu starzenia się 6,15. Dlatego, aby jak najlepiej wykorzystać myszy do badania warunków występujących u ludzi, różnice między tymi dwoma gatunkami muszą zostać scharakteryzowane i odpowiednio uwzględnione w każdym paradygmacie modelowania. W tym miejscu przedstawiamy procedury oceny zmian podłużnych w komorach bocznych i związanej z nimi tkance okołokomorowej zarówno u ludzi, jak i myszy. Nasze procedury obejmują renderowanie 3D i wolumetrię komór myszy i ludzi, a także wykorzystanie analizy immunohistochemicznej całych preparatów tkanki okołokomorowej w celu scharakteryzowania zarówno organizacji, jak i struktury komórkowej. Razem procedury te zapewniają środki do scharakteryzowania zmian w układzie komorowym i związanej z nim tkance okołokomorowej.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19210</td><td>Stosować przy 4% w PBS, 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16050</td><td>10% w PBS-TX (v/v)</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210</td><td>10% w PBS-TX (v/v)</td></tr><tr><td>Triton X-100 (TX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,1% w PBS (v/v)</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Imager.M2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA R2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kontroler stopnia</td><td>Ludl Electronic Products</td><td>MAC 6000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do stereologii</td><td>MBF Bioscience</td><td>Stereo Investigator 11</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Stereology</td><td>ImageJ/NIH</td><td>NIH freeware</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji 3D</td><td>MBF Bioscience</td><td>Neurolucida Explorer</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRI Freesurfer</td><td>https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall</td><td>Segmentacja i objętość</td><td></td></tr><tr><td>ITK-Snap</td><td>http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php</td><td></td><td>Segmentacja i analiza objętości</td></tr><tr><td>wielu obrazów GUI (Mango)</td><td>http://ric.uthscsa.edu/mango/ </td><td></td><td>Nakładka wzdłużna</td></tr><tr><td>Całe wyposażenie montażowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22,5&deg; mikrochirurgiczny nóż prosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9854830</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wosk dno naczynie preparacyjne&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szpilki cienkie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aquapolymount</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Whole Mount Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-b-katenina</td><td>BD Bioschiences, San Jose, CA, USA</td><td></td><td>1:250</td></tr><tr><td>koza anty-GFAP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td>1:250</td></tr><tr><td>królik anty-AQP4 (akwaporyna-4)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td>koronalne</tr><tr><td>Przeciwciała anty-S100 i beta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>1:500</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D-1306</td><td>10 &mikro; g/ml w PBS</td></tr></tbody></table>

modelowanie 3d komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

Układ komorowy przenosi i cyrkuluje płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) oraz ułatwia usuwanie substancji rozpuszczonych i toksyn z mózgu. Jednostkami funkcjonalnymi komór są rzęskowe komórki nabłonkowe zwane komórkami wyściółki, które wyściełają komory i poprzez działanie rzęskowe są zdolne do generowania laminarnego przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego na powierzchni komory. Ta monowarstwa komórek wyściółki zapewnia również funkcje barierowe i filtracyjne, które promują wymianę między płynami śródmiąższowymi mózgu (ISF) a krążącym płynem mózgowo-rdzeniowym. Zmiany biochemiczne w mózgu znajdują zatem odzwierciedlenie w składzie płynu mózgowo-rdzeniowego, a zniszczenie wyściółzki może zakłócić delikatną równowagę wymiany płynu mózgowo-rdzeniowego i ISF. U ludzi istnieje silna korelacja między rozszerzaniem się komór bocznych a starzeniem się. Związana z wiekiem powiększenie komór może wystąpić nawet przy braku demencji lub utrudnienia przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego. Dokładna przyczyna i postęp powiększenia komór jest często nieznana; Jednak powiększone komory mogą wykazywać regionalną i często rozległą utratę pokrycia komórek wyściółki z astroglejozą powierzchniową komory i związanym z nią obrzękiem okołokomorowym zastępującym funkcjonalną monowarstwę komórek wyściółki. Korzystając ze skanów MRI wraz z pośmiertną ludzką tkanką mózgową, opisujemy, jak przygotować, zobrazować i skompilować renderingi 3D objętości komór bocznych, obliczyć objętość komór bocznych i scharakteryzować tkankę okołokomorową poprzez analizę immunohistochemiczną preparatów tkankowych ściany bocznej komory en face. Przedstawiono również odpowiednie analizy tkanki mózgowej myszy, co potwierdza wykorzystanie modeli mysich jako środka do oceny zmian w komorach bocznych i tkance okołokomorowej występujących w procesie starzenia się i choroby człowieka. Razem protokoły te umożliwiają badanie przyczyny i skutku powiększenia komór i podkreślają techniki badania zdrowia układu komorowego oraz jego ważnych funkcji barierowych i filtracyjnych w mózgu.

