Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie dwóch systemów testów toksyczności rozwojowej in vitro opartych na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych oraz badaniach transkryptomu. Jest to realizowane poprzez uprawę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na mysich embrionalnych fibroblastach. W drugim kroku ludzkie embrionalne komórki macierzyste formują ciała embrionalne (Embry bodies), w których mogą generować komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, lub są różnicowane w progenitory neuroektodermalne.

Następnie ciała embrionów lub progenitory neuroektodermalne są poddawane działaniu badanych związków w różnych stężeniach podczas różnicowania. Końcowe etapy obejmują ocenę żywotności komórek oraz izolację RNA. Ostatecznie analiza mikromacierzy transkryptomicznej jest wykorzystywana do wykazania zmian w ekspresji RNA komórek traktowanych badanym związkiem w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi. W oparciu o ludzkie neuronalne komórki macierzyste oraz makromacierze DNA opracowaliśmy metodologię in vitro umożliwiającą monitorowanie istotnych dla człowieka efektów toksyczności rozwojowej.

Metodologię tę może stosować przemysł farmaceutyczny i chemiczny do badań przesiewowych bezpieczeństwa potencjalnych leków i toksyn środowiskowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu toksyczności rozwojowej, takie jak wpływ substancji chemicznych na bardzo wczesny rozwój układu nerwowego. W pierwszej kolejności rozmrozić suplement do pożywki dla komórek macierzystych w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 100 milliliters suplementu do 400 milliliters podstawowej pożywki dla komórek macierzystych.

Następnie rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie, a potem dodać zalecaną przez producenta objętość matrycy do 24 ml schłodzonej pożywki podstawowej dmm. F 12. Roztwór wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie nanieść po 2 ml mieszaniny na 12 osobnych płytek sześciocentymetrowych. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby matryca pokryła powierzchnię płytek.

Następnie usunąć medium i dodać 2 mL medium do komórek macierzystych. Następnie wyjąć z inkubatora cztery konfluentne płytki zawierające ludzkie embrionalne komórki H9 hodowane na warstwach zasilających z embrionalnych fibroblastów mysich, przygotowanych zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Pod stereoskopem, używając końcówki do pipety o pojemności 1 mL, usunąć z płytki zróżnicowane kolonie.

Kolonie nieróżnicowane mają wyraźnie zdefiniowane brzegi, a komórki są zwarte, natomiast komórki różnicowane zaczynają rozprzestrzeniać się poza brzegi i mają większy rozmiar. Odessać pożywkę i przemyć komórki czterema mililitrami PBS. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, dodać dwa mililitry pożywki dla komórek macierzystych.

Podziel każdą z kolonii na sześć do dziewięciu fragmentów za pomocą igły o rozmiarze 26 G, a następnie zeskrob grudki końcówkami pipet o pojemności 1 ml. Ostrożnie zbierz pocięte kolonie do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i odwiruj je przy 200 G przez pięć minut. Następnie odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w 12 ml pożywki do komórek macierzystych.

Nanieś 20 µL zawiesiny komórkowej na szkiełko przedmiotowe i policz liczbę agregatów pod mikroskopem. Dostosuj stężenie zawiesiny do 150 agregatów na mL, a następnie dodaj 2 mL zawiesiny do każdej płytki o średnicy 6 cm. Poruszaj płytkami w przód i w tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki, a następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych co drugi dzień.

Ostrożna wymiana pożywki. Po usunięciu zróżnicowanych kolonii, do każdej studni płytki Vbo 96-dołkowej należy dodać 40 µL sterylnego 5% roztworu kopolimeru blokowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Płytkę z konfluencyjnymi koloniami należy wyjąć z inkubatora, a następnie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 mL wyłowić zróżnicowane kolonie pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie należy odessać pożywkę z płytki i delikatnie przemyć komórki 4 mL PBS.

Następnie do każdej płytki należy dodać dwa mililitry pożywki do różnicowania losowego. Za pomocą narzędzia do pasażowania należy podzielić kolonie komórek H9 na skupiska o jednolitym rozmiarze. Skupiska należy zebrać za pomocą skrobaka do komórek i ostrożnie przenieść do probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów.

Odwiruj kolonie z prędkością 200 G przez pięć minut, a następnie odessij nadsącz i resuspenduj komórki w pożywce różnicującej, aby uzyskać stężenie 1000 kolonii na mililitr. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, odessij kopolimer blokowy z V-kształtnej płytki 96-dołkowej i dodaj 100 µL zawiesiny kolonii do każdego dołka. Zagreguj kolonie na dnie V-kształtnych dołków poprzez wirowanie płytki w temperaturze 4 °C przez cztery minuty przy 400 G. Następnie umieść płytkę w inkubatorze na cztery dni. Używając końcówek 200 µL o szerszym otworze, przenieś ciałka zarodkowe z płytki 96-dołkowej do sterylnej, kwadratowej płytki o wymiarach 122 mm.

