Name: Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę tworzenia żeli poliakryloamidowych do badania inwadopodiów i siły trakcyjnej w komórkach nowotworowych. Technika ta pozwala analizować wpływ sztywności macierzy na zachowanie raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych dla PAA
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o grubości 12 mm należy czyścić chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków.</li>
	<li>Podpal szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i szkiełko nakrywkowe o średnicy 14 mm w mikrostudzience każdego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm, przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena za pomocą pęsety.</li>
	<li>Mikrostudzienki należy traktować 200 μl 0,1 N NaOH przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zassać i wysuszyć mikrostudzienki na powietrzu przez 30 minut.</li>
	<li>Mikrostudzienki należy traktować 50-100 μl 3-aminopropylotrimetoksysilanu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Ta substancja chemiczna reaguje z plastikiem; Dlatego należy używać szklanych pipet i nie napełniać całkowicie mikrostudzienek, aby uniknąć kontaktu z plastikowym naczyniem.</li>
	<li>Myj mikrostudzienki ultraczystą wodą przez około 10 minut, aż 3-aminopropylotrimetoksysilan stanie się klarowny.</li>
	<li>Opłucz mikrostudzienki dwukrotnie ultraczystą wodą za pomocą wyciskanej butelki.</li>
	<li>Myj mikrostudzienki 2 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na średnią prędkość (~1 Hz) przez 10 minut.</li>
	<li>Zassać i wysuszyć mikrostudzienki na powietrzu przez 30 minut.</li>
	<li>Potraktuj mikrostudzienki 2 ml 0,5% roztworu aldehydu glutarowego w temperaturze pokojowej na kołysce ustawionej na średnią prędkość (~1 Hz) przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj mikrostudzienki 2 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej na kołysce ustawionym na średnią prędkość (~1 Hz) przez 10 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 30 minut.</li>
	<li>Suszyć mikrostudzienki pod ostrym kątem (60º lub większym) przez 30 min. 
	Uwaga: Naczynia można przechowywać przez 2 miesiące w eksykatorze.</li>
</ol>
2. Przygotowanie PAA do testów Invadopodia
<ol>
	<li>Aby uzyskać 1 ml roztworu miękkiego PAA (8% akrylamidu i 0,05% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 25 μl 2% BIS i 574 μl wody ultraczystej (tabela 1).</li>
	<li>Aby uzyskać 1 ml roztworu twardego PAA (8% akrylamidu i 0,35% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 175 μl 2% BIS i 409 μl wody ultraczystej (Tabela 1).</li>
	<li>Aby uzyskać 1 ml roztworu sztywnego PAA (12% akrylamidu i 0,60% BIS), należy połączyć 300 μl 40% akrylamidu, 300 μl 2% BIS i 169 μl wody ultraczystej (tabela 1).</li>
	<li>Odgazuj roztwory przez 15 minut. Dodaj 200, 215 i 230 μl fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml ludzkiego osocza w ultraczystej wodzie do odpowiednio miękkich, twardych i sztywnych roztworów PAA. Do wszystkich roztworów dodać 1 μl estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) kwasu akrylowego o stężeniu 10 mg/ml, 5 μl nadsiarczanu amonu o stężeniu 100 mg/ml i 2 μl N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED; Tabela 1). Mieszać delikatnie pipetując i unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworach.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			PAA 
			(1 ml)</td>
			<td>40% 
			AA 
			(μl)</td>
			<td>2% 
			BIS 
			(μl)</td>
			<td>Ultrapure 
			Woda 
			(μl)</td>
			<td>1 mg/ml 
			FN 
			(μl)</td>
			<td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;">10 mg/ml 
			NHS Ester 
			(μl)</td>
			<td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;">100 mg/ml 
			APS 
			(μl)</td>
			<td> 
			TEMED 
			(μl)</td>
			<td>Elastyczny 
			Moduł 
			Panie przewodniczący, panie i panowie!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miękki</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>25</td>
			<td>Okręg wyborczy 574</td> TGL
			<td>200</td> szt.
