Name: Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj obrazowanie FT-IR wysokiej rozdzielczości ludzkich tkanek w celu uzyskania danych biochemicznych bez znakowania. Ta metoda poprawia diagnostykę chorób poprzez wizualizację wewnętrznej biochemii próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Wydziałowi Patologii Uniwersytetu Illinois w Chicago za wsparcie finansowe. Usługi w zakresie histologii i obrazowania w zakresie widzialnym były świadczone przez Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core na Uniwersytecie Illinois w Chicago, utworzone przy wsparciu Prorektora ds. Badań, w szczególności chcielibyśmy podziękować Ryanowi Deatonowi i Andy'emu Hallowi za ich wiedzę. Dziękujemy również firmie Agilent Technologies, a w szczególności Frankowi Westonowi za wsparcie i wypożyczenie dodatkowego obiektywu IR.

1. Konfiguracja mikroskopu FT-IR i pozyskiwanie obrazów tkanek
<ol>
	<li>Za pomocą mikrotomu należy przeciąć utrwalony w formalinie zatopiony w parafinie blok tkankowy o grubości 4 μm na szkiełko kompatybilne z IR. Alternatywnie, przeciąć tkankę zamrożoną ciekłym azotem o grubości 4 μm na szkiełko kompatybilne z IR za pomocą kriostatu. 
	UWAGA: Zazwyczaj przekrój seryjny jest również uzyskiwany na szkiełku podstawowym i barwiony specjalnym barwnikiem (takim jak Hematoksylina i Eozyna (H&E)) lub immunohistochemicznym. Ponadto hodowane linie komórkowe mogą być hodowane na szkiełkach kompatybilnych z podczerwienią. Slajdy kompatybilne z IR mogą być szkiełkami odblaskowymi IR do obrazowania w trybie odbicia (np. Slajd MirrIR, złoty) lub przezroczystymi szkiełkami IR do obrazowania w trybie transmisji (np. BaF2, CaF2).</li>
	<li>Oczyść mikroskop i spektrometr FT-IR za pomocą suchego powietrza lub suchego azotu w celu usunięcia wody atmosferycznej z systemu. Odczekaj co najmniej 45 minut przed obrazowaniem, aby zapewnić dokładne oczyszczenie.</li>
	<li>Schłodzić zarówno detektor FPA (do 79 K), jak i wewnętrzny detektor MCT w mikroskopie FT-IR za pomocą ciekłego azotu. Chłodzić detektory mniej więcej co 6 godzin. 
	OSTROŻNOŚĆ! Ciekły azot jest płynem kriogenicznym i może powodować zimne oparzenia, odmrożenia, a w zamkniętych pomieszczeniach uduszenie.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko z próbką na stoliku mikroskopu do obrazowania FT-IR.</li>
	<li>Upewnij się, że światło widzialne jest "WŁĄCZONE", a następnie za pomocą lornetki lub programu do przechwytywania próbki (który zapewnia widoczny obraz tkanki w czasie rzeczywistym) skup się na próbce.</li>
	<li>Otwórz pakiet oprogramowania, taki jak resolutions pro i kliknij "Collect", następnie kliknij "Diagnostics", a następnie wybierz "Align Spectrometer". Upewnij się, że ścieżka wiązki do wewnętrznego detektora spektrometru nie jest zatkana.</li>
	<li>Kliknij "Ustawienia obrazowania".</li>
	<li>W zakładce 'Elektronika' wybierz odpowiednie ustawienia 'Prędkość', 'Współczynnik niedostatecznego próbkowania (UDR)" i 'Filtry' w zależności od systemu. 
	UWAGA: W tym przykładzie ustawienie to Szybkość = 2,5 kHz, UDR = 4 i Filtry = Brak.</li>
	<li>W zakładce "Optyka" upewnij się, że wybrano "Źródło średniej podczerwieni", "Otwarta przysłona" i "100% tłumik wiązki".</li>
	<li>Aby skalibrować system, w zakładce "Optyka" wybierz "Detektor" jako "Uziemienie", "Detektor mikroskopu" jako "Po lewej", a następnie wybierz "Transmitancja" lub "Odbicie" w "Trybie optyki" w zależności od rodzaju używanego szkiełka.</li>
	<li>Kliknij Ustawienia, co otworzy okno "Kontrola Lancera". 
	UWAGA: W przypadku trybu odbicia postępuj zgodnie z instrukcjami w 1.12 i 1.13, a w trybie transmisji postępuj zgodnie z instrukcjami w 1.14 do 1.16. Kontynuuj od 1.17 zarówno dla odbicia, jak i transmisji.</li>
	<li>Aby przejść do trybu odbicia, w "Lancer Control" kliknij na "Raw". Korzystając z joysticka sterowania sceną i obserwując na żywo podgląd obrazu interferogramu FT-IR (obraz w prawym górnym rogu), przejdź do czystego obszaru na slajdzie.</li>
	<li>Dostosuj czas integracji do około 8 000 zliczeń. Następnie przesuń stolik, aby znaleźć fragment tkanki ze strukturą, najlepiej krawędź tkanki, i udoskonalić ostrość obrazu. Zmień opcje "Ciepło" i "Kontrast", aby pomóc w tworzeniu obrazu w celu poprawy ostrości, nie będzie to miało wpływu na dane w podczerwieni. Kontynuuj od 1.18.</li>
	<li>Aby przejść do trybu transmisji, w "Lancer Control" kliknij na "Raw". Korzystając z joysticka sterowania sceną i obserwując na żywo podgląd obrazu interferogramu FT-IR (prawy górny obraz), przejdź do czystego obszaru slajdu.</li>
	<li>Dostosuj czas integracji do około 8 000 zliczeń.</li>
	<li>Wyreguluj dolny obiektyw ostrości/kondensatora, aby zwiększyć liczbę zliczeń do maksimum. Obserwuj kształt obrazu w prawym dolnym rogu w Lancer Control, aby upewnić się, że ma on gaussowski wygląd i jest stosunkowo jednolity. Ponownie dostosuj czas integracji do około 8 000 zliczeń. 
	UWAGA: Jeśli którykolwiek z pikseli na obrazie interferogramu FT-IR zmieni kolor na biały, skróć czas integracji.</li>
	<li>Przesuń stół montażowy, aby znaleźć fragment tkanki ze strukturą, najlepiej krawędź tkanki i poprawić ostrość obrazu. Opcjonalnie zmień opcje ciepła i kontrastu, aby pomóc w tworzeniu obrazu poprawiającym ostrość, ale nie będzie to miało wpływu na dane w podczerwieni.</li>
	<li>Za pomocą joysticka sterowania sceną przejdź do czystego obszaru slajdu. Naciśnij przycisk "Kalibruj". Upewnij się, że wartość "Poza zakresem (OOR)" jest mniejsza niż 50, a różnica między liczbą "Wysoki strumień" i "Niski strumień" wynosi co najmniej 4,000 zliczeń.</li>
	<li>Wybierz dwukrotnie "OK". W zakładkach optyka wybierz; 'Detector' = 'MCT', 'Microscope Detector' = 'Right', a następnie kliknij 'Setup'. W tym momencie na ekranie pojawi się interferogram FT-IR. Kliknij "Znajdź Centerburst". Kliknij "OK".</li>
	<li>W zakładce "Optyka" wybierz ponownie "Detektor" = "Uziemienie", "Detektor mikroskopu" = "Po lewej" i wybierz "Konfiguracja".</li>
	<li>W Lancer Control — upewnij się, że obraz nadal znajduje się na czystym obszarze i ponownie kliknij "Kalibruj". Kliknij "OK".</li>
	<li>Następnie zbierz obraz tła FT-IR, aby skorygować absorbancję z atmosfery, systemu i szkiełka. Przejdź do zakładki 'Elektronika' i wybierz odpowiednią rozdzielczość spektralną, zazwyczaj 4 cm-1 lub 8 cm-1 dla tkanki.</li>
	<li>Przejdź do zakładki "Tło" i wpisz 128 w polu "Skany do wspólnego dodania". Wybierz przycisk "Nowy plik..." i umieść plik tła w odpowiednim folderze. Sprawdź zakładkę "Obrazowanie", aby upewnić się, że mozaika to 1 na 1. Kliknij "Tło", poczekaj na zakończenie skanowania i potwierdź, gdzie zapisać plik. Kliknij region na obrazie FT-IR w tle i sprawdź spektrum.</li>
	<li>Aby wykonać duży obraz mozaiki próbki, wybierz zakładkę "Obrazowanie" i wstaw liczbę klatek X i Y dla rozmiaru mozaiki, który chcesz uzyskać.</li>
