Name: Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji mitochondriów z tkanki mięśni szkieletowych uzyskanej przez biopsję igłową oraz ocenę ich funkcji oddechowej. Technika wymaga minimalnej ilości materiału, co czyni ją przydatną w badaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Marc Liesa, Boston University School of Medicine, za pomocne dyskusje; Pani Karin Murphy, Pani Heather Gregory i Panu Johnowi Stone'owi, wszyscy z Wake Forest School of Medicine, za pomocną pomoc techniczną w opracowaniu tego protokołu.

UWAGA: Opisany protokół został zatwierdzony przez Institutional Review Board of Wake Forest School of Medicine. Świadoma zgoda została uzyskana w formie pisemnej. Wszyscy uczestnicy byli zdrowymi osobami starszymi (65-79 lat) obojga płci, z BMI w zakresie 23-35.

1. Biopsja mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Jak opisano wcześniej, 9 osób wykonuje wszystkie biopsje wczesnym rankiem po poście O/N. Poproś badanych, aby powstrzymali się od przyjmowania aspiryny, niesteroidowych leków przeciwzapalnych na receptę i dostępnych bez recepty lub innych związków, które mogą wpływać na krwawienie, płytki krwi lub siniaki na tydzień przed biopsją. Poproś uczestników, aby również powstrzymali się od jakiejkolwiek forsownej aktywności przez co najmniej 36 godzin przed biopsją. 
	UWAGA: Mięsień uzyskuje się z mięśnia obszernego bocznego za pomocą techniki przezskórnej biopsji igłowej za pomocą igły przezskórnej w znieczuleniu miejscowym z 1% lidokainą. W naszej jednostce badań klinicznych nie wystąpiły żadne powikłania medyczne ani inne zgłaszane zdarzenia niepożądane związane z zabiegiem.</li>
	<li>UWAGA: Opisana procedura biopsji jest zaadaptowana z procedury Bergstrom10.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, podawaj miejscowo 1% lidokainy, uważając, aby nie przeniknąć do mięśni. Następnie odczekaj 10 minut, aby umożliwić wystarczające odrętwienie.</li>
		<li>Wykonaj biopsje z brzucha mięśnia (środkowy obszar mięśnia między przyczepem a początkiem), unikając obszarów podpowięziowych i mięśniowatych.
		<ol>
			<li>Użyj igły przezskórnej (urządzenie wielokrotnego użytku wspomagane ssaniem z bocznym okienkiem tnącym i wewnętrznym cylindrem tnącym) i postępuj zgodnie z powięziowym "trzaskiem" lub oporem powięzi jako przewodnikiem. </li>
			<li>Oszacuj głębokość za pomocą igły anestezjologicznej, a następnie ponownie poczuj ją wąskim ostrzem skalpela i wykonaj 4-5 mm nacięcie przez powięź. Przełóż igłę przez nacięcie, aż zostanie wprowadzona do mięśnia. </li>
			<li>Zbierz wiele próbek z okienkiem obróconym w różnych kierunkach. Zastosuj ciągłe ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm3, jednocześnie przesuwając i wycofując próbki mięśni do igły przezskórnej dwa do czterech razy w różnych kierunkach. Przerwij ssanie i wyjmij igłę. 
			UWAGA: Każde przejście (włożenie i wyjęcie igły) powinno zająć mniej niż minutę.</li>
			<li>Poproś asystenta, aby mocno naciskał na miejsce nakłucia przez 5 minut, aby ustalić hemostazę. Odłącz igłę od rurki ssącej i ostrożnie usuń próbki mięśni z okienka i cylindra.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj drugie przejście, jeśli potrzebujesz więcej mięśni, powtarzając powyższą procedurę.</li>
		<li>Usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi z próbki mięśni za pomocą kleszczy, zważ próbkę i natychmiast umieść w probówce zawierającej lodowaty DPBS. 
		UWAGA: Średnia wydajność przy użyciu tej metodologii wynosi 150 ± 20 mg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondrialna
<ol>
	<li>Świeżo przygotować Chappela-Perry'ego (CP) i roztworu do oznaczania mitochondriów (MAS) (tabela 1) w dniu doświadczenia lub podwielokrotność i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Przygotować związki w dimetylosulfotlenku o stężeniu 2,5 mM i podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć buforu i podwielokrotności złożonych przechowywanych w temperaturze -20 °C w ciągu 2 miesięcy od dnia przygotowania.</li>
	<li>Usunąć widoczną tkankę łączną z próbki za pomocą ostrych nożyczek i pęsety; w razie potrzeby użyć do tego kroku mikroskopu preparacyjnego. Dokładnie umyj próbki 3-4 razy lodowatym buforem DPBS, aby usunąć krew. Próbki należy przechowywać w lodowato zimnym DPBS i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, uważając, aby nie przekroczyć 45 minut od biopsji. Podejmij środki ostrożności, aby ostrożnie usunąć wszelkie ścięgna lub tkankę tłuszczową z próbki mięśni.</li>
	<li>Natychmiast posiekać tkankę mięśniową na drobne kawałki za pomocą sterylnych nożyczek i zawiesić w 500 μl do 1 ml CPI zawierającej proteinazę (Nagarse) w stężeniu 0,2 mg/g tkanki. Następnie wykonaj 5-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś do lodu.</li>
	<li>Homogenizować tkanki mielone poddane działaniu Nagarse za pomocą automatycznego homogenizatora. Przez cały czas trwania tego procesu próbkę należy przechowywać na lodzie. Homogenizować każdą próbkę tkanki cztery razy, za każdym razem przez impuls trwający 2 sekundy, używając automatycznego homogenizatora przy ustawieniu prędkości 10 000 obr./min. Umyj sondę 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną między tkankami.</li>
	<li>Przemyć homogenizowaną tkankę równą objętością CP I (500 μl do 1 ml) i 2 x objętością CP II (1 ml do 2 ml), a następnie zebrać zawartość do probówki wirówkowej i odwirować przy 600 x g, 4 °C przez 10 min. Przepuścić supernatant przez zwilżoną gazę serową, Zebrać filtrat i wyrzucić osad, usuwając w ten sposób większość frakcji niemitochondrialnych.</li>
</ol>
3. Mycie mitochondriów
<ol>
	<li>Odwirować supernatant z powyższego etapu w temperaturze 10 000 x g, 4 °C przez 10 minut. Zawiesić osad w 4 ml buforu CP II i dalej odwirować przy 10 000 x g, 4 °C przez 10 min. 
	UWAGA: W rzadkich przypadkach poniżej osadu mitochondrialnego tworzy się cienka kulka krwi. W takim przypadku należy usunąć osad mitochondrialny przez delikatne zasysanie buforem CPII. Tego kroku można uniknąć, dokładnie zmywając krew w kroku 2.</li>
	<li>Zawiesić otrzymany osad w 2 ml buforu CP I. Na tym etapie należy użyć małej porcji z tej zawiesiny do oceny białka. Zawiesić pozostałą próbkę w buforze CP I i odwirować jak powyżej. Zawiesić ostateczną osadkę w minimalnej ilości (200 μl) roztworu do oznaczania mitochondriów (MAS). 
	UWAGA: Białko jest oznaczane na tym etapie, ponieważ bufor CP I nie ma BSA, podczas gdy MAS, w którym próbki zostaną później zawieszone, ma w sobie BSA.</li>
</ol>
4. Oszacuj zawartość mitochondriów, mierząc stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA
UWAGA: Użyj tego stężenia do obliczenia ilości mitochondriów używanych do ładowania na 24-dołkową mikropłytkę do pomiarów respirometrycznych lub do eksperymentów Western blot. Do obliczenia stężenia białka należy wziąć pod uwagę współczynnik rozcieńczenia (10).
5. Wykonaj testy XF zgodnie z opisem Rogers, GW, et al.12
UWAGA: Wizualizuj wskaźnik zużycia O2 (OCR) w pMolach O2/min, czyli bezwzględne poziomy O2 i pH w danych wyjściowych.
<ol>
	<li>Użyj 1x MAS do przygotowania związków do wstrzyknięcia. Dodać 10-krotne stężenie związków do portów A-D, aby uzyskać końcowe stężenie w następujący sposób: Port A, ADP [adenozyna 5' –difosforan, 2 mM, 50 μl]; port B, oligomycyna (2 μM, 55 μl); port C, FCCP [4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu, 6 μM, 60 μl]; i port D, 2 μM antymycyny-A (65 μl). Przygotuj wystarczającą objętość związków na wymaganą liczbę studzienek.</li>
	<li>Określ optymalną ilość mitochondriów przez miareczkowanie. Na przykład załaduj 1,0 μg, 2,5 μg i 5,0 μg mitochondriów na studzienkę w objętości 50 μl lodowatego substratu zawierającego 1x MAS. Aby zminimalizować zmienność między studzienkami, najpierw rozcieńczyć 10x mitochondria w zimnym 1x MAS + substracie. Następnie dostarczyć 50 μl tej zawiesiny do każdej studzienki (z wyjątkiem studzienek korekcyjnych tła).</li>
	<li>Odwirować płytkę przy 2 000 x g, 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu delikatnie dodać 450 μl 1x MAS + bursztynian (10 mM) i rotenon (2 μM) (warunki początkowe; patrz poniżej) do każdej studzienki. Zobacz mitochondria pod mikroskopem, aby zapewnić jednorodne przyleganie do dołka przed przeniesieniem płytki do analizatora XF. 
	UWAGA: Zastosowane warunki początkowe będą zależeć od tego, czy oddychanie jest napędzane przez ETC complex I, czy complex II. W przypadku oddychania sterowanego przez złożone II, jako warunki początkowe należy użyć bursztynianu (10 mM) i rotenonu (2 μM). Rotenon blokuje kompleks I, a bursztynian stanowi paliwo dla kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej). Do badania oddychania napędzanego przez kompleks I należy użyć pirogronianu i jabłczanu, każdy o końcowym stężeniu 5 mM lub glutaminianu i jabłczanu o końcowym stężeniu 10 mM jako warunków początkowych. Te ostatnie mogą pomóc w rozróżnieniu dysfunkcji między cyklem kwasów trikarboksylowych a transportem substratu. Aby zbadać oddychanie napędzane zarówno przez kompleks I, jak i kompleks II, należy uwzględnić pirogronian i bursztynian bez rotenonu lub jabłczanu jako warunki początkowe. Użyj palmitoilokarnityny jako substratu do β-oksydacji.</li>
	<li>Sekwencyjnie mierz oddychanie mitochondrialne w czasie rzeczywistym za pomocą respirometru, programując go zgodnie z wcześniejszym opisem 12. Użyj ustawień respirometru podanych w tabeli 2. 
	UWAGA: Krótkie wyjaśnienie różnych stanów oddychania mitochondrialnego jest następujące:</li>
	<li>Stan 2 = stan sprzężony z obecnym substratem; Stan 3 = oddychanie fosforylujące w obecności nasycającego ADP; Stan 4o = oddychanie niefosforylujące indukowane przez oligomycynę; Stan 3u = maksymalne oddychanie niesprzężone stymulowane przez FCCP rozprzęgacza; Resztkowe oddychanie niemitochondrialne = oddychanie po inhibicji kompleksu III przez antymycynę-A. Należy również zwrócić uwagę, że długość pomiaru OCR w połