Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) jest szybkim i bezznacznikowym podejściem do uzyskiwania zestawów danych biochemicznych komórek i tkanek. W tym miejscu pokazujemy, jak uzyskać obrazy FT-IR o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek w celu poprawy diagnostyki choroby.

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazów próbek tkanek w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to poprzez uprzednie przecięcie próbek tkanek na szkiełka kompatybilne z podczerwienią. Drugim krokiem jest skonfigurowanie aparatu do obrazowania o wysokiej rozdzielczości poprzez zainstalowanie odpowiednich obiektywów.

Następnie pobierane jest tło podłoża i skanowana jest próbka tkanki. Ostatnim krokiem jest użycie odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania i wizualizacji danych. Ostatecznie obrazowanie w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości służy do wizualizacji i uzyskiwania informacji biochemicznych z tkanek biologicznych w sposób niezakłócający.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia świetlna, jest to, że nieodłączną biochemię tkanki można badać bez użycia barwników lub sond. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patologii w tej dziedzinie, takie jak przewidywanie nawrotu nefropatii cukrzycowej i klasyfikacja progresji choroby wątroby poprzez osteogenezę samochodową HEPA. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę i rokowanie choroby, biorąc pod uwagę, że dostarcza ona ogromnych ilości informacji biochemicznych niedostępnych w tradycyjnej histopatologii.

Chociaż ta metoda może być stosowana do diagnozy. Może być również używany do śledzenia zmian w procesie gojenia się ran i identyfikacji kluczowych cech tkanek, takich jak komórki macierzyste w przewodzie pokarmowym i mózgu. Pierwszy przekrój formalnego i utrwalonego bloku tkanki zatopionej w parafinie o grubości czterech mikrometrów na szkiełku kompatybilnym z IR za pomocą mikrotomu.

Podążając za tym. Oczyść mikroskop i spektrometr FTIR suchym powietrzem w celu usunięcia wody atmosferycznej z systemu. Następnie schłodzić zarówno detektor matrycy płaszczyzny ogniskowej, jak i wewnętrzny detektor tellurku rtęciowo-kadmowego w mikroskopie za pomocą ciekłego azotu, zamontuj szkiełko próbki na stoliku mikroskopu do obrazowania FTIR po upewnieniu się, że światło widzialne jest włączone, skup się na próbce za pomocą programu do przechwytywania próbki.

Następnie otwórz pakiet oprogramowania i kliknij przycisk zbierz. Kliknij opcję diagnostics (diagnostyka) i wybierz spektrometr liniowy. Następnie kliknij Ustawienia obrazowania, aby skalibrować system.

W zakładce optyka wybierz detektor jako detektor mikroskopu naziemnego po lewej stronie, a następnie wybierz transmitancję w trybie optyki. Kliknij ustawienia, co otworzy okno sterowania lansjerem dla trybu transmisji w sterowaniu lancerem. Kliknij na RAW za pomocą joysticka sterującego sceną i obserwuj, jak podgląd na żywo obrazu interferogramu FTIR przesuwa się do czystego obszaru slajdu.

W tym momencie dostosuj czas całkowania do około 8 000 zliczeń i celu dolnego kondensatora. Aby zwiększyć liczbę zliczeń do maksimum, obserwuj kształt prawego dolnego obrazu w kontrolce lansjera, aby upewnić się, że ma wygląd gaussowski i jest stosunkowo jednolity. Po dostosowaniu czasu całkowania, ponownie przesuń stolik, aby znaleźć kawałek tkanki ze strukturą, najlepiej krawędź tkanki.

Następnie udoskonal ostrość obrazu. Za pomocą joysticka sterowania sceną przejdź do czystego obszaru slajdu. Naciśnij przycisk kalibracji po dokonaniu wyboru.

Dobra, dwa razy W zakładce optyka wybierz detektor równa się MCT i detektor mikroskopowy równa się prawy. Następnie kliknij przycisk konfiguracji. Gdy interferogram FTIR zostanie zobrazowany na ekranie, kliknij znajdź środkową serię i w porządku.

W zakładce optyka wybierz ponownie detektor równa się detektor mikroskopu naziemnego równa się lewy. Następnie wybierz pozycję konfiguracji. Po upewnieniu się, że obraz nadal znajduje się w czystym obszarze w sterowaniu lansjerem, kliknij ponownie kalibruj i okej.

Aby zebrać obraz FTIR tła, przejdź do zakładki elektronika i wybierz odpowiednią rozdzielczość spektralną, która zazwyczaj wynosi cztery lub osiem odwrotnych centymetrów. W przypadku tkanki przejdź do zakładki tło i wpisz 128 w skanach do coad. Wybierz przycisk nowego pliku i umieść plik tła w odpowiednim folderze.

Po kliknięciu tła i oczekiwaniu na zakończenie skanowania potwierdź, gdzie zapisać plik. Kliknij region na tle, obraz FTIR i sprawdź spektrum. W tym momencie kliknij setup i w sterowaniu lansjerem użyj widoku IR na żywo.

Aby znaleźć obszar zainteresowania, przejdź do zakładki elektronika i wpisz liczbę skanów do coad. Następnie kliknij skanowanie Aby przygotować mikroskop FTIR do analizy w wysokiej rozdzielczości, przykręć obiektyw o dużym powiększeniu w miejsce obiektywu 15x. W tym momencie otwórz oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu i załaduj plik z danymi IR.

Zastosuj algorytm korekcji linii bazowej do danych IR, wybierając narzędzia spektralne, a następnie przewiń w dół i kliknij widma absorpcyjne. Gdy pojawi się menu podręczne, wybierz opcję Korekcja linii bazowej. Wykonaj normalizację widma, wybierając znormalizowane widma w opcjach menu widm chłonnych.

Następnie obserwuj listę wszystkich częstotliwości podczerwieni zebranych na obrazie. Kliknij częstotliwości, które odpowiadają określonym biomolekułom, aby obserwować obraz tkanki przy wybranej częstotliwości i tworzyć obrazy, które umożliwią wizualizację różnych składników biomolekularnych. Kliknij narzędzia spektralne, a następnie wybierz współczynniki wysokości pików.

Zeskanuj odpowiedni sąsiedni wycinek barwionej tkanki za pomocą oddzielnego systemu obrazowania całych preparatów, który rejestruje obrazy w jasnym polu wraz z obrazem w podczerwieni. Przywołaj cyfrowy obraz barwionej tkanki za pomocą programu do obrazowania widzialnego. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz w obszarze zainteresowania i wybierz profil Z, aby podać informacje spektralne na wybranym pikselu.

Aby zaznaczyć określone piksele na obrazie, kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz narzędzie ROI. Utwórz klasy, które mają być oznaczone, na przykład klasy kapsułowe Meuma i Bowmana. Następnie wybierz punkt typu ROI, a następnie wybierz klasę, dla której chcesz wybrać piksele i narysuj odpowiednie piksele na obrazie IR.

Wyprowadź średnie widma dla każdej z klas za pomocą narzędzia średniego zwrotu z inwestycji. Na koniec porównaj uzyskane widma przez wykreślenie. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów obrazowanie FT IR pozwala na uzyskanie obrazów w podczerwieni tkanki, które mogą dawać różne kontrasty w zależności od częstotliwości IR.

Każdy piksel składa się z całego spektrum z różnymi pikami odpowiadającymi różnym biomolekułom, które mogą dostarczyć informacji o właściwościach biochemicznych typów komórek lub stanach chorobowych. Oprzyrządowanie FTIR ewoluowało od trybu pomiaru w trybie mapowania pojedynczego punktu przy użyciu nieprzezroczystych apertur do trybu obrazowania z wykorzystaniem obiektywów ziarnistych CASA wykorzystujących obiektyw oświetlający w połączeniu z obiektywem zbierającym w trybie transmisji lub pojedynczy obiektyw, który zarówno oświetla, jak i zbiera w trybie odbicia. Postępy w rozdzielczości przestrzennej w obrazowaniu tkanek mają kluczowe znaczenie, ponieważ można teraz identyfikować typy komórek i struktury tkankowe.

W tym przypadku jednostki funkcjonalne kłębuszków nerkowych obserwowano w rdzeniu tkanki wątroby. Możliwe jest uwidocznienie hepatocytów i regionów naciekającego zwłóknienia, które dzieli dwa odrębne obszary dysplazji i niedysplastycznej marskości wątroby. Zwiększona rozdzielczość przestrzenna pozwala na wyodrębnienie określonych cech strukturalnych, które mogą być chemicznie modyfikowane przez chorobę, zanim pojawią się zmiany histologiczne.

Zmiany biochemiczne w strukturach kłębuszków nerkowych, takich jak torebka Bowmana, meum, błona podstawna kłębuszków nerkowych i błona podstawna kanalików, można zidentyfikować za pomocą obrazowania FTIR. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o całkowitym usunięciu slajdów przed skanowaniem Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak tradycyjna analiza immunochemiczna, można przeprowadzić na tym samym fragmencie tkanki w celu skorelowania sygnatur biochemicznych i morfologii tkanki.

Nasze pierwsze osiągnięcie, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem tkanek do zbadania statusu biomolekularnego typów małych komórek i struktur w tkankach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć podstawową wiedzę, jak uzyskać obrazy FTR w wysokiej rozdzielczości próbek tkanek i wykonać podstawową analizę spektralną. Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zadbać o środki ostrożności, takie jak rękawice kriobezpieczne i okulary ochronne.