Obrysowywanie konturów komór bocznych u myszy na podstawie immunobarwionych, koronalnych przekrojów o grubości 50 µm oraz rekonstrukcji 3D (Rycina 3) pozwala na gromadzenie danych o objętości w różnych paradygmatach eksperymentalnych, wykorzystujących mysz jako model choroby lub urazu. Kluczowym elementem tej procedury jest wykluczenie obszarów, w których ściany komór bocznych przylegają do siebie. Poprzez podział regionów komór na podsegmenty i przypisanie każdemu z nich innego koloru (Rycina 3C...

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Ogólnym celem poniższych procedur jest zapewnienie metod umożliwiających badanie przyczyn i skutków powiększenia komór mózgu oraz przedstawienie technik pozwalających na analizę stanu układu komorowego oraz jego kluczowych funkcji barierowych i filtracyjnych w mózgu. Osiąga się to poprzez pobieranie przekrojów czołowych mózgu myszy lub wykonywanie obrazowania MRI mózgu człowieka w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D komór oraz obliczenia ich objętości; w drugim kroku tkankę pobraną po śmierci, obejmującą preparaty en foss powierzchni szczytowej komór, barwi się przeciwciałami specyficznymi dla danych komórek, aby ujawnić integralność komórkową wyściółki komór. Następnie przygotowuje się montaż organizacji komórkowej całej powierzchni komory i nanosi go na model 3D komory, aby wykazać obszary gliozy w przeciwieństwie do nienaruszonych komórek nabłonkowych.Wyniki wskazują obszary rozszerzenia komór na podstawie podłużnego modelowania 3D komór oraz miejsca, w których warstwa komórek splotowych wyścielających komory nie jest już nienaruszona, lecz zastąpiona bliznami glejowymi. Dzięki połączeniu danych z modelowania 3D z danymi immunohistochemicznymi można wygenerować specyficzną dla regionu mapę 3D składu komórkowego wyściółki komór. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę urazów mózgu, chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, oraz naturalnego starzenia się, przy czym we wszystkich tych przypadkach zazwyczaj obserwuje się pewien stopień rozszerzenia komór, a w konsekwencji prawdopodobnie skoliozę powierzchni komór.Procedury na myszach zostaną zaprezentowane przez Richarda Wolffera oraz studenta studiów licencjackich z naszego laboratorium; procedury z wykorzystaniem danych MRI ludzi oraz tkanek ludzkich pobranych pośmiertnie zostaną zaprezentowane przez Yeun, obecnie studentkę medycyny, oraz Rebeccę Chu, doktorantkę w naszym laboratorium. Przygotuj preparaty do obrazowania poprzez utrwalenie, sekcjonowanie, barwienie immunocytochemiczne i montowanie mózgu myszy, zgodnie z opisem zawartym w pisemnej części protokołu. Aby rozpocząć procedurę śledzenia komór bocznych mózgu myszy, włącz komputer oraz pionowy mikroskop fluorescencyjny; mikroskop powinien być wyposażony w stół automatyczny i cyfrową kamerę CCD.Uruchom oprogramowanie do mapowania w trybie fluorescencji, a następnie otwórz opcje wyświetlania, aby załadować paski narzędzi i panele dokowania puli niezbędne do śledzenia. Następnie kliknij opcje, opcje wyświetlania akcesoriów i wybierz w tym samym menu paski narzędzi główny oraz markerowy. W sekcji paneli dokowania puli wybierz histogram kamery, sterowanie wielokanałowe, ustawienia kamery oraz akwizycję obrazu.Zidentyfikuj pierwszy fragment tkanki zawierający komory boczne, opierając się na silnej fluorescencji białka S 100 beta, która znakuje komórki wyściełające komory boczne. Zorientuj lewą i prawą półkulę, identyfikując niewielkie nacięcie wykonane podczas sekcjonowania.Teraz utwórz nowy plik danych i wyznacz punkt odniesienia dla ruchu stolika, klikając w oknie obrazu powyżej lewej komory bocznej. Utrzymuj ten punkt odniesienia w stałej lokalizacji względem komór bocznych we wszystkich plikach obrysów. Aby ułatwić import obrysów do rekonstrukcji seryjnej, wybierz odpowiedni predefiniowany typ obrysu z rozwijanego menu obrysów.Użyj innego koloru dla każdego z obrysów lewej i prawej komory bocznej. Następnie klikaj wzdłuż całej powierzchni wierzchołkowej wyściółki wyrostka, aby obrysować kontur komory. Przesuwaj okno obrysu za pomocą klawiszy strzałek.Po obrysowaniu konturu kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję close contour. Powtórz obrysowywanie dla prawej komory, używając innego koloru. Następnie wybierz odpowiedni znacznik z paska narzędzi znaczników po lewej stronie i kliknij, aby umieścić znacznik na ekranie obrysowywania wzdłuż linii środkowej, co pomoże w wyrównaniu sekwencyjnych konturów do rekonstrukcji 3D.Powtórz tę procedurę, aby wykonać drugie zaznaczenie. Zapisz ślady tkanki, wybierając opcję File Save data file as, a następnie utwórz nowy folder i nazwij plik, numerując ślady zgodnie z konwencją: numer preparatu-numer tkanki, aby ułatwić identyfikację śladów z sekcji seryjnych. Następnie powtórz opisaną procedurę dla wszystkich sekcji zawierających komorę.Aby przeprowadzić rekonstrukcję 3D komory bocznej, należy otworzyć program do rekonstrukcji 3D. Następnie kliknij Plik Otwórz i wybierz plik konturów pierwszego seryjnego przekroju śladu.Zaimportuj wszystkie obrysy konturów lewej i prawej komory, a także wszelkie dodane znaczniki. Wyrównaj kontury zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu. Następnie zaznacz wszystkie kontury w panelu po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk wizualizacji 3D, aby wyświetlić końcową rekonstrukcję 3D.Na tym obrazie przedstawiono koronarny przekrój mózgu myszy, obejmujący komory boczne obrysowane przez komórki splotowe immunoreaktywne na S 100 beta. Gwiazdka wskazuje komory boczne. Nawiasy wyznaczają obszar przylegania, a pasek skali reprezentuje 500 micronów.Komory boczne u myszy zostały obrysowane jako kontury i uporządkowane w sekcjach podsegmentowych. Obszary wewnątrzkomorowe zostały usunięte, aby nie zakłócały analizy wolumetrycznej. Na tym obrazie przedstawiono końcową rekonstrukcję 3D konturów komory bocznej.Kolor żółty reprezentuje obrys całkowitej objętości mózgu obejmującej obszar zainteresowania zawierający komory boczne. Należy dobrze rozumieć sposób tworzenia rekonstrukcji 3D komór z tkanki mózgowej pociętej w płaszczyźnie coronalnej. Przedstawione protokoły służą do tworzenia rekonstrukcji obrazów 3D i kwantyfikacji objętościowej komór bocznych oraz do oceny zmian objętościowych w czasie za pomocą podłużnej analizy nakładania obrazów; należy zaznaczyć, że spójność w gromadzeniu danych MR.R oraz w przetwarzaniu poakwizycyjnym są niezwykle istotnymi kryteriami włączania zbiorów danych. Do segmentacji komór wykorzystuje się program ITK SNAP, aby wyodrębnić komory z obrazów MR o wysokiej rozdzielczości ważonych T1. Po uruchomieniu programu należy wybrać opcję „open grayscale image”, wskazać odpowiedni plik i otworzyć go jako plik nifty.Następnie przejdź przez każdą płaszczyznę anatomiczną i odnotuj nieprawidłowości komorowe, takie jak obszary w kształcie nosa, powiększone lub zmniejszone rogi skroniowe lub podobne zmiany. Następnie w głównym pasku narzędzi kliknij snake, ROI tool. Następnie wybierz segment 3D i zaznacz opcję intensity region.Teraz kliknij „pre-process image” i wybierz opcję powyżej. Zapisz maksymalną intensywność, korzystając z suwaka. Następnie ustaw próg na 15% maksymalnej intensywności i zapisz tę wartość.To powinno podświetlić ROI na biało. Ustaw parametr wygładzania na 10. Kliknij OK.Następnie dodaj od 10 do 12 pęcherzyków małego rozmiaru dwa do każdej komory. Dwa w rogu przednim (czołowym), siedem rozmieszczonych równomiernie wzdłuż górnej powierzchni ciała komory bocznej, jeden w rogu tylnym (potylicznym) i jeden w rogu dolnym (skroniowym) komory bocznej.Następnie wybierz parametry i ustaw siłę zakrzywienia na 0,4. Potem kliknij symbol odtwarzania, aby rozpocząć ewolucję aktywnego konturu. Teraz kliknij aktualizuj siatkę, aby zwizualizować powierzchnię.Następnie sprawdź automatyczną aktualizację. Zatrzymaj proces segmentacji, gdy wszystkie obszary komory bocznej zostaną włączone do obszaru zainteresowania. Unikaj włączania komory trzeciej.Na koniec kliknij „finish” i zapisz wyniki segmentacji w formacie pliku NIfTI. Aby uzyskać całkowitą objętość komory, wybierz opcję segmentacji, objętości oraz statystyk, a następnie wyznacz całkowitą objętość komory, korzystając z etykiety kolorów (set color label). W tym etapie, z wykorzystaniem oprogramowania Mango, naniesiono podłużne obszary zainteresowania (ROI), aby jakościowo i ilościowo wykazać zmiany objętości komór u badanych w czasie.Po uruchomieniu oprogramowania kliknij open, a następnie open file i wczytaj wcześniej zapisany plik nifty. Po załadowaniu pliku obrazu kliknij file load ROI i wczytaj ROI dla punktu czasowego linii bazowej jako kolor zielony. Kliknij file load ROI i wczytaj drugi punkt czasowy ROI jako kolor czerwony.Zapisz