Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie kontroli oddechowej w mitochondriach, wyizolowanych z biopsji tkanki mięśni szkieletowych. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie niewielkiej ilości mięśni za pomocą przezskórnej biopsji igłowej. Drugim krokiem jest wyizolowanie mitochondriów od biopsji mięśnia poprzez homogenizację.

Następnie wyizolowane mitochondria są myte i oddzielane od frakcji niemitochondrialnych poprzez odwirowanie i przepuszczenie próbki przez gazę. Ostatnim krokiem jest umieszczenie izolowanych mitochondriów na płytce w celu przeprowadzenia analizy metrycznej respiro za pomocą testów strumienia zewnątrzkomórkowego w celu wizualizacji wskaźnika zużycia tlenu. Ostatecznie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego konika morskiego służy do badania kontroli oddychania w izolowanych mitochondriach.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że wymaga minimalnej ilości tkanki mięśniowej wynoszącej zaledwie 20 miligramów i ogranicza zmienność międzyeksperymentalną. Te cechy sprawiają, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych. Implikacje tej techniki dotyczą diagnozowania dysfunkcji mitochondriów u pacjentów.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ biopsja mięśni i izolacja mitochondriów wymagają precyzyjnych manipulacji, które najlepiej zademonstrować wizualnie, a nie tylko opisać w tekście. Aby wykonać biopsję miejscowo, należy podać 1% lidokainy, uważając, aby nie naciekać mięśnia. Następnie należy odczekać 10 minut.

Aby umożliwić wystarczające odrętwienie, należy pobrać biopsje ze środkowego obszaru mięśnia między przyczepem a początkiem, unikając obszarów podpowięziowych i mięśniówek ścięgnistych. Aby to osiągnąć, najpierw użyj igły przezskórnej i postępuj zgodnie z trzaskiem powięziowym lub oporem powięzi jako przewodnikiem. Oszacuj głębokość za pomocą igły anestezjologicznej, a następnie wyczuj ją wąskim ostrzem skalpela i wykonaj od czterech do pięciu milimetrowych nacięć przez powięź.

Przesuń igłę przez nacięcie, aż zostanie wprowadzona do mięśnia. Zbierz wiele próbek z oknem obróconym w różnych kierunkach. Zastosuj ciągłe ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 60 centymetrów sześciennych, jednocześnie przesuwając i wycofując próbki mięśni do igły przezskórnej dwa do czterech razy w różnych kierunkach.

Przerwij ssanie i wyjmij igłę. Poproś asystenta, aby mocno naciskał na miejsce nakłucia przez pięć minut. Aby ustalić hemostazę, odłącz igłę od rurki ssącej i ostrożnie usuń próbki mięśni z okienka i lufy.

Wykonaj drugie przejście, jeśli potrzebujesz więcej mięśni, powtarzając tę procedurę. Usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi z próbki mięśni za pomocą kleszczy. Następnie zważyć próbkę i natychmiast umieścić ją w probówce z lodem.

Zimne ECCO, sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub DPBS. Usuń widoczną tkankę łączną z próbki za pomocą ostrych nożyczek i pęsety. Gruntownie. Umyj próbki trzy do czterech razy lodowatym buforem DPBS.

Aby usunąć krew, należy przechowywać próbki w lodowatym DPBS i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe. W ciągu 45 minut od biopsji należy podjąć środki ostrożności, aby ostrożnie usunąć wszelkie ścięgna lub tkankę tłuszczową z próbki mięśni. Usuń niewielką część dodatkowej tkanki do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Może to być wykorzystane do innych eksperymentów, takich jak Western Blots. Natychmiast posiekaj tkankę mięśniową na drobne kawałki. Używając sterylnych nożyczek, zawiesić w 500 mikrolitrach na jeden mililitr inhibitora ACE białka sykstyńskiego, takiego jak nagary rozpuszczone w CP jeden bufor w stężeniu 0,2 miligrama na gram tkanki.

Zmielić próbkę, aż będzie wyglądała na dobrze zawieszoną. Następnie wykonaj pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem do lodu, upewniając się, że homogenizator jest dokładnie umyty. Wcześniej. Homogenizuj zmieloną tkankę potraktowaną nagarami.

Korzystanie z automatycznego homogenizatora. Przez cały czas trwania tego procesu próbkę należy przechowywać na lodzie. Homogenizować każdą próbkę tkanki cztery razy za każdym razem przez impuls trwający dwie sekundy.

Używając automatycznego homogenizatora o ustawionej prędkości 10 000 obr./min, umieść próbkę z powrotem na lodzie. Umyj sondę 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną między tkankami. Teraz przemyj homogenizowaną tkankę równą objętością buforu chapel Perry One lub CP one.

Następnie przemyj tkankę dwukrotnie większą objętością buforu CP dwa. Dodaj rurkę równoważącą, doprowadzając wodę do tej samej objętości w innej stożkowej rurce. Zbierz zawartość do probówki wirówkowej i odwiruj w temperaturze 600 GS w czterech stopniach Celsjusza lub 10 minutach wstępnie zwilż gazę, aby wszystkie cząstki mogły przejść i nie zostały złapane na szmatce.