	<li>Kliknij "Setup" (Konfiguracja) i w Lancer Control użyj widoku IR na żywo, aby znaleźć obszar zainteresowania. Jeśli robisz mozaikę, wyśrodkuj kanał na żywo na środku obszaru zainteresowania. Kliknij "OK". Przejdź do zakładki "Elektronika" i wpisz liczbę skanów do dodania (zwykle wartość od 2 do 16 skanów dla tkanki). Kliknij "Skanuj".</li>
	<li>Sprawdź zebrany obraz FT-IR na ekranie, aby upewnić się, że wygląda na wyostrzony. Kliknij obraz, aby wyświetlić widmo podczerwieni z tego miejsca i sprawdź, czy wygląda na to, że ma akceptowalny sygnał do szumu. Uzyskaj widoczny obraz próbki.</li>
	<li>Zapisz obraz i wyeksportuj go do wymaganego formatu, takiego jak ENVI-IDL.</li>
</ol>
2. Adaptacja mikroskopu FT-IR do pracy w wysokiej rozdzielczości
UWAGA: Większość systemów FT-IR jest wyposażona w obiektyw o przybliżonym powiększeniu 15x i aperturze numerycznej 0,5 (NA). Aby obrazować w trybie wysokiej rozdzielczości, można użyć obiektywu 36X lub 74X kompatybilnego z podczerwienią, aby zapewnić ograniczone możliwości obrazowania dyfrakcji.
<ol>
	<li>Zdejmij obiektyw 15X systemu, odkręcając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
	<li>Wkręć obiektyw 36X lub 74X w swoje miejsce. Wyrównaj obiektyw przed użyciem. Użyj tulei przedłużających obiektyw, aby zbliżyć obiektyw wystarczająco do próbki.</li>
	<li>Umieść tkankę pod nowym obiektywem i ustaw ostrość w świetle widzialnym za pomocą lornetki lub programu Sample Capture. 
	UWAGA: Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości musi być wykonywane w trybie transmisji. Bardzo mała odległość robocza tych obiektywów (1-2 mm) i bardzo mała głębia ostrości wymagają powolnego i ostrożnego ustawiania ostrości, poświęcając czas na opuszczenie obiektywu bez dotykania próbki.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami od 1.6 do 1.11. 
	UWAGA: Ze względu na znacznie trudniejsze ustawienie ostrości i znacznie mniej światła docierającego do detektora, poniższy protokół jest dostosowywany na podstawie 1.14.</li>
	<li>W trybie transmisji kliknij "Raw". Korzystając z joysticka sterowania sceną i obserwując podgląd na żywo obrazu z interferogramu FT-IR (prawy górny obraz), przejdź do tkanki i ustaw ostrość (najlepiej na krawędzi). 
	UWAGA: Może to być trudne, dlatego dostosuj opcje "Ciepło" i "Kontrast", aby pomóc w tworzeniu obrazu i poprawić ostrość (te opcje nie mają wpływu na dane w podczerwieni).</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości za pomocą joysticka sterowania sceną i podglądu w podczerwieni na żywo przejdź do czystego obszaru slajdu. Dostosuj czas integracji do około 8 000 zliczeń. Wyreguluj dolny obiektyw ostrości, aby zwiększyć liczbę zliczeń do maksimum. Ponownie dostosuj czas integracji do około 8 000 zliczeń.</li>
	<li>Przesuń stół montażowy, aby znaleźć fragment tkanki ze strukturą, najlepiej krawędź tkanki, i udoskonalić ostrość obrazu.</li>
	<li>W przypadku tworzenia mozaiki obrazu w wysokiej rozdzielczości dostosuj stół montażowy, aby umożliwić prawidłowy ruch wymagany na różnych odległościach w celu dokładnego tworzenia mozaiki. Aby zmienić ustawienia odległości sceny, przejdź do "Stage konfiguracji" w Lancer Control i dostosuj ustawienia wyrównania w poziomie i pionie, aby umożliwić prawidłowe mozaikowanie.</li>
	<li>Za pomocą joysticka sterowania sceną przejdź do czystego obszaru zjeżdżalni. Naciśnij przycisk "Kalibruj". Upewnij się, że wartość poza zakresem (OOR) jest mniejsza niż 50 zarówno dla obiektywów 36X, jak i 74X. Upewnij się, że różnica między wartościami wysokiego i niskiego strumienia wynosi co najmniej 1,000 zliczeń dla obiektywu 74X i 2,000 zliczeń dla obiektywu 36X.</li>
	<li>Kontynuuj od 1.19 do 1.27. Liczba skanów w 1.23 i 1.25 będzie musiała zostać dostosowana ze względu na zmniejszony sygnał do około 256 skanów dla obrazu tła i od 16 do 128 skanów dla obrazu tkanki.</li>
</ol>
3. Wizualizacja i klasyfikacja zestawów danych spektralnych IR
UWAGA: W tej sekcji omówimy, jak wizualizować i wydobywać dane z obrazów spektralnych za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów geoprzestrzennych, takiego jak ENVI+IDL, jednak proces ten jest bardzo podobny dla każdego alternatywnego oprogramowania, takiego jak MATLAB, wolnego oprogramowania, takiego jak CytoSpec, lub własnego oprogramowania twórcy instrumentu. Istnieje kilka różnych technik przetwarzania spektralnego, które mogą być wykonywane na danych w podczerwieni.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów geoprzestrzennych i załaduj plik z danymi IR.</li>
	<li>Zastosuj algorytm korekcji linii bazowej do danych IR, wybierając "Narzędzia spektralne", a następnie przewiń w dół i kliknij "Widma absorbancji". Obserwuj menu podręczne i wybierz "Korekta linii bazowej" 
	UWAGA: Korekcja linii bazowej usunie z danych nachylenie odsunięcia linii bazowej spowodowane rozproszeniem</li>
	<li>Wykonaj normalizację spektralną, odnosząc dane do określonego piku widmowego (zwykle Amid I (1,650 cm-1) lub Amid II (1,550 cm-1)) lub obszaru pod zdefiniowanym obszarem widma. W tym celu należy wybrać opcję "Widma normalne" w opcjach menu "Widma absorbancji". 
	UWAGA: Normalizacja spektralna jest wykonywana w taki sposób, aby wszelkie różnice w widmach były rzeczywistymi różnicami biochemicznymi, a nie wynikały z różnic grubości lub gęstości między próbkami.</li>
	<li>W razie potrzeby użyj algorytmu redukcji szumów, aby usunąć szum z widm28. 
	UWAGA: Dostępnych jest wiele podejść, za pomocą których można osiągnąć korekcję linii bazowej, normalizację widma i redukcję szumów, przy czym większość programów ma wbudowane algorytmy automatyczne. Ponadto pojawia się wiele podejść, które korygują aberracje spektralne, które zostały szczegółowo omówione29-42; Jednak społeczność nie zgadza się jeszcze co do tego, które z nich są potrzebne.</li>
	<li>Obserwuj listę wszystkich częstotliwości podczerwieni zebranych na obrazie (zwykle w zakresie widmowym od 900 do 4,000 cm-1). Kliknij częstotliwości, które odpowiadają określonym biomolekułom, aby obserwować obraz tkanki przy wybranej częstotliwości.
	<ol>
		<li>Na przykład kliknij pasmo 1,650 cm-1, aby obserwować rozkład białek w próbce. Alternatywnie kliknij pasmo 1,080 cm-1, aby obserwować rozkład kwasów nukleinowych w próbce. Użyj liczby falowej 1,650 cm-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Twórz dodatkowe obrazy, obliczając spektralne współczynniki wysokości pików, współczynniki powierzchni pików itp., które pozwolą na wizualizację różnych składników biomolekularnych. Kliknij "Narzędzia spektralne", a następnie wybierz "Współczynniki wysokości szczytu" lub "Oblicz obszar obrazu", aby utworzyć obrazy.</li>
	<li>Zeskanuj odpowiedni sąsiedni fragment tkanki, który jest barwiony za pomocą oddzielnego systemu do obrazowania całych preparatów, który rejestruje obrazy w jasnym polu. Wraz z obrazem w podczerwieni przywołaj cyfrowy obraz barwionej tkanki za pomocą programu do obrazowania widzialnego.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz w obszarze zainteresowania i wybierz "Profil Z". Spowoduje to podanie informacji spektralnej w wybranym pikselu.</li>