nakładkę podłużną, wybierając opcję zapisu pliku ROI i przypisując każdemu obrazowi nazwę pliku zgodnie z konwencją wyświetloną obecnie na ekranie. Następnie otwórz program ITK-SNAP. Po tym otwórz ponownie połączone ROI jako obraz w skali szarości; załaduj połączone ROI, wybierając opcję ładowania segmentacji z pliku obrazu połączonego ROI, aby uzyskać podłużne dane objętościowe. Następnie uruchom funkcję segmentacji objętości i statystyk.Oznaczenie jedno czerwone oznacza objętość ekspansji, oznaczenie dwa zielone oznacza objętość stenozy, oznaczenie trzy niebieskie oznacza objętość podstawy; należy rozpocząć od nienaruszonej półkuli, która była utrwalana w 10% formalinie przez maksymalnie sześć tygodni i dokładnie przepłukana 0,1 M PBS. Wykonać przekroje wieńcowe o grubości 1,5 cm przez całą półkulę, używając dużego noża oraz skalpela mikrosurgicalnego. Wypreparować ścianę komory na głębokość 1 cm, zachowując jeden ciągły fragment dla całej ściany bocznej; podzielić ścianę w razie potrzeby, aby uzyskać fragmenty o odpowiedniej wielkości do barwienia. Wykonać nacięcie sekcji po stronie przeciwnej do ściany komory.Aby zidentyfikować orientację górno-dolną, należy przeprowadzić immunohistochemię i zamontować skrawki zgodnie z protokołem pisemnym. Pod mikroskopem stereoskopowym należy przymocować tkankę za pomocą szpilek, używając mikrosurgical stab knife, wykonać jednorodny cienki skrawek ściany komory bocznej i zamontować go na szkiełku przedmiotowym stroną boczno-górną do góry. Po całkowitym wyschnięciu szkiełek należy zbadać skrawki za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Płaszczyznę ogniskowania obrazowania należy ustawić na powierzchni komory, co zostanie określone przy użyciu beta-catenin, markera adhezji apikalnej.Białka połączeń komórek wypustkowych. Następnie wyznacz obszary pokrycia przez komórki wypustkowe oraz powierzchniową gliozę astrocytarną na podstawie barwienia GFAP na powierzchni komory, aby udokumentować i stworzyć montaż całej powierzchni komory. Użyj nakładających się obrazów całej powierzchni, aby stworzyć montaż obrazów seryjnych.Otwórz program Adobe Photoshop i skorzystaj z funkcji automatycznego scalania układów interaktywnych (file automate auto emerge interactive layout), aby wybrać obrazy do nałożenia, wprowadzając w razie potrzeby ręczne korekty. Utwórz nową warstwę do obrysowania montażu, aby wygenerować schematyczną reprezentację nienaruszonej powierzchni. W zależności od pokrycia komórkami lub powierzchni komory G scoliosis, zestaw wszystkie sekcje w celu zrekonstruowania mapy ściany komory i powiąż ją z odpowiadającym obszarem na rekonstrukcji MRI.Oto zestaw obrazów MR człowieka. Komora boczna została zdefiniowana jako obszar zainteresowania (ROI) zaznaczony na czerwono. Przedstawiona tutaj rekonstrukcja obrazu 3D umożliwia ilościowe określenie objętości oraz jakościową wizualizację komory bocznej.Ten obraz przedstawia ocenę podłużnego rozszerzenia komór u starszego pacjenta. Obrazy MR w płaszczyźnie podłużnej z wielu punktów czasowych mogą zostać wyrównane i nałożone na siebie, aby zwizualizować i ilościowo określić wzrost objętości komór u poszczególnych osób w czasie. Te ostatnie trzy obrazy przedstawiają ocenę immunohistochemiczną oraz mapowanie regionalne powierzchni ludzkiej komory bocznej.Obszary nienaruszonych komórek wyściółki komorowej, obrysowane barwieniem na beta-katenin, wykazują wygląd brukowany, wskazany gwiazdką, i są oddzielone linią przerywaną od regionów astrogliozy na powierzchni komory, obrysowanych barwieniem na GFAP. Seryjne obrazy konfokalne są nakładane na siebie w celu stworzenia montażu regionalnego, a następnie obrysowywane za pomocą programu Adobe Photoshop lub przedstawiane w formie schematycznej organizacji komórkowej na powierzchni komory. Ten schematyczny obraz montażu jest naniesiony na powierzchnię komory w odpowiadającej jej trójwymiarowej rekonstrukcji komory opartej na MRI.Jak pokazano, kolor zielony wskazuje na nienaruszoną tkankę, a obszary czerwone na gliozę. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest staranne dokumentowanie każdej próbki tkanki, aby umożliwić rekonstrukcję seryjną oraz mapowanie integralności komórkowej. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak subsegmentacja komór bocznych, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące ekspansji specyficznych regionów w czasie.

3d-modeling-lateral-ventricles-histological-characterization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki dokomorowej u ludzi i myszy

Opracowaliśmy mysie modele leukomalacji okołokomorowej (PVL), która jest dominującym uszkodzeniem mózgu u wcześniaków, charakteryzującym się zmianami w istocie białej wokół komór. Głównymi przyczynami PVL są niedotlenienie i niedokrwienie, z towarzyszącą lub bez towarzyszącej infekcji systemowej. Jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej oraz ekspozycja na hipoksję, z wstrzyknięciem lipopolisacharydu lub bez, wywołują zmiany przypominające PVL u myszy w 6. dniu po urodzeniu (P6).

Modele mysie leukomalacji okołodomowej

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.<br...

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Źródło: Xavier, A. L. R., et al. Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania kaniuli do cisterna magna znieczulonej myszy. Technika polega na przeprowadzeniu kaniuli zamontowanej na igle przez oponę twardą do odwróconego trójkątnego cisterna magna i zabezpieczeniu jej w celu ukierunkowanego dostarczenia do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna w modelu mysim

Źródło: Choi, J. P. et al. Obrazowanie indukcji i mikrotomografii komputerowej malformacji jamistych mózgu na modelu mysim. J. vis. exp. ( 2017)Ten film pokazuje zastosowanie obrazowania mikro-CT do wizualizacji zmian w malformacji jamistych mózgu (CCM) w mózgu myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy przygotowania próbki, obrazowania i rekonstrukcji obrazu 3D w celu oceny gęstości i lokalizacji zmian CCM w tkance mózgowej.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym zmian w malformacjach jamistych mózgu w mózgu myszy

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Ogólnym celem tego protokołu jest dokładne dopasowanie objętości obrazów rezonansu magnetycznego (MRI) do przekrojów histologicznych poprzez tworzenie dostosowanych drukowanych w 3D uchwytów na mózg i slicerów.

Wykorzystanie technologii druku 3D do połączenia rezonansu magnetycznego z histologią: protokół sekcji mózgu

Ten artykuł demonstruje skuteczne wykorzystanie metody preparacji włókien do ujawnienia powierzchownych dróg istoty białej i struktur okołokomorowych ludzkiego mózgu, w przestrzeni trójwymiarowej, aby pomóc studentom zrozumieć morfologię komór.

Eksploracja głębokiego kosmosu - odkrywanie anatomii struktur okołokomorowych w celu ujawnienia bocznych komór ludzkiego mózgu

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.

Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą

Poznaj metody 3D rekonstrukcji komór bocznych mózgu z wykorzystaniem MRI i analizy immunohistochemicznej u myszy i ludzi. Technika ta umożliwia badanie zmian objętościowych oraz integralności komórek wyściełających komory.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Przeglądaj więcej filmów