Przepuścić supernatant przez gazę z węzłem, zbierając filtrat i odrzucając osad, usuwając w ten sposób większość frakcji niemitochondrialnych. Następnie ultraodwirować supernatant w temperaturze 10 000 GS i czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zawiesić osad w czterech mililitrach buforu CP dwa przed odwirowaniem po raz drugi w ten sam sposób po odwirowaniu.

Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić pasztet w dwóch mililitrach CP jednego buforu. W tym momencie umieścić małą porcję z tej zawiesiny w oddzielnej probówce, która ma być użyta do oceny białka. Resus, zawiesić pozostałą próbkę w CP jeden bufor i odwirować.

Tak jak poprzednio, należy pamiętać, że płytka białkowa powinna być ustawiona zgodnie ze standardami podczas wcześniejszych etapów wirowania. Na koniec ponownie zawieś ostateczną osadówkę w minimalnej ilości roztworu lub masy do testu mitochondrialnego. Wykonaj testy XF, aby zobrazować wskaźnik zużycia tlenu lub OCR w piko molach tlenu na minutę lub bezwzględnych poziomach tlenu i pH.

W wydruku danych. Dodać 10-krotne stężenie związków w jednej masie X do portów od A do D respirometru opartego na płytce, aby uzyskać końcowe stężenie wymienione w protokole tekstowym. Przygotuj wystarczającą objętość związków na wymaganą liczbę studzienek.

Skorzystaj z obliczonych wcześniej obliczeń białka, aby określić stężenia mitochondriów, które należy dodać. Określ optymalną ilość mitochondriów, miareczkując jeden mikrogram, 2,5 mikrograma i pięć mikrogramów mitochondriów na studzienkę. Z 24-dołkowej płytki, aby zminimalizować zmienność między dołkami.

Najpierw rozcieńczyć 10 x mitochondria w zimnie, jeden x masa plus substrat. Następnie dostarcz 50 mikrolitrów tej zawiesiny do każdej studzienki. Pozostawiając cztery studzienki zawierające tylko 50 mikrolitrów masy, które można wykorzystać jako odczyty tła.

Umieść wstępnie nasączoną płytkę kalibracyjną wraz z górnym wkładem z wcześniejszego wkładu do respirometru, aby przeprowadzić kalibrację przyrządu. Przygotowując się do przeprowadzenia płytki testowej, odwirować płytkę w temperaturze 2000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu.

Delikatnie dodaj 450 mikrolitrów jednej x masy, plus bursztynian i zgniłe znane każdemu. Dobrze obejrzyj mitochondria pod mikroskopem, aby zapewnić jednorodne przyleganie do dołka przed przeniesieniem płytki do analizatora XF. Sekwencyjnie. Zmierz oddychanie mitochondrialne w czasie rzeczywistym za pomocą respirometru, programując go przy użyciu ustawień respirometru podanych w przedstawionym tutaj protokole tekstowym, są typowymi profilami metrycznymi Respiro sterowanymi przez kompleks dwa przy użyciu jednego mikrograma, 2,5 mikrograma i pięciu mikrogramów mitochondriów zgodnie z oczekiwaniami.

Ogólnie rzecz biorąc, OCR zwiększa się wraz z większą ilością mitochondriów. Obliczony współczynnik kontroli oddechowej lub RCR dla tego testu wynosi 7,95, co wskazuje, że preparat mitochondrialny jest wysokiej jakości w celu porównania spójności wyników podczas profilowania różnych ilości mitochondriów analiza wariantów lub przeprowadzono Inova i obliczono sumę kwadratów. Suma kwadratów lub SS jest przedstawiona dla stanu drugiego, stanu trzeciego, stanu trzeciego, niesprzężonej antymycyny A i RCR dla stanu drugiego i stanu trzeciego pomiarów w jedną stronę.

Produkt Innova był istotny statystycznie, podobnie jak dla ANTYMYCYNY i RCR. Nie zaobserwowano istotnej różnicy dla stanu trzeciego niesprzężonego między grupami. Wyniki te wskazują, że pięć mikrogramów mitochondriów na studzienkę dawało najniższy SS w porównaniu z innymi stężeniami.

Ten wykres służy jako przewodnik wskazujący, ile białka mitochondrialnego można się spodziewać na podstawie początkowej wielkości próbki mięśni. Zgodnie z oczekiwaniami istnieje silna korelacja między ilością przetwarzanych mięśni a całkowitą zawartością białka mitochondrialnego w próbce końcowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po biopsji mięśni ważne jest, aby upewnić się, że pacjent nie przyjmuje aspiryny, ibuprofenu ani innych niesteroidowych leków dostępnych bez recepty przez następne trzy dni, aby zapewnić dobre gojenie się tkanek, które poddaliśmy biopsji. Następną rzeczą jest to, że chcemy mieć pewność, że nie będą wykonywać żadnej forsownej aktywności również przez następne półtora dnia, więc nie ma to jak zgrzytanie. To byłaby trampolina do koszykówki, ale mogą wykonywać swoje normalne czynności.

Prosimy również, aby obszar był suchy przez 24 godziny, ale za pierwszym razem, gdy się zamoczy, należy być pod prysznicem, aby wszelkie rodzaje bakterii, które mogą znajdować się na skórze, której nie oczyściliśmy, nie dostały się do nacięcia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak wykonać biopsję bocznej tkanki mięśni szkieletowych, wyizolować mitochondria i zmierzyć kontrolę oddechu.