Następnie, używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, przenieś ciała embrionów z płytki kwadratowej do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml. Pozostaw ciała embrionów na dwie minuty, aby opadły na dno, a następnie odessij nadsącz i przemyj ciała embrionów 5 ml PBS. Ponownie odczekaj dwie minuty do opadnięcia ciał embrionów, a następnie odessij nadsącz.

Tym razem resuspender ciała embrionalne w pięciu mililitrach pożywki do różnicowania losowego. Następnie przenieść ciała embrionalne na 10 centymetrową płytkę bakteriologiczną i dodać kolejne 10 mililitrów pożywki do różnicowania losowego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na wytrząsarce poziomej.

Przy 50 RPM przedstawiono reprezentatywne ciała embrionalne dla dnia piątego, dziewiątego i czternastego. Należy ostrożnie wymieniać medium co drugi dzień, zastępując całe 15 mililitrów świeżym medium do różnicowania losowego. Aby ocenić wpływ leku na różnicowanie, należy rozpocząć dodawanie leku do medium w dniu piątym i kontynuować przez 10 dni, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Za pomocą sterylnej pipety przenieś ciała embrionów z płytek 10 centymetrowych do probówki typu Falcon o pojemności 15 mililitrów. Pozostaw je na dwie minuty, aby osiadły, a następnie odessaj nadsącz. Przemyj je pięcioma mililitrami PBS i przenieś do probówki 1,5 mililitra wolnej od nukleaz.

Pozostawić je do osadzenia i odessać nadsącz. Zawiesić ciała embrionów w 1 ml odczynnika triol i przepuścić roztwór przez igłę 24G za pomocą strzykawki 1 ml około 15 razy, aby rozbić komórki. Następnie dodać 200 µL chloroformu do każdej próbki.

Krótko wymieszać zawartość w vorteksie, a następnie wirować próbki przy 12, 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza; zebrać nadsącz do probówek 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć pozostałych warstw. Następnie do nadsączu dodać równą objętość schłodzonego 70% etanolu i delikatnie wymieszać zawartość poprzez potrząsanie. Przenieść 700 µL mieszaniny do mini kolumny wirowej i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby oczyścić RNA w końcowym etapie elucji.

Nanieś 22 µL wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej i wiruj probówki przy 12 000 G przez jedną minutę. Następnie wyjmij probówkę zbiorczą i umieść RNA na lodzie. Dodaj 1 mL uprzednio ogrzanego roztworu z dyskiem na każdą konfluencją kolbę T25 z komórkami H9 i inkubuj kolbę przez dziewięć minut w temperaturze 37 °C.

Następnie dodaj 2 mL podgrzanego wcześniej medium płuczącego do odwirowanych komórek traktowanych i delikatnie pipetuj w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety 5 mL. Przenieś zawiesinę komórek do probówki typu Falcon.

Następnie wypłucz kolbę dziewięcioma mililitrami medium płuczącego i dodaj je do probówki z komórkami. Wirować w celu zebrania komórek przez trzy i pół minuty przy 500 G. Następnie usunąć nadosad i resuspendować komórki w 10 mililitrach medium płuczącego. Ponownie wirować komórki przez trzy i pół minuty przy 500 G, a następnie usunąć nadosad i resuspendować komórki w czterech mililitrach medium dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych; dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej oraz 4,5 mililitra świeżego medium do świeżej, wypłukanej PBS kolby T 25 zawierającej mitotycznie inaktywowane mysie fibroblasty embrionalne.

Wymieniaj pożywkę w kolbie każdego dnia. Pokryj szalkę 10 centymetrową 0,1% żelatyną w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zbierz ludzkie embrionalne komórki macierzyste, usuwając pożywkę i dodając jeden mililitr acuty do kolby T 25 podczas odrywania się komórek.

Dodaj 6,6 ml zimnej pożywki do 330 µl zamrożonej macierzy błony podstawnej. Przefiltruj roztwór przez sito komórkowe o oczkach 40 µm i użyj 1 ml przefiltrowanego roztworu, aby pokryć każdą studzienkę płytki sześciodołkowej. Komórki zostaną później wysiane na pokryte płytki; po 30 minutowej inkubacji ludzkich komórek embrionalnych z Accutane, zatrzymaj reakcję, dodając 1,5 ml pożywki Hessa.

Zeskrob komórki z kolby, a następnie dodaj dodatkowe 8 ml pożywki Hess. Przygotuj jednorodną zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół za pomocą pipety 10 ml. Przefiltruj komórki przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm, a następnie odwiruj je przez 3 minuty przy 500 G. Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 10 ml pożywki; odwiruj komórki ponownie przez 3 minuty przy 500 G. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 10 ml pożywki Hess S zawierającej inhibitor ROCK Y 2 7 6 3 2 w stężeniu końcowym 10 µM.

Następnie usuń nadsącz z płytki pokrytej żelatyną, pozostawiając zawiesinę komórek na płytce pokrytej żelatyną, i inkubuj przez dokładnie jedną godzinę w temperaturze 37°C. Podczas tego etapu hipoblast osadzi się na płytkach pokrytych żelatyną, podczas gdy ludzkie embrionalne komórki macierzyste pozostaną wolne. Czas inkubacji jest kluczowy, ponieważ zbyt długa inkubacja doprowadzi do agregacji komórek macierzystych, a zbyt krótka sprawi, że tylko niewielka liczba fibroblastów zostanie usunięta po ich przytwierdzeniu.

Użyj medium znajdującego się na płytce, aby delikatnie wypłukać nieprzylegające komórki macierzyste z płytki. Przemyj płytkę drugi raz 10 milliliters mediuma Hessa i zbierz komórki, odwiruj je przez trzy minuty przy 500 G, usuń powstały supernatant i resuspenduj komórki w około czterech milliliters medium warunkowanego zawierającego 10 micromolar inhibitora rock Y 2, 7, 6, 3, 2 oraz 10 nanograms per milliliter czynnika wzrostu fibroblastów dwa. Następnie zmieszaj komórki z błęknitem tripanowym i policz je za pomocą komory licznikowej hemosytometru.

18 000 komórek na centymetr kwadratowy płytki przed nałożeniem błony podstawnej. Płytki powlekane błoną należy wypełnić 1,5 ml pożywki na dołek i inkubować w temperaturze 37 °C oraz 5% carbon dioxide. Po 24 godzinach należy odświeżyć pożywkę. Po kolejnych 24 godzinach należy zmienić pożywkę na świeżą pożywkę kondycjonowaną, uzupełnioną jedynie o 10 ng/ml fibroblast growth factor 2 przez 72 godziny.

Po wysianiu komórek należy wymienić pożywkę na pożywkę z zamiennikiem surowicy knockout. Ten moment określa się jako dzień zero różnicowania. Przez kolejne trzy dni codziennie należy odświeżać pożywkę komórek.

Podczas wymiany pożywki w czwartym i piątym dniu należy dodać pożywkę składającą się z 25% pożywki suplementowanej 25%N oraz 75% zamiennika surowicy knockout. W szóstym dniu należy zebrać komórki do analizy. Ciała zarodkowe mogą być wykorzystane w wielu różnych badaniach.

Oto przykład badania cytotoksyczności wykazujący wpływ różnych stężeń metylortęci na żywotność komórek. Na podstawie tego wykresu ustalono, że stężenie 24 micromolar spowodowało 10% śmierć komórek, a stężenie 1,61 micromolar spowodowało 50% śmierć komórek po 14 dniach ekspozycji. RNA wyizolowane z ciał embrionów z trzech grup traktowanych metylortęcią poddano analizie mikromacierzy w celu zbadania szerokiego spektrum biomarkerów.

Próbki eksponowane na 25 µM rtęci zaznaczono kolorem czerwonym. Próbki eksponowane na 1 µM metylortęci zaznaczono kolorem niebieskim, a RNA kontrolne kolorem zielonym. Ta mapa analizy głównych składowych wykazuje, że charakterystyka genetyczna każdej grupy badawczej znacząco różni się od pozostałych; w przypadku ekspozycji na stężenie 1 µM metylortęci ekspresja ponad 276 genów uległa zmianie ponad dwukrotnie.

30 z tych genów zostało zmodyfikowanych również w grupie o niższym stężeniu w punkcie 25 micromolar. Na tej mapie ciepła można zauważyć, że 233 z genów zmodyfikowanych w grupie traktowanej stężeniem one micromolar było genami o obniżonej ekspresji, a jedynie 43 wykazywało zwiększoną ekspresję pod wpływem badania. Należy pamiętać, że praca z triazolem lub mrówkami rozwojowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie gogli ochronnych, rękawic odpornych na chemikalia oraz przeprowadzanie wszystkich prac związanych z triolem w dygestorium.

Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak barwienie czy tworzenie sferosfer, które mogą uzupełnić analizę tworzenia cewek, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące zakotwiczenia fenotypowego.