	<li>Spójrz na widma IR wielu pikseli z wielu klas, na przykład porównując typy komórek, stany chorobowe. Oznacz określone piksele na obrazie za pomocą narzędzia "Obszary zainteresowania" (ROI). Aby to zrobić, kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz "Narzędzie ROI". Utwórz klasy, które mają być oznaczone, na przykład klasy normalne, dysplazja i rak. Następnie wybierz "Typ ROI" — "Punkt". Następnie wybierz klasę, dla której chcesz wybrać piksele, i narysuj odpowiednie piksele na obrazie w podczerwieni. Wyznacz średnie widma dla każdej z klas za pomocą narzędzia "Średni zwrot z inwestycji".</li>
	<li>Porównaj uzyskane widma, kreśląc je w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FT-IR to nowa metoda bezznacznikowego obrazowania biochemicznego skrawków tkanek, która może odegrać ważną rolę w poprawie obecnego standardu diagnostyki w patologii. Obecny złoty standard patologii wymaga, aby tkanki były poddawane biopsji, utrwalane w formalinie, zatopione w parafinie, wielokrotnie cięte i barwione wieloma barwnikami. Wysoko wyszkolony patolog musi subiektywnie wizualnie ocenić strukturę tkanki i morfologię komórki, aby postawić diagnozę. Tutaj pokazujemy, jak zbierać obrazy w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości z tego samego typu sekcji i omawiamy niektóre podejścia obliczeniowe do badania różnic chemicznych między typami komórek i stanami chorobowymi.
Krytycznymi krokami w ramach tego protokołu jest zapewnienie, że tkanki są bardzo dokładnie skoncentrowane i że system jest dobrze skalibrowany, aby zapewnić bardzo wysoką jakość danych spektroskopowych. Staranność podczas ustawiania systemu jest szczególnie ważna podczas pracy z obiektywami o dużym powiększeniu. Aby pomóc w rozwiązywaniu problemów, poniższa lista obejmuje niektóre z potencjalnych napotkanych trudności;
Problem: Niska intensywność podczerwieni podczas obrazowania w odbiciu. Rozwiązanie: Sprawdź orientację suwaka w podczerwieni, ponieważ powłoka odblaskowa może znajdować się po niewłaściwej stronie prowadnicy.
Problem: Niski sygnał/czerwony znak ostrzegawczy w Lancer Control. Rozwiązanie: Fajne detektory z LN2. Ciekły azot jest niezbędny do działania detektorów FPA i wymaga okresowego uzupełniania.
Problem: Błąd prędkości/błędy ruchu. Rozwiązanie: Zresetuj spektrometr i zmniejsz wibracje. Wibracje spowodują zakłócenie ruchomego lustra w interferometrze.
Problem: Skoki pary wodnej w danych. Rozwiązanie: Zwiększ przedmuchiwanie systemu i chroń próbkę przed powietrzem.
Problem: Nieprawidłowy centerburst. Rozwiązanie: Znajdź ponownie centerburst.
Problem: Niska różnica strumienia w transmisji, mimo że jest skupiona. Rozwiązanie: Wyreguluj dolny skraplacz. Dzieje się tak, ponieważ światło podczerwone nie jest skupiane w określonym punkcie na próbce.
W tym artykule skupiliśmy się na tym, jak pozyskiwać obrazy tkanek w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości w trybie transfleksyjnym lub transfleksyjnym. Natura obrazowania FT-IR polega na tym, że istnieje wiele modyfikacji, które można wprowadzić do akwizycji danych, takich jak rodzaj podłoża, technika fiksacji, grubość próbki, rozdzielczość spektralna, prędkość lustra interferometru itp. Wpływ tych parametrów został ostatnio szczegółowo omówiony 4,5,17,51.
Istnieje szereg modyfikacji, które można wprowadzić do systemu obrazowania, w tym obrazowanie w trybie ATR10,24,26 i wykorzystanie nanoskalowych podejść termicznych52,53 , aby umożliwić obrazowanie w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości. Głównym ograniczeniem obrazowania w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości jest to, że tkanki muszą być starannie przygotowane i wystarczająco cienkie, aby mogło przejść przez nie IR (zwykle o grubości 4 μm). Ponadto obrazowanie FT-IR z transmisją i odbiciem wymaga, aby próbki były suche ze względu na absorpcję podczerwieni przez wodę. Jednak obrazowanie FT-IR ma znaczące zalety w porównaniu z innymi technikami, ponieważ może bardzo szybko obrazować duże obszary tkanki, jednocześnie uzyskując bogate i szczegółowe informacje biochemiczne. Inne podobne techniki, które uzyskują informacje biochemiczne w sposób bezznacznikowy, obejmują spektroskopię Ramana, jednak czas pozyskiwania danych jest znacznie wolniejszy w celu uzyskania obrazów. Pojawiają się nowe podejścia do obrazowania ramanowskiego, w tym wymuszone rozpraszanie ramanowskie (SRS) i koherentne antystokesowskie rozpraszanie ramanowskie (CARS); Mają jednak dostęp do ograniczonego zakresu spektralnego lub obrazowania jednoczęstotliwościowego.
Postępy w zakresie szybkości pozyskiwania danych, rozdzielczości przestrzennej i dostępności podejść obliczeniowych miały ogromną wartość w uczynieniu obrazowania FT-IR bardziej wykonalnym podejściem do translacji jako nowego narzędzia obrazowania w patologii. Ostatnie postępy w zakresie rozdzielczości przestrzennej są szczególnie ważne dla patologii tkanek ze względu na to, że kluczowe typy komórek nie są możliwe do rozdzielenia za pomocą konwencjonalnych systemów obrazowania FT-IR. Niedawny artykuł Reddy'ego i wsp. pokazano, jak modelować idealny system w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości przestrzennej systemu obrazowania FT-IR5. Przykład tkanki nerkowej przedstawiony w tej pracy pokazuje znaczenie wyższych rozdzielczości przestrzennych w celu wyodrębnienia informacji biochemicznych ze struktur kłębuszkowych (ryc. 3 i ryc. 5). W przyszłości nowe osiągnięcia w kwantowych laserach kaskadowych jako bardzo jasne źródła światła podczerwonego54-57, obrazowanie spektralne 3D58 oraz przełomy w dziedzinie nanoskalowych technologii podczerwieni52,53,59,60 niosą ze sobą ekscytujące nowe ścieżki badań, które mogą mieć ogromne implikacje w przyszłości obrazowania tkanek.
Przedstawiliśmy przykłady zastosowań w chorobach wątroby i nerek, gdzie istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe informacje biochemiczne, które mogą mieć wartość diagnostyczną. Laboratorium Patologii Spektralnej na Wydziale Patologii Uniwersytetu Illinois w Chicago koncentruje się na przełożeniu technologii obrazowania w podczerwieni na poprawę diagnostyki chorób i lepsze przewidywanie wyników pacjentów. Obrazowanie FT-IR może przezwyciężyć niektóre z obecnych ograniczeń w praktyce patologicznej, gdzie wymagane są informacje ilościowe i obiektywne. W szczególności przyszłe prace koncentrują się na identyfikacji obszarów w obecnej praktyce patologicznej, w których obecne techniki nie zapewniają odpowiedniej czułości diagnostycznej lub dostarczają ograniczonych informacji. Istnieje wyraźna potrzeba ulepszenia obecnej praktyki patologicznej i udzielenia patologowi większej ilości informacji na temat stanu choroby pacjenta, co może być osiągalne przy użyciu obrazowania FT-IR o wysokiej rozdzielczości.

Spektroskopia IR jest narzędziem analitycznym dostępnym w jakiejś formie od lat 30-tych; jednak dopiero w ciągu ostatniej dekady nastąpił gwałtowny rozwój w dziedzinie obrazowania tkanek za pomocą FT-IR. Postęp w dziedzinie FT-IR do obrazowania tkanek był w dużej mierze napędzany przez trzy kluczowe osiągnięcia: 1) zwiększenie szybkości pozyskiwania danych dzięki dostępności dużych detektorów FPA (Focal Plane Array), które zazwyczaj mają tysiące detektorów czułych na podczerwień1,2, 2) opracowanie zaawansowanych algorytmów przetwarzania i mocy obliczeniowej do obsługi dużych zbiorów danych hiperspektralnych3, oraz 3) modelowanie systemów obrazowania FT-IR w celu maksymalizacji rozdzielczości przestrzennej4,5. Ostatnio ukazało się wiele wysokiej jakości i bardzo obszernych artykułów recenzujących dziedzinę spektroskopii FT-IR, a także artykuł w Nature Protocols, który szczegółowo opisuje etapy uzyskiwania widm punktowych lub map z tkanek17. W tym artykule skupimy się na protokole uzyskiwania obrazów tkanek za pomocą detektora FPA 128 x 128 w zmodyfikowanym systemie FT-IR z możliwością wysokiej rozdzielczości.
Obrazowanie FT-IR od dawna jest uważane za potencjalnie pożądane narzędzie do obrazowania komórek i tkanek ze względu na możliwość uzyskania obrazów, w których każdy piksel zawiera bogactwo informacji biochemicznej. Obrazowanie FT-IR opiera się na zasadzie, że różne biomolekuły w próbce będą ilościowo absorbować różne obszary średniej podczerwieni; Pozwala to na wyprowadzenie "biochemicznego odcisku palca". W wielu badaniach wykazano, że ten odcisk palca zmienia się między różnymi typami komórek i stanami chorobowymi. W przeciwieństwie do konwencjonalnej praktyki patomorfologicznej, w której barwniki i markery immunohistochemiczne muszą być używane do wizualizacji i identyfikacji typów komórek i struktur tkankowych, które są wykorzystywane do kierowania diagnozą i opcjami leczenia, obrazy z FT-IR są tworzone w oparciu o nieodłączną biochemię tkanki. Obecna technika barwienia tkanek w celu diagnozy jest czasochłonna, destrukcyjna, pracochłonna i wymaga subiektywnej wiedzy patologa, podczas gdy FT-IR oferuje potencjał, aby uczynić ten proces szybkim, nieniszczącym, wysoce zautomatyzowanym i bardziej obiektywnym. Ponadto FT-IR zapewnia nowatorską drogę do uzyskania dodatkowych informacji biochemicznych, które mogą nie być łatwo dostępne przy użyciu konwencjonalnych technik barwienia.
Jednym z najbardziej ekscytujących osiągnięć ostatnich lat była dostępność metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości, które teraz pozwalają na wizualizację i charakterystykę typów komórek i struktur tkankowych, które są kluczowe dla kompleksowej diagnozy choroby. Jedną z tych technik jest Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR, która zawiera solidną soczewkę zanurzeniową (SIL) o wysokim współczynniku załamania światła, która pozwala na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości18, z wieloma bardzo ekscytującymi badaniami pokazującymi jej zastosowania19-25. Ponadto niedawno wykazano, że zwiększona rozdzielczość przestrzenna związana z obrazowaniem ATR może pozwolić na wizualizację i klasyfikację komórek śródbłonka i mioepitelializmu w tkance piersi, które stanowią kluczowy element diagnostyki raka piersi26. Chociaż obrazowanie ATR jest bardzo przydatne, technika ta wymaga, aby SIL nawiązał kontakt z tkanką w celu utworzenia obrazów FT-IR; Dlatego jego zastosowanie jest nieco ograniczone w przypadku patologii tkanek, w której duże obszary tkanek muszą być szybko zobrazowane.
Drugie podejście zostało zademonstrowane poprzez sprzężenie obiektywu o dużym powiększeniu z istniejącym systemem FT-IR, który wykorzystuje synchrotron jako jasne źródło podczerwieni, możliwe jest pełne oświetlenie FPA i obrazu o efektywnym rozmiarze piksela 0,54 x 0,54 μm. Pozwoliło nam to na wizualizację kluczowych struktur w tkankach piersi i prostaty, których nie można było rozdzielić za pomocą konwencjonalnych systemów FT-IR4. Podczas gdy te dramatyczne wzrosty rozdzielczości przestrzennej obrazu w podczerwieni były ekscytujące, jego zastosowanie pozostało ograniczone ze względu na konieczność użycia synchrotronu. Następnie zaprojektowano optymalny system, który mógł również pozwolić na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości o rozmiarze piksela 1,1 x 1,1 μm bez konieczności korzystania ze źródła synchrotronowego, ale przy użyciu tradycyjnego źródła podczerwieni w kształcie kuli5. W tym artykule pokazujemy, jak zmodyfikować istniejący komercyjny system obrazowania FT-IR, aby umożliwić obrazowanie w podczerwieni w podczerwieni z ograniczeniem dyfrakcji tkanek o akceptowalnym stosunku sygnału do szumu przy użyciu wielu obiektywów IR (15X, 36X i 74X). Efektywny rozmiar piksela w przypadku trzech obiektywów wynosi 5,5 x 5,5 μm (15X), 2,2 x 2,2 μm (36X) i 1,1 x 1,1 μm (74X). Następnie podajemy kilka przykładów znaczenia przyrostu rozdzielczości przestrzennej dla wykrywania chorób w biopsjach wątroby i nerek27.

<table><tbody><tr><td>System FT-IR Cary serii 600</td><td>Agilent</td><td>Wiele konfiguracji&nbsp;</td><td>Istnieją alternatywne systemy obrazowania FT-IR</td></tr><tr><td>Regulowany obiektyw ReflX 74X/0,65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Regulowany obiektyw ReflX 36X/0,5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>Suwak MirrIR</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>Do pomiarów w trybie odbicia FT-IR</td></tr><tr><td>Szkiełka z fluorku baru</td><td>Międzynarodowe Laboratoria Kryształowe</td><td>Wiele rozmiarów</td><td>Do pomiarów w trybie transmisji FT-IR</td></tr><tr><td>Preparaty z fluorku wapnia</td><td>Międzynarodowe Laboratoria Kryształowe</td><td>Wiele rozmiarów</td><td>Do pomiarów w trybie transmisji FT-IR</td></tr><tr><td>Suchy gaz azotowy/suche powietrze</td><td>Wielu dostawców gazu</td><td>Wiele rozmiarów</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Wiele rozmiarów</td><td>Do deparafinizacji tkanek</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Wielu dostawców cieczy kriogenicznych</td><td>Wiele rozmiarów</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ENVI-IDL</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Inne dostępne pakiety oprogramowania</td></tr><tr><td>Imager całego slajdu</td><td>Scanscope (Aperio) lub Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>Do obrazowania barwionych preparatów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją fouriera (ft-ir) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) w wysokiej rozdzielczości to nowe podejście do uzyskiwania szczegółowych obrazów, które zawierają informacje biochemiczne. Obrazowanie tkanek metodą FT-IR opiera się na zasadzie, że różne obszary średniej podczerwieni są absorbowane przez różne wiązania chemiczne (np. C = O, C-H, N-H) w komórkach lub tkankach, które można następnie powiązać z obecnością i składem biomolekuł (np. lipidów, DNA, glikogenu, białka, kolagenu). W obrazie FT-IR każdy piksel na obrazie zawiera całe widmo podczerwieni (IR), które może dostarczyć informacji o stanie biochemicznym komórek, które można następnie wykorzystać do klasyfikacji typu komórki lub typu choroby. W tym artykule pokazujemy: jak uzyskać obrazy w podczerwieni z tkanek ludzkich za pomocą systemu FT-IR, jak zmodyfikować istniejące oprzyrządowanie, aby umożliwić obrazowanie w wysokiej rozdzielczości oraz jak wizualizować obrazy FT-IR. Następnie przedstawiamy niektóre zastosowania FT-IR w patologii na przykładzie wątroby i nerek. Obrazowanie FT-IR ma ekscytujące zastosowania, zapewniając nową drogę do uzyskiwania informacji biochemicznych z komórek i tkanek w całkowicie pozbawionej znaczników, niezakłócającej trasie, w kierunku uzyskania nowego wglądu w zmiany biomolekularne jako część procesów chorobowych. Ponadto te informacje biochemiczne mogą potencjalnie pozwolić na obiektywną i zautomatyzowaną analizę niektórych aspektów diagnozowania chorób.

Obrazowanie FT-IR umożliwia uzyskiwanie obrazów IR tkanek, które mogą wykazywać różny kontrast w zależności od interesującej nas częstotliwości IR. Ponadto w obrazie IR każdy piksel zawiera pełne widmo IR, w którym poszczególne piki odpowiadają różnym biomolekułom, co pozwala uzyskać informacje o właściwościach biochemicznych typów komórek lub stanów chorobowych (Rysunek 1). W niniejszej pracy pokazaliśmy, jak porównywać sygnatury spektralne między klasami, jednak możliwe jest zastosowanie bardziej zaawansowanej automatycznej klasyfikacji z wykorzystaniem dodatkowych algorytmów3,43-50, takich jak klasyfikacja bayesowska, lasy losowe (Random Forests), sztuczne sieci neuronowe oraz hierarchiczna analiza skupień. Podejścia oparte na klasyfikacji nadzorowanej pozwalają na stworzenie klasyfikatora, który może zostać wytrenowany do automatycznego rozpoznawania typów komórek lub stanów chorobowych. Z kolei podejścia oparte na klasyfikacji nienadzorowanej mogą być wykorzystywane do poszukiwania naturalnie występujących różnic w tkankach lub komórkach wynikających z wariancji biochemicznej.
Instrumentarium FT-IR ewoluowało w ciągu ostatnich kilku dekad: od pomiarów w trybie pojedynczego punktu lub mapowania z wykorzystaniem nieprzezroczystych dla podczerwieni apertur, po tryb obrazowania z użyciem obiektywów Cassegraina, wykorzystujących albo obiektyw oświetlający sprzężony z obiektywem zbierającym w trybie transmisji, albo pojedynczy obiektyw, który jednocześnie oświetla i zbiera sygnał w trybie odbiciowym (Ryc. 2). Niedawno wykazano, że obiektyw zbierający w trybie transmisji można zastąpić obiektywem o większym powiększeniu i aperturze numerycznej, co pozwala na obrazowanie w podczerwieni z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie, prowadząc do znacznego wzrostu rozdzielczości przestrzennej pozyskiwanych obrazów IR4,5. Postępy w rozdzielczości przestrzennej obrazowania tkanek mają krytyczne znaczenie, ponieważ możemy teraz identyfikować typy komórek i struktury tkankowe, na przykład jednostki funkcjonalne nerki – kłębki nerkowe, przy użyciu dostosowanych wewnętrznie systemów FT-IR (Ryc. 3).
Obrazowanie FT-IR w wysokiej rozdzielczości pozwala na badanie szczegółowych obrazów tkanek w celu zidentyfikowania obszarów nieprawidłowych oraz określenia różnic biochemicznych między różnymi typami komórek. W rdzeniu tkanki wątroby możliwe jest zwizualizowanie hepatocytów oraz obszarów naciekającej włóknicy, która oddziela dwa odrębne obszary dysplazji i cyrozy niedysplastycznej (Rysunek 4). Pracujemy nad wykorzystaniem tej metody do stworzenia zautomatyzowanych narzędzi diagnostycznych do stosowania w trudnych przypadkach chorób wątroby.
Co istotne, zwiększona rozdzielczość przestrzenna pozwala nam obecnie wyizolować konkretne cechy strukturalne, które mogą ulec modyfikacjom chemicznym w wyniku choroby, zanim wystąpią widoczne zmiany histologiczne. Przykładowo, skupiamy się na identyfikacji zmian biochemicznych w strukturach kłębuszków nerkowych, takich jak torebka Bowmana, kłębuszek naczyniowy, błona bazalna kłębuszka oraz błona bazalna cewek, zanim zostaną zaobserwowane zmiany możliwe do zdiagnozowania przez patologa (Rysunek 5). W szczególności zależy nam na zidentyfikowaniu zmian związanych z progresją nefropatii cukrzycowej oraz przewlekłym odrzucaniu przeszczepu u pacjentów po transplantacji, w przypadkach, gdy obecne techniki nie pozwalają na wykrycie zmian wystarczająco wcześnie, aby umożliwić skuteczną interwencję.
<img alt="Histologia i spektroskopia FTIR tkanki; schemat przedstawiający absorbancję w funkcji liczby falowej z pikami." src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Obrazy FT-IR i widmo z rdzenia wątroby. Obraz (A) rdzenia z biopsji wątroby barwionego H&amp;E oraz obrazy absorbancji IR seryjnych przekrojów tego samego rdzenia przy (B) 3,286 cm-1 i (C) 2,603 cm-1, które uwypukliły różne cechy strukturalne. (D) Typowe widmo IR tkanki z oznaczonymi istotnymi pikami. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii podczerwonej w trybie transmisji i odbicia; preparat z przekrojem tkanki na płytce IR z obiektywami." src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat optyczny szczegółowo przedstawiający tryby pracy mikroskopu FT-IR. (A) W trybie transmisji próbka jest oświetlana przez dolny obiektyw, a światło przechodzące przez próbkę jest zbierane przez górny obiektyw. (B) W trybie odbicia górny obiektyw służy zarówno do oświetlania próbki, jak i do zbierania światła odbitego. Dolny obiektyw nie jest wykorzystywany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, mikroskopia w skali szarości, porównanie rozdzielczości szczegółów komórkowych." src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Porównanie różnych obiektywów mikroskopowych na obrazach FT-IR kłębuszka nerkowego przy 2,925 cm-1. (A) Obiektyw zbierający 15X z NA = 0,5 (rozmiar piksela 5,5 x 5,5 µm). (B) Obiektyw zbierający 36X z NA = 0,5 (rozmiar piksela 2,2 x 2,2 µm). (C) Obiektyw zbierający 74X z NA = 0,65 (rozmiar piksela 1,1 x 1,1 µm). Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza tkanki hepatocytów i włóknienia; widma absorbancji, histologia, różnice biochemiczne." src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Różnice spektralne między włóknieniem a hepatocytami w rdzeniu wątroby. (A) Rdzeń z biopsji wątroby barwiony H&amp;E. (B) Obraz rdzenia z przekroju seryjnego przeskanowanego w FT-IR (ustawienie z obiektywem 36X). (C) Reprezentatywne widma hepatocytów i włóknienia, pobrane z obszarów tkanki wskazanych strzałkami na (A) i (B). Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia kłębuszka nerkowego; widma FTIR błon; obraz mikroskopowy; analiza widmowa." src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Różnicowanie cech biopsji tkanki nerkowej przy użyciu obrazowania FT-IR o wysokiej rozdzielczości. (A) Przekrój barwiony kwasem okresowym i Schiffem z oznaczonymi cechami do ekstrakcji. (B) Obraz FT-IR o wysokiej rozdzielczości w obszarze asymetrycznego rozciągania CH2 (ustawienie z obiektywem 36X) seryjnego przekroju tej samej tkanki. (C) Cechy oznaczone na (A) wyekstrahowane przy użyciu obrazu FT-IR z (B) w celu chemicznego zróżnicowania czterech struktur tkankowych. Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) jest szybkim i bezznacznikowym podejściem do uzyskiwania zestawów danych biochemicznych komórek i tkanek. W tym miejscu pokazujemy, jak uzyskać obrazy FT-IR o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek w celu poprawy diagnostyki choroby.

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokorozdzielczych obrazów w podczerwieni próbek tkanek. Jest to realizowane poprzez wstępne cięcie próbek tkanek na szkiełka kompatybilne z podczerwienią. Drugim krokiem jest przygotowanie aparatury do obrazowania wysokiej rozdzielczości poprzez zainstalowanie odpowiednich obiektywów.Następnie pobierane jest tło podłoża i skanowana jest próbka tkanki. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania i wizualizacji danych. W rezultacie obrazowanie w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości służy do wizualizacji i pozyskiwania informacji biochemicznych z tkanek biologicznych w sposób nieinwazyjny.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia świetlna, jest możliwość badania naturalnej biochemii tkanki bez użycia barwników lub sond. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patologii, takie jak przewidywanie nawrotów nefropatii cukrzycowej i klasyfikacja progresji chorób wątroby poprzez osteogenezę HEPA car. Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę i prognozowanie chorób, biorąc pod uwagę, że dostarcza ona ogromnej ilości informacji biochemicznych, które nie są dostępne w tradycyjnej histopatologii.Choć metoda ta może być stosowana w diagnostyce, może być również wykorzystywana do śledzenia zmian w procesie gojenia ran oraz identyfikacji kluczowych cech tkankowych, takich jak komórki macierzyste w przewodzie pokarmowym i mózgu. W pierwszej kolejności należy wykonać skrawki z formalnie utrwalonego bloku tkankowego zatopionego w parafinie o grubości 4 µm na slajd kompatybilny z IR, używając mikrotomu.Następnie należy przepłukać mikroskop i spektrometr FTIR suchym powietrzem, aby usunąć z układu wodę atmosferyczną. Następnie schłodzić ciekłym azotem zarówno detektor matrycy płaszczyzny ogniskowej, jak i wewnętrzny detektor tellurku kadmu i rtęci w mikroskopie. Po upewnieniu się, że światło widzialne jest włączone, umieścić preparat na stole mikroskopu do obrazowania FTIR, a następnie ustawić ostrość na próbce za pomocą programu do przechwytywania obrazu.Następnie otwórz pakiet oprogramowania bundle i kliknij collect. Kliknij diagnostics i wybierz line spectrometer. Następnie kliknij imaging setup, aby skalibrować system.W zakładce optics wybierz detector jako ground microscope detector as left, a następnie wybierz transmittance w polu optics mode. Kliknij setup, co otworzy okno sterowania Lancer dla trybu transmisji w sterowniku Lancer. Kliknij raw, a następnie, używając dżojstika sterowania stolikiem i obserwując podgląd na żywo obrazu interferogramu FTIR, przesuń się do czystego obszaru preparatu.Na tym etapie należy ustawić czas integracji na około 8 000 zliczeń oraz wyregulować obiektyw kondensora dolnego. Aby zwiększyć liczbę zliczeń do maksimum, należy obserwować kształt obrazu w prawym dolnym rogu w panelu sterowania Lancer, upewniając się, że ma on rozkład Gaussa i jest stosunkowo jednolity. Po ponownym dostosowaniu czasu integracji należy przesunąć stolik, aby znaleźć fragment tkanki o wyraźnej strukturze, najlepiej krawędź tkanki.Następnie precyzyjnie ustaw ostrość obrazu. Za pomocą dżojstika sterującego stolikiem przesuń preparat w czysty obszar slajdu. Po wybraniu odpowiedniego miejsca naciśnij przycisk kalibracji.Następnie, w zakładce optics wybierz detector równy MCT oraz microscope detector równy right. Kliknij setup. Gdy interferogram FTIR zostanie wyświetlony na ekranie, kliknij find center burst, a następnie okay.W zakładce optics ponownie wybierz detector equals ground microscope detector equals left. Następnie wybierz setup. Po upewnieniu się, że obraz w programie lancer control nadal znajduje się na czystym obszarze, kliknij ponownie calibrate, a następnie okay.Aby zebrać obraz tła FTIR, przejdź do karty elektroniki i wybierz odpowiednią rozdzielczość spektralną, która zazwyczaj wynosi cztery lub osiem cm⁻¹. W przypadku tkanek przejdź do karty tła i wpisz 128 w polu skanów do uśrednienia. Wybierz przycisk nowego pliku i zapisz plik tła w odpowiednim folderze.Po kliknięciu tła i odczekaniu do zakończenia skanowania, zatwierdź miejsce zapisu pliku. Kliknij wybrany obszar na tle, obrazie FTIR i sprawdź widmo. W tym momencie kliknij setup, a następnie w sekcji lancer control skorzystaj z funkcji live IR view.Aby znaleźć obszar zainteresowania, przejdź do karty elektroniki i wpisz liczbę skanów do uśrednienia. Następnie kliknij scan. Aby przygotować mikroskop FTIR do analizy o wysokiej rozdzielczości, wkręć obiektyw o dużym powiększeniu w miejsce obiektywu 15x. W tym momencie otwórz oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów oraz załaduj plik danych IR.Zastosuj algorytm korekcji linii bazowej do danych IR, wybierając narzędzia spektralne (spectral tools), a następnie przewiń w dół i kliknij widma absorbancji (absorbent spectra). Gdy pojawi się menu wyskakujące, wybierz korekcję linii bazowej (baseline correction). Przeprowadź normalizację widm, wybierając widma znormalizowane (normalized spectra) w opcjach menu widm absorbancji.Następnie zapoznaj się z listą wszystkich częstotliwości IR zarejestrowanych na obrazie. Kliknij częstotliwości odpowiadające konkretnym biomolekułom, aby wyświetlić obraz tkanki przy wybranej częstotliwości, co pozwoli na wizualizację różnych komponentów biomolekularnych. Kliknij narzędzia spektralne, a następnie wybierz stosunki wysokości piku.Zeskanuj odpowiadający sąsiedni barwiony przekrój tkanki, korzystając z osobnego systemu skanera całych preparatów, który rejestruje obrazy w świetle przechodzącym obok obrazu IR. Wyświetl cyfrowy obraz barwionej tkanki w programie do obrazowania światła widzialnego. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie w obszarze zainteresowania i wybierz profil Z, aby uzyskać informacje spektralne dla wybranego piksela.Aby zaznaczyć konkretne piksele na obrazie, kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wybierz narzędzie ROI. Utwórz klasy, które mają zostać oznakowane, na przykład klasy Meum i torebka Bowmana. Następnie wybierz typ ROI „punkt”, po czym wybierz klasę, dla której chcesz zaznaczyć piksele, i zaznacz odpowiednie piksele na obrazie IR.Wyznacz widma średnie dla każdej z klas, korzystając z narzędzia do uśredniania ROI. Na koniec porównaj uzyskane widma za pomocą wykresów. W oprogramowaniu graficznym obrazowanie FT IR umożliwia generowanie obrazów IR tkanki, które mogą zapewniać różny kontrast w zależności od częstotliwości IR.Każdy piksel składa się z całego widma z różnymi pikami odpowiadającymi różnym biomolekułom, które mogą dostarczyć informacji o właściwościach biochemicznych typów komórek lub stanach chorobowych. Instrumentacja FTIR ewoluowała od pomiarów w trybie mapowania w pojedynczym punkcie z użyciem nieprzezroczystych apertur do trybu obrazowania z użyciem obiektywów ziarnistych CASA, wykorzystujących albo obiektyw oświetlający sprzężony z obiektywem zbierającym w trybie transmisji, albo pojedynczy obiektyw, który jednocześnie oświetla i zbiera sygnał w trybie odbicia. Postępy w rozdzielczości przestrzennej w obrazowaniu tkanek mają kluczowe znaczenie, ponieważ obecnie możliwe jest zidentyfikowanie typów komórek i struktur tkankowych.W tym przypadku jednostki funkcjonalne kłębuszków nerkowych zaobserwowano w rdzeniu tkanki wątroby. Możliwa jest wizualizacja hepatocytów oraz obszarów naciekającego włóknienia, które rozdziela dwa odrębne obszary dysplazji i marskości niedysplastycznej. Zwiększona rozdzielczość przestrzenna pozwala na wyizolowanie specyficznych cech strukturalnych, które mogą zostać zmodyfikowane chemicznie przez chorobę przed wystąpieniem widocznych zmian histologicznych.Zmiany biochemiczne w strukturach kłębuszków nerkowych, takich jak torebka Bowmana, mezangium, błona bazalna kłębuszka i błona bazalna kanalików, mogą zostać zidentyfikowane za pomocą obrazowania FTIR. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed skanowaniem całkowicie odwodnić preparaty. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak tradycyjna analiza immunochemiczna, na tym samym skrawku tkanki w celu skorelowania sygnatur biochemicznych z morfologią tkanki.Ta technika, będąca naszym pierwszym opracowaniem, utorowała drogę badaczom w dziedzinie obrazowania tkanek do badania stanu biomolekularnego niewielkich typów komórek i struktur w obrębie tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać podstawową wiedzę na temat tego, jak uzyskać wysokiej rozdzielczości obrazy FTR próbek tkankowych oraz jak przeprowadzić podstawową analizę spektralną. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa, takich jak stosowanie rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych.

high-definition-fourier-transform-infrared-ft-ir-spectroscopic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokiej rozdzielczości widmowe obrazy transformacji Fouriera w podczerwieni (FT-IR) przekrojów tkanek ludzkich w celu poprawy patologii

Opisano metodę obrazowania preparatów z resekcji płuc ex vivo za pomocą obrazowania w dziedzinie częstotliwości optycznych (OFDI) oraz uzyskiwania precyzyjnej korelacji z histologią, co jest niezbędne do opracowania specyficznych kryteriów interpretacji OFDI w patologii płuc. Metoda ta może być zastosowana w przypadku innych typów tkanek i technik obrazowania w celu uzyskania precyzyjnej korelacji obrazowania z histologią dla dokładnej interpretacji i oceny obrazów. Kryteria obrazowania...

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Opisano protokół wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z przezroczystymi otworami do obrazowania światłem widzialnym i podczerwonym.

Miękka procedura litograficzna do wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z otworami widokowymi przezroczystymi dla światła widzialnego i podczerwonego

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Obecny protokół opisuje szczegółową operację obrazowania fluorescencyjnego NIR-II w czasie rzeczywistym myszy za pomocą urządzenia do obrazowania optycznego NIR-II.

Jasna sonda fluorescencyjna NIR-II do obrazowania naczyń krwionośnych i nowotworów

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

To badanie przedstawia metodę korelacyjnego obrazowania leków w tkankach miękkich za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas. Połączenie obrazowania skóry w wysokiej rozdzielczości z czułym wykrywaniem leków stanowi cenne podejście do badania dystrybucji leków w skórze, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania doskonałych produktów do stosowania miejscowego.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Szczegółowo opisujemy nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), służący do dwuwymiarowego wewnątrznaczyniowego obrazowania molekularnego biologii blaszki miażdżycowej in vivo. Cewnik NIRF umożliwia wizualizację kluczowych procesów biologicznych, takich jak zapalenie, poprzez wykrywanie obecności aktywowalnych i celowanych fluorochromów NIR wykazujących powinowactwo do blaszki miażdżycowej. Cewnik spełnia wymogi inżynieryjne i energetyczne stosowane w klinice i jest...

In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym o wysokiej rozdzielczości (HD-tDCS), z montażem pierścieniowym 4x1, jest nieinwazyjną techniką stymulacji mózgu, która łączy w sobie zarówno neuromodulacyjne efekty konwencjonalnego tDCS, jak i zwiększoną ogniskowość. Niniejszy artykuł zawiera systematyczną demonstrację zastosowania 4x1 HD-tDCS oraz zagadnienia potrzebne do bezpiecznej i skutecznej stymulacji.

Technika i rozważania dotyczące stosowania przezczaszkowej stymulacji prądem stałym o wysokiej rozdzielczości z pierścieniem 4x1 (HD-tDCS)

Poznaj obrazowanie FT-IR wysokiej rozdzielczości ludzkich tkanek w celu uzyskania danych biochemicznych bez znakowania. Ta metoda poprawia diagnostykę chorób poprzez wizualizację wewnętrznej biochemii próbek.

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie spektroskopowe w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) o wysokiej rozdzielczości skrawków tkanek ludzkich w kierunku poprawy patologii

Przeglądaj więcej filmów