Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie dwóch systemów badań toksyczności rozwojowej in vitro opartych na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Osiąga się to poprzez hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na mysich fibroblastach embrionalnych. Drugim krokiem jest pozwolenie ludzkim embrionalnym komórkom macierzystym na uformowanie ciał Embry'ego, w których mogą wytwarzać komórki wszystkich trzech listków rozrodczych lub różnicowanie ich w neuroektodermalne komórki progenitorowe.

Następnie ciała zarodkowe lub progenitorzy neuroektodermalni są traktowani związkami będącymi przedmiotem zainteresowania w różnych stężeniach podczas różnicowania. Ostatnim krokiem jest ocena żywotności komórek i wyizolowanie RNA. Ostatecznie analiza mikromacierzy transkryptomu służy do pokazania zmian w ekspresji RNA komórek traktowanych związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi Opierając się na ludzkich neonikonowych komórkach macierzystych i makroobszarach DNA, opracowaliśmy metodologię in vitro umożliwiającą monitorowanie istotnych skutków toksyczności rozwojowej dla człowieka.

Metodologia ta może być stosowana przez przemysł farmaceutyczny i chemiczny do badań przesiewowych pod kątem bezpieczeństwa potencjalnych leków i substancji toksycznych dla środowiska. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksyczności rozwojowej, takie jak wpływ substancji chemicznych na bardzo wczesny rozwój neurologiczny. Na początek rozmrozić suplement pożywki z komórkami macierzystymi w temperaturze pokojowej i dodać 100 mililitrów do 400 mililitrów podstawowej pożywki z komórek macierzystych.

Następnie rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie, a następnie dodać uzupełnioną objętość matrycy do 24 mililitrów schłodzonego DMM. F 12 podłoże podstawowe zgodnie z zaleceniami producenta, wymieszać roztwór, delikatnie pipetując w górę iw dół, a następnie dodać dwa mililitry mieszaniny do 12 oddzielnych sześciocentymetrowych płytek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę, podczas gdy matryca pokrywa płytki.

Następnie usuń pożywkę i dodaj dwa mililitry pożywki z komórkami macierzystymi. Następnie należy wyjąć cztery zlewające się płytki z inkubatora zawierającego ludzkie płytki embrionalne. H dziewięć komórek wyhodowanych na mysich embrionalnych warstwach podajnika fiberblast, które są przygotowane zgodnie z opisem w dołączonym protokole intext pod stereoskopem, użyj jednomililitrowej końcówki pipety i usuń zróżnicowane kolonie z płytki.

Niezróżnicowane kolonie mają dobrze zdefiniowane granice, a komórki są zwarte, podczas gdy zróżnicowane komórki zaczynają rozmnażać się z granic, a ich komórki są większe. Odessać pożywkę i przemyć komórki czterema mililitrami PBS. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki z komórkami macierzystymi z ósemką stereoskopu.

Pokrój kolonie na sześć do dziewięciu kawałków, z których każda jest igłą o rozmiarze 26 i zeskrob grudki za pomocą jednomililitrowych końcówek pipety. Delikatnie zbierz pokrojone kolonie do 50-mililitrowej probówki sokoła i granuluj je w 200 G przez pięć minut. Następnie odessać snat i ponownie zawiesić komórki w 12 mililitrach pożywki z komórek macierzystych.

Umieść 20 mikrolitrów zawiesiny komórek na szkiełku podstawowym i policz liczbę grudek pod mikroskopem. Dostosuj stężenie zawiesiny do 150 grudek na mililitr, a następnie dodaj dwa mililitry zawiesiny do każdej sześciocentymetrowej płytki. Przesuwaj płytki do przodu i do tyłu oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki, a następnie inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych co drugi dzień.

Ostrożnie zmień pożywkę Po usunięciu zróżnicowanych kolonii dodać 40 mikrolitrów sterylnego 5% roztworu kopolimeru blokowego do każdego dołka płytki dołkowej Vbo 96 i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Wyjąć z inkubatora zlewającą się płytkę zawierającą kolonie i wybrać wszelkie zróżnicowane kolonie pod mikroskopem stereoskopowym z jednomililitrową końcówką pipety. Następnie odessać pożywkę z płytki i delikatnie przemyć komórki czterema mililitrami PBS.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki do losowego różnicowania do każdej płytki. Użyj narzędzia do przejścia, aby przeciąć kolonie dziewięciu komórek H w kępy o jednolitym rozmiarze. Zeskrob grudki skrobakiem do komórek i delikatnie zbierz je do 50-mililitrowej wirówki z probówką sokoła.

Kolonia zbryla się w ilości 200 G przez pięć minut, a następnie odsysa naczynie i ponownie zawiesza komórkę i pożywkę do losowego różnicowania w ilości 1000 grudek na mililitr. Następnie odessać kopolimer blokowy z dolnej 96-dołkowej płytki V Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów zawiesiny kolonii do każdej studzienki agregować grudki na dnie studzienek w kształcie litery V, odwirowując płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty w temperaturze 400 G. Następnie umieść płytkę w inkubatorze na cztery dni, używając końcówek o szerszym otworze 200 mikrolitrów. Usuń ciała zarodków z płytki 96-dołkowej i umieść je na sterylnej płytce kwadratowej o średnicy 122 milimetrów.

Następnie użyj 10-mililitrowej sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść ciała zarodków z kwadratowej płytki do 15-mililitrowej probówki sokoła. Pozwól ciału zarodka osiąść na dwie minuty, a następnie odessać zarodek i umyć ciała zarodków pięcioma mililitrami PBS. Ponownie poczekaj, aż ciała zarodków uspokoją się przez dwie minuty, a następnie odessaj supernatant.

Tym razem ponownie zawiesić ciała zarodków w pięciu mililitrach pożywki do losowego różnicowania. Następnie przenieś ciała zarodków na 10-centymetrową płytkę bakteriologiczną i dodaj dodatkowe 10 mililitrów losowego różnicowania. Średni. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na wytrząsarce poziomej.

Przy 50 obr./min reprezentatywne ciała zarodkowe są pokazane dla dnia piątego, dziewiątego i czternastego. Ostrożnie zmieniaj podłoże co drugi dzień, zastępując wszystkie 15 mililitrów świeżym losowym różnicowaniem. Średni. Aby ocenić wpływ leku na różnicowanie, należy rozpocząć dodawanie leku do pożywki w piątym dniu przez 10 dni, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Za pomocą sterylnej pipety zbierz ciała zarodków z 10-centymetrowych płytek do 15-mililitrowej probówki sokoła. Pozwól im osiąść przez dwie minuty, a następnie odessaj supernatant. Umyj je pięcioma mililitrami PBS i przenieś do 1,5-mililitrowej probówki bez nukleazy.

Pozwól im się uspokoić i zaaspirować podbicie snat. Zawieś ciała zarodków w jednym mililitrze odczynnika triolowego i przepuść roztwór przez igłę o rozmiarze 24 za pomocą strzykawki o rozmiarze jednego mililitra około 15 razy, aby rozbić komórki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do każdej próbki.

Krótko zmieszać zawartość, a następnie odwirować próbki w temperaturze 12 000 G przez 15 minut W temperaturze czterech stopni Celsjusza zebrać supernatant w probówkach o pojemności 1,5 mililitra, nie naruszając żadnej z pozostałych warstw. Następnie dodaj równą objętość schłodzonego 70% etanolu do supernatantu i delikatnie wymieszaj zawartość, wstrząsając. Przenieś 700 mikrolitrów mieszaniny do mini kolumny wirowej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby oczyścić RNA w końcowym etapie elucji.

Nanieść 22 mikrolitry wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej i odwirować probówki o sile 12 000 G przez jedną minutę. Następnie wyjmij probówkę zbiorczą i umieść RNA na lodzie. Dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanej przestrzeni dyskowej na zlewającą się kolbę T 25 z dziewięcioma komórkami H i inkubować kolbę przez dziewięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj dwa mililitry podgrzewania. Przemyć pożywkę do przemieszczonych leczonych komórek i delikatnie pipetować w górę i w dół pięć razy za pomocą pięciomililitrowej pipety. Przenieść roztwór komórkowy do probówki Falcon.

Następnie umyj kolbę dziewięcioma mililitrami pożywki płuczącej i dodaj ją do probówki z komórkami. PT zbieraj komórki przez trzy i pół minuty w temperaturze 500 G, a następnie usuń snat i ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki myjącej. PT ponownie przez trzy i pół minuty w temperaturze 500 G, a następnie usunąć sup natant i ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej i 4,5 mililitra świeżej pożywki do świeżej kolby PBS przemytej T 25 zawierającej mitotycznie inaktywowane mysie fibroblasty embrionalne.

Codziennie zmieniaj pożywkę w kolbie. Posmaruj 10-centymetrowe naczynie 0,1% żelatyną w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie należy pobrać ludzkie embrionalne komórki macierzyste, usuwając pożywkę i dodać jeden mililitr acuty do kolby T 25, podczas gdy komórki się odłączają.

Dodaj 6,6 mililitra zimnego podłoża do 330 mikrolitrów zamrożonej matrycy membrany podstawnej. Przefiltrować roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i użyć jednego mililitra przefiltrowanego roztworu do przykrycia każdego dołka płytki sześciodołkowej. Komórki zostaną później posiane na powlekanych płytkach po 30-minutowej inkubacji ludzkich komórek embrionalnych z Accutane, zatrzymaj reakcję przez dodanie 1,5 mililitra pożywki Hessa.

Zeskrobać komórki z kolby, a następnie dodać dodatkowe osiem mililitrów pożywki Hessa. Wytworzyć roztwór pojedynczej komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowych pipet filtrujących komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, a następnie odwirować komórki przez trzy minuty W temperaturze 500 G usunąć supernatant S i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach średnich komórek wirowych ponownie na trzy minuty w temperaturze 500 G. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić. Zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki Hessa S zawierającej inhibitor skał Y 2 7 6 3 2 o końcowym stężeniu 10 mikromolowym.

Następnie usunąć supernatant z płytki pokrytej żelatyną, zawiesinę komórek na naczyniu pokrytym żelatyną i inkubować dokładnie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas tych etapów hipoplast osiądzie na płytkach pokrytych żelatyną, gdzie ludzkie embrionalne komórki macierzyste pozostaną wolne. Czas pływania ma kluczowe znaczenie, ponieważ długa inkubacja spowoduje zlepianie się komórek macierzystych, a krótka inkubacja usunie tylko kilka z tych fibroblastów, gdy fibroblasty się przyłączą.

Użyj pożywki w płytce, aby delikatnie zmyć nieprzylegające komórki macierzyste z płytki. Przemyć płytkę po raz drugi 10 mililitrami pożywki Hessa i połączyć komórki, odwirować komórki przez trzy minuty w temperaturze 500 G, usunąć powstały supernatant S i ponownie zawiesić komórki w około czterech mililitrach kondycjonowanego podłoża zawierającego 10 mikromoli inhibitora skały Y 2, 7, 6, 3, 2 i 10 nanogramów na mililitr czynnika wzrostu fiberblast dwa. Następnie wymieszaj komórki z błękitem trianowym i policz je na płytce cytometru hemocytometru.

18 000 komórek na centymetr kwadratowy na płycie przed piwnicą. Płytki pokryte membraną pokrywają komórki 1,5 mililitra pożywki na studzienkę i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach odśwież pożywkę Po kolejnych 24 godzinach zmień pożywkę na świeżo kondycjonowaną pożywkę uzupełnioną tylko 10 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu fibroblastów 2 72 godziny.

Po wysianiu komórek zmień pożywkę na pożywkę zastępczą do wybijania surowicy. Ten punkt czasowy jest określany jako dzień zerowy różnicowania. Odświeżaj komórki świeżą pożywką każdego dnia przez następne trzy dni.

Zmieniając pożywkę w czwartym i piątym dniu, dodaj składającą się z 25% N dwie uzupełnione pożywki i 75% zastępczą surowicę nokautującą. Pożywka: szóstego dnia zbierz komórki do analizy. Ciała zarodkowe mogą być wykorzystywane do wielu różnych badań.

Oto przykładowe badanie cytotoksyczności pokazujące wpływ różnych stężeń metylortęci na żywotność komórek. Na podstawie tego wykresu ustalono, że punkt 24 mikromolowy spowodował 10% śmierć komórki, a stężenie 1,61 mikromola spowodowało 50% śmierć komórki po ekspozycji przez 14 dni. RNA wyizolowane z ciał zarodkowych trzech grup leczonych metylortęcią przeprowadzono na mikromacierzy w celu przyjrzenia się szerokiej gamie biomarkerów.

Osoby narażone na działanie rtęci mikromolowej w punkcie 25 są zaznaczone na czerwono. Osoby narażone na działanie jednego mikromolowego metylu rtęci są pokazane na niebiesko, a kontrolny RNA jest pokazany na zielono. Ta mapa analizy głównych składowych pokazuje, że charakterystyka genetyczna każdej grupy leczonej różni się znacznie od pozostałych: w sumie ponad 276 genów zostało zmodyfikowanych ponad dwukrotnie pod wpływem jednego mikromolowego stężenia metylortęci.

30 z tych genów zostało również zmodyfikowanych przez grupę o niższym stężeniu w punkcie 25 mikromolowym. Na tej mapie cieplnej można zobaczyć, że 233 geny zmodyfikowane w jednej grupie leczenia mikromolowego były genami, które zostały obniżone, a tylko 43 zostały obniżone przez leczenie. Nie zapominaj, że praca z triazolem lub mrówkami rozwojowymi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie okularów septi, rękawic odpornych na chemikalia i wykonywanie wszystkich prac związanych z triolem w dygestorium, powinny być zawsze brane pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.

Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak barwienie, tworzenie feros, które mogą mieszać się z tworzeniem się rurek, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zakotwiczenie fenotypowe.