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Numer katalogowy 1023</td> TGL
		</tr>
		<tr>
			<td>twardy</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>175</td> Rozdział
			<td>Rejon 409</td> TGL
			<td>Rozdział 215</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Zobacz materiał 7307</td> TGL
		</tr>
		<tr>
			<td>sztywny</td>
			<td>300</td> szt.
			<td>300</td> szt.
			<td>Rozdział 169</td>
			<td>230</td> szt.
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Numer katalogowy: 22692</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętości składników i wynikowe moduły sprężystości dla miękkich, twardych i sztywnych PAA stosowanych w testach inwadopodiów. AA = akrylamid, FN = fibronektyna, APS = nadsiarczan amonu.
<ol start="5">
	<li>Odpipetować 8,48 μl roztworu PAA do środka każdej mikrostudzienki. 
	Uwaga: Objętość ta teoretycznie daje PAA o grubości 75 μm.</li>
	<li>Delikatnie opuść płomieniowaną stronę szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm na kroplę w mikrostudzience za pomocą pęsety.</li>
	<li>Pozostaw warstwowy roztwór PAA do polimeryzacji przez 15-30 minut. Sprawdź polimeryzację, sprawdzając pozostały roztwór.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 1x PBS do każdego naczynia i usuń 12 mm szkiełka nakrywkowe pęsetą. 
	Uwaga: 10x PBS jest wytwarzany w laboratorium i składa się z 0,011 M KH2PO4, 1,54 M NaCl i 0,056 M Na2HPO4.</li>
	<li>Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie PAA do testów siły trakcyjnej
<ol>
	<li>Aby uzyskać 1 ml roztworu miękkiego PAA (8% akrylamidu i 0,05% BIS), należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 25 μl 2% BIS i 566 μl wody ultraczystej (tabela 2).</li>
	<li>W 1 ml roztworu twardego PAA (8% akrylamidu i 0,35% BIS) należy połączyć 200 μl 40% akrylamidu, 175 μl 2% BIS i 401 μl wody ultraczystej (tabela 2).</li>
	<li>Aby uzyskać 1 ml roztworu sztywnego PAA (12% akrylamidu i 0,60% BIS), należy połączyć 300 μl 40% akrylamidu, 300 μl 2% BIS i 161 μl wody ultraczystej (tabela 2).</li>
	<li>Odgazowywać roztwory przez 15 minut. Dodać 200, 215 i 230 μl fibronektyny w ludzkim osoczu 1 mg/ml odpowiednio do miękkich, twardych i sztywnych roztworów PAA. Sonizacja 8 μl mikrosfer czerwonej fluorescencji o długości fali 200 nm (wzbudzenie/emisja 580/605 nm) przez 30 sek. Do każdego roztworu dodać 8 μl mikrosfer czerwonej fluorescencji o długości fali 200 nm, 1 μl estru NHS kwasu akrylowego o stężeniu 10 mg/ml, 5 μl nadsiarczanu amonu o stężeniu 100 mg/ml i 2 μl TEMED (Tabela 2). Mieszać delikatnie pipetując i unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworach.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="szerokość:40px"> 
			PAA 
			(1 ml)</td>
			<td>40% 
			AA 
			(μl)</td>
			<td>2% 
			BIS 
			(μl)</td>
			<td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;">Ultrapure 
			Woda 
			(μl)</td>
			<td>1 mg/ml 
			FN 
			(μl)</td>
			<td> 
			Mikrosfery 
			(μl)</td>
			<td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;">10 mg/ml 
			NHS Ester 
			(μl)</td>
			<td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;">100 mg/ml 
			APS 
			(μl)</td>
			<td> 
			TEMED 
			(μl)</td>
			<td>Elastyczny 
			Moduł 
			Panie przewodniczący, panie i panowie!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miękki</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>25</td>
			<td>Okręg wyborczy 566</td> TGL
			<td>200</td> szt.
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Numer katalogowy 1023</td> TGL
		</tr>
		<tr>
			<td>twardy</td>
			<td>200</td> szt.
			<td>175</td> Rozdział
			<td>Rejon 401</td> TGL
			<td>Rozdział 215</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Zobacz materiał 7307</td> TGL
		</tr>
		<tr>
			<td>sztywny</td>
			<td>300</td> szt.
			<td>300</td> szt.
			<td>161</td> szt.
			<td>230</td> szt.
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>Numer katalogowy: 22692</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Objętości składników i wynikowe moduły sprężystości dla miękkich, twardych i sztywnych PAA używanych w testach siły pociągowej. AA = akrylamid, FN = fibronektyna, APS = nadsiarczan amonu.
<ol start="5">
	<li>Odpipetować 8,48 μl roztworu PAA do środka każdej mikrostudzienki. 
	Uwaga: Objętość ta teoretycznie daje PAA o grubości 75 μm.</li>
	<li>Delikatnie opuść płomieniowaną stronę szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm na kroplę w mikrostudzience za pomocą pęsety.</li>
	<li>Pozostaw umieszczony warstwowo roztwór PAA do polimeryzacji przez 15-30 minut. Sprawdź polimeryzację, sprawdzając pozostały roztwór.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 1x PBS do każdego naczynia i usuń 12 mm szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety.</li>
	<li>Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.</li>
</ol>
4. Przygotowanie ECM do testów Invadopodia
<ol>
	<li>Podgrzać roztwór żelatyny (1% żelatyny i 1% sacharozy) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Potraktuj PAA 150 μl roztworu żelatyny przez 1 minutę, a następnie ostrożnie zassaj od dna mikrostudzienek, trzymając naczynia ze szklanym dnem pod kątem 45°.</li>
	<li>Wysuszyć pozostałą cienką warstwę żelatyny na PAA w mikrostudzienkach pod ostrym kątem (60° lub większym), aby zoptymalizować suszenie przez 60 minut.</li>
	<li>Potraktuj mikrostudzienki 2 ml schłodzonego 0,5% roztworu aldehydu glutarowego na lodzie przez 15 minut, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.</li>
	<li>Potraktuj mikrostudzienki 2 ml roztworu borowodorku sodu przez 1 minutę. Delikatnie postukaj w naczynia na stole, aby usunąć pęcherzyki, które tworzą się na powierzchni żelatyny.</li>
	<li>Odessać i przemyć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórzyć jeszcze dwa razy, w sumie przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór fibronektyny z ludzkiego osocza znakowany FITC do 50 μg/ml za pomocą 1x PBS i odwirować przy 175 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min. Albo kup dostępną w handlu znakowaną fibronektynę, albo oznacz ją w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 mg fibronektyny w 10 ml buforu boranowego (170 mM tetrahydratu metaboranu sodu i 40 mM NaCl) i umieścić w wężyku do dializy.</li>
		<li>Oznaczyć fibronektynę, umieszczając rurkę w 200 ml buforu boranowego zawierającego 6 mg rozpuszczonego FITC w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie na 1,5 godziny w ciemności.</li>
		<li>Dializować za pomocą 500 ml 1x PBS na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie przez 3 dni w ciemnym chłodnym pomieszczeniu (4 °C) z dwiema zmianami objętości dziennie.</li>
		<li>Obliczyć stężenie fibronektyny znakowanej FITC na podstawie gęstości optycznej rozcieńczonych podwielokrotności (1:200) przy 280 nm i 493 nm jako [OD280 – (0,36 x OD493)] / 1,4 razy współczynnik rozcieńczenia 200 razy 2 (który odpowiada za glicerol zagęszczający fibronektynę w następnym kroku), co daje jednostki mg/ml.</li>
		<li>Dializować przez noc w 50% roztworze glicerolu na mieszadle magnetycznym ustawionym na najniższe ustawienie przez noc w ciemnym chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potraktuj mikrostudzienki 150 μl roztworu fibronektyny znakowanego FITC w temperaturze pokojowej przez 60 minut w ciemności.</li>
	<li>Ostrożnie zassać roztwór fibronektyny znakowany FITC z dna mikrostudzienek, trzymając szklane naczynia pod kątem 45°, a następnie napełnić naczynia ze szklanym dnem 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut w kapturze do hodowli ciemnych komórek w celu sterylizacji. Napełnij również szklane pokrywki naczyń lub wytrzyj do czysta chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków nasączonymi 70% etanolem.</li>
	<li>Umyj naczynia ze szklanym dnem, napełniając je 1x PBS na 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy z 2 ml 1x PBS, w sumie przez 15 minut.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i obrazowanie testów Invadopodia
<ol>
	<li>Dodaj 25 000 komórek rakowych w 2 ml pożywki invadopodia (1:1 DMEM i RPMI 1640 z 5% surowicą niskobiałkową, 10% płodową surowicą bydlęcą i 20 ng / ml świeżo dodanego naskórkowego czynnika wzrostu) do naczyń ze szklanym dnem i inkubuj przez noc.</li>
	<li>Odessać i potraktować mikrostudzienki 2 ml 3,7% roztworu paraformaldehydu w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut, aby utrwalić komórki.</li>
	<li>Po dwóch szybkich myciach z użyciem 2 ml 1x PBS, potraktuj mikrostudzienki 2 ml 0,1% roztworu Triton X-100 w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut, aby przepuszczalność komórek.</li>
	<li>Po jednym szybkim przemyciu 2 ml 1x PBS, potraktuj mikrostudzienki 3% roztworem blokującym albuminę surowicy bydlęcej w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut, aby zablokować komórki.</li>
	<li>Inkubować mikrostudzienki ze 150 μl mysiego przeciwciała antykortaktynowego (1:750) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.</li>
	<li>Myć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 15 minut.</li>
	<li>Inkubować mikrostudzienki ze 150 μl koziego przeciwciała anty-mysiego 633 (1:500) i 546 falloidyny (1:750) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.</li>
	<li>Myć mikrostudzienki 2 ml 1x PBS przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 15 minut.</li>
	<li>Dodaj sześć kropli podłoża montażowego, aby wypełnić każdą mikrostudzienkę i przykryj szkiełkami nakrywkowymi 22 x 22.</li>
	<li>Obrazowanie kortaktyny i aktyny w celu identyfikacji inwadopodiów przy użyciu filtrów wzbudzenia i emisji odpowiednio 632/647 nm i 556/570 nm, przy użyciu soczewki zanurzeniowej o wysokim NA, 40X zanurzeniu w oleju na odwróconym mikroskopie o szerokim polu. Podobnie obraz fibronektyny w celu identyfikacji degradacji ECM za pomocą filtra wzbudzenia i emisji 492/518 nm.</li>
</ol>
6. Przygotowanie i obrazowanie testów siły trakcyjnej
<ol>
	<li>Dodaj 15 000 komórek rakowych w 2 ml pożywki z inwadopodiami do naczyń ze szklanym dnem i inkubuj przez noc.</li>
	<li>Odessać pożywkę do naczyń ze szklanym dnem i zastąpić 2 ml pożywki L-15 tymi samymi suplementami (5% surowicy niskobiałkowej, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 20 ng/ml świeżo dodanego naskórkowego czynnika wzrostu), wstępnie podgrzanej do 37 °C.</li>
	<li>Inkubować naczynia ze szklanym dnem w komorze środowiskowej na mikroskopie odwróconym, wstępnie zrównoważonym do 37 °C przy wysokiej wilgotności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wykonaj cztery zestawy zdjęć za pomocą obiektywu o wysokiej NA, 40-krotnej ostrości na odwróconym mikroskopie o szerokim polu widzenia ze zautomatyzowanym stolikiem, aby oznaczyć pozycje komórek:
	<ol>
		<li>Obrazowanie komórek na PAA za pomocą kontrastu fazowego (obraz "fazowy").</li>
		<li>Obrazuj mikrosfery fluorescencyjne za pomocą filtrów wzbudzenia i emisji 560/645 nm, skupiając się lekko pod komórkami, aż pierwsza warstwa mikrosfer na górze PAA stanie się ostra (obraz "naprężony").</li>
		<li>Ponadto skup się na dnie PAA (używając mikrosfer jako markerów) i zrób zdjęcie (obraz "dolny"). Uwaga: Celem tego obrazu jest zarejestrowanie pozycji z w celu uzyskania rzeczywistej grubości PAA w każdym położeniu do obliczeń siły pociągowej, jak opisano w Reprezentatywne wyniki.</li>
		<li>Po uzyskaniu tych obrazów w wielu pozycjach, delikatnie wymieszaj 220 μl 10% roztworu Triton-X, aby usunąć komórki. Obrazuj mikrosfery na górze PAA w każdej pozycji, jak opisano wcześniej (obraz "zerowy").</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nature. 10, 63-73 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension+mounts%3A+mechanics+meets+morphogenesis+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mammary+gland+biology+and+neoplasia%22%5BJournal%5D)">The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy.</a> Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).</li>
<li>Parekh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+modulation+of+invadopodia+across+a+wide+range+of+rigidities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities.</a> Biophysical. 100, 573-582 (2011).</li>
<li>Jerrell, R. J., Parekh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+mediate+extracellular+matrix+degradation+by+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia.</a> Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7, e32572(2012).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2014).</li>
<li>Haage, A., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+contractility+and+extracellular+matrix+stiffness+regulate+matrix+metalloproteinase+activity+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells.</a> FASEB J. , (2014).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+specialized+cell+structures+for+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion.</a> Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia.</a> Curr Biol. 18, R362-364 (2008).</li>
<li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+breast+cancer+risk+prediction+model+for+women+undergoing+screening+mammography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+absolute+invasive+breast+cancer+risk+in+white+women+with+a+model+that+includes+mammographic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).</li>
<li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tense+situation%3A+forcing+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tense situation: forcing tumour progression.</a> Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Rosel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+Rho%2FROCK+signaling+in+sarcoma+cells+drives+invasion+and+increased+generation+of+protrusive+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces.</a> Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).</li>
<li>Indra, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys Biol. 8, 015015(2011).</li>
<li>Parekh, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+invasiveness+by+the+physical+extracellular+matrix+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+%26+migration%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment.</a> Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).</li>
<li>Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+traction+force+and+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+modeling+in+mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li>
<li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules%2C+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer K25CA143412 (Parekh). Pragniemy wyrazić wdzięczność, że dodatkowe wsparcie zostało udzielone przez Klinikę Otolaryngologii. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Przedstawiamy metodę wytwarzania PAA, która może być wykorzystana jako podstawa do testów inwadopodiów i siły trakcyjnej w celu skorelowania inwazyjnych i kurczliwych zachowań komórkowych. Podczas gdy PAA od dawna są używane do badania wpływu sztywności na komórki i obliczania sił trakcyjnych18,24,27, ten protokół jest pierwszym, w którym opracowano równoległe testy oparte na PAA o tych samych sztywnościach w celu skorelowania inwazyjnych i kurczliwych zachowań komórkowych w odpowiedzi na właściwości mechanicz...

Sztywność ECM związanego z nowotworem została zidentyfikowana jako istotny czynnik napędzający złośliwe zachowanie poprzez zwiększenie kurczliwości aktomiozyny1-3. Chociaż efekt ten wykazano przede wszystkim w przypadku komórek raka piersi, stwierdzono, że sztywność macierzy zmienia właściwości inwazyjne komórek pochodzących z różnych nowotworów4-8, co sugeruje, że sztywność guza może odgrywać rolę w innych typach nowotworów. Aby przeniknąć do usieciowanych tkanek podczas inwazyjnej migracji, komórki rakowe wykorzystują bogate w aktynę wypukłości adhezyjne, znane jako inwadopodia, które lokalizują proteinazy w celu ogniskowej degradacji ECM9. Invadopodia są uważane za cechę charakterystyczną komórek inwazyjnych i są zaangażowane w inwazję komórek nowotworowych i przerzuty10,11. Wcześniejsze prace wykazały, że sztywność matrycy może regulować liczbę inwadopodiów i związaną z nią degradację ECM4,12 poprzez aktywność miozyny II i białka mechanowrażliwe12. Biorąc pod uwagę korelację między gęstością guza a agresywnością raka13,14, wyniki te sugerują mechanizm, dzięki któremu komórki rakowe mogą reagować na sztywne tkanki nowotworowe, aby napędzać inwazję i przerzuty poprzez kurczliwość aktomiozyny.
Wykazano, że sztywność ECM in vitro i gęstość tkanek in vivo regulują inwazyjne zachowanie komórek nowotworowych1,15-17. Podczas gdy kurczliwość aktomiozyny wydaje się być ważna w tym procesie, obecne badania są sprzeczne co do tego, czy zdolność przerzutowa jest skorelowana ze zwiększonymi lub zmniejszonymi siłami skurczu6,18-20. Co więcej, nie wiadomo, czy siły te bezpośrednio pośredniczą w aktywności inwadopodiów21. Niedawno odkryliśmy, że siły kurczliwe komórek rakowych były zależne od sztywności matrycy i przewidywały degradację ECM przez inwadopodia5. Wyniki te sugerują, że siły komórkowe mogą odgrywać ważną rolę w progresji nowotworu, pośrednicząc w aktywności inwadopodiów w odpowiedzi na właściwości mechaniczne mikrośrodowiska guza.
Aby skorelować inwazyjne i kurczliwe właściwości komórek nowotworowych5, zmodyfikowaliśmy protokół tworzenia PAA o różnych sztywnościach, który wcześniej był używany do badania zależnej od sztywności aktywności inwadopodiów4,12,22. Poprzez chemiczne sieciowanie fibronektyny ludzkiego osocza w PAA, te zmodyfikowane hydrożele mogą być używane jako podstawa zarówno do testów inwadopodii, jak i siły pociągowej, aby zapewnić, że komórki doświadczyły tych samych sztywności w obu eksperymentach5. W testach inwadopodiów fibronektyna zapewnia naturalną domenę wiążącą żelatynę, która łączy nałożony ECM z PAA w celu wykrycia degradacji matrycy. W testach siły pociągowej fibronektyna zapewnia ligand do bezpośredniej adhezji komórkowej w celu wykrycia przemieszczeń mikrosfery używanych do obliczania komórkowych sił trakcyjnych. Ta metoda daje to, co nazwaliśmy miękkimi, twardymi i sztywnymi PAA, które są związane ze szklanymi naczyniami dennymi i mają moduły sprężystości E 1,023, 7,307 i 22,692 Pa5, które obejmują zakres właściwości mechanicznych zgłaszanych dla tkanek normalnych i nowotworowych23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropylottrimetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Kwas akrylowy NHS</td><td>ester Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>przygotować świeżo w dygestoriach 10 mg / ml w DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 falloidyna</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>może również stosować rodaminę</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>przygotować świeży 10% roztwór w 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly</td><td>/Mount Polysciences</td><td>18606</td><td>użyć 6 kropli do napełnienia mikrostudzienek</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>zrobić 3% dla roztworu blokującego w 1x PBS i przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>rurki do dializy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>wstępna równowaga w buforze boranowym przez 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>służy do wytwarzania podłoża dla inwadopodiów</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>służy do wytwarzania estru estru kwasu akrylowego NHS</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Życie Technologie</td><td>PHG0311</td><td>zastosowanie do produkcji podłoża z inwadopodiów</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>rozcieńczyć wodą ultraczystą do 70%</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>do produkcji podłoża inwadopodiów</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>zazwyczaj sporządza się 10 ml 1% roztworu sacharozy/1% żelatyny w PBS i przechowuje w temperaturze 4 & st.; C (podgrzej PBS, aby łatwo rozpuścić żelatynę)</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem (szkiełka nakrywkowe 35 mm)Szkiełka</td> nakrywkowe <td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>są niepowlekane</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>rozcieńczyć 1x PBS do 0,5%</td></tr> <tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 633</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>dodać 5 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 1 mg/ml; podwielokrotność objętości w zależności od zużycia, aby uniknąć nadmiernych cykli zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>służy do produkcji 10x PBS Przeciwciało</td></tr><tr><td>antykortaktynowe 4F11 myszy</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>służy do produkcji 10x PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>służy do wytwarzania 10x PBS bulionu i buforu boranowego</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>rozcieńczyć ultraczystą wodą do 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (surowica niskobiałkowa)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>użyć do produkcji podłoża inwadopodiów</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>zazwyczaj należy przygotować 10% zapasu w 1x PBS, przygotować w dygestorium i dodać kilka ml mocnego NaOH, aby łatwo rozpuścić paraformaldehyd, a następnie przywrócić do pH 7,4 za pomocą mocnego HCl)</td></tr><tr><td>PBS (sterylnego)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>stosować do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td> używać <td>do wytwarzania invadopodia</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>przygotować świeże w dygestorium 1 mg / ml w 1x PBS</td></tr><tr><td>Tetrahydrat metaboranu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>służy do wytwarzania buforu boranowego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>zwykle wytwarza 10 ml 1% roztworu sacharozy/1% żelatyny w PBS i przechowuje w temperaturze 4 & st; C (podgrzej PBS, aby łatwo rozpuścić żelatynę)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>zrobić 10% zapasu w 1x PBS i użyć bez zmian do usunięcia komórek w teście siły trakcyjnej lub rozcieńczyć 1x PBS do barwienia</td></tr></tbody></table>

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Sztywne tkanki nowotworowe są silnie zaangażowane w regulację migracji i inwazji komórek rakowych. Inwazyjna migracja przez usieciowane tkanki jest ułatwiona przez bogate w aktynę wypukłości zwane inwadopodiami, które proteolitycznie degradują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wykazano, że aktywność inwadopodii jest zależna od sztywności ECM i sił kurczliwości komórek rakowych, co sugeruje, że sygnały sztywności mogą regulować te struktury subkomórkowe poprzez kurczliwość aktomiozyny. Właściwości inwazyjne i kurczliwe komórek nowotworowych można skorelować in vitro za pomocą inwadopodiów i testów siły trakcyjnej opartych na żelach poliakrylamidowych (PAA) o różnej sztywności. Właściwości inwazyjne i kurczliwe komórek nowotworowych można skorelować in vitro za pomocą inwadopodiów i testów siły trakcyjnej opartych na żelach poliakrylamidowych (PAA) o różnej sztywności. Chociaż istnieją pewne różnice między tymi dwoma testami, przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę tworzenia PAA, które mogą być używane w obu testach i można je łatwo dostosować do specyficznych potrzeb biologicznych i technicznych użytkownika.

W teście invadopodiów invadopodia są zazwyczaj identyfikowane poprzez kolokalizację markerów, takich jak aktyna i kortaktyna, w strukturach punktowych w obrębie ciała komórki (Rysunek 1). Można zliczyć zarówno aktywnie degradujące, jak i niebiodegradujące invadopodia, które odróżnia się na podstawie tego, czy struktury te kolokalizują z czarnymi obszarami pozbawionymi sygnału fluorescencyjnego w fibronektynie znakowanej FITC (Rysunek 1). Invadopodia są zliczane ręcznie, a stopień degrada...

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie żeli poliakrylamidowych, które mogą być wykorzystywane w testach inwazji, badania podiów oraz testach siły trakcyjnej w celu zbadania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek nowotworowych. Osiąga się to poprzez uprzednią aktywację szkiełek przedmiotowych o średnicy 14 mm w szalkach z dna szklanego, aby zapewnić związanie żeli poliakrylamidowych z powierzchnią szkła. Następnie przygotowywane są roztwory poliakrylamidu dla obu testów, aby uzyskać żele o różnych sztywnościach lub właściwościach mechanicznych.Następnie przygotowuje się testy inwazji podiów z cienką warstwą fluorescencyjnie znakowanej macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wykrycia degradacji. Na koniec do testów wysiewa się komórki nowotworowe i inkubuje je przez noc, po czym następuje utrwalenie i barwienie płytek z inwaderem i podiami oraz obrazowanie żywych komórek na płytkach do pomiaru siły trakcji. Ostatecznie do obrazowania inwadera, podiów oraz degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną.Podczas gdy mikroskopia fluorescencyjna i szerokopolowa są wykorzystywane odpowiednio do obrazowania mikrosfer i komórek w celu oblic

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Żele poliakrylamide do badań inwadopodii i sił naciągu na komórkach rakowych

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Poznaj metodę tworzenia żeli poliakryloamidowych do badania inwadopodiów i siły trakcyjnej w komórkach nowotworowych. Technika ta pozwala analizować wpływ sztywności macierzy na zachowanie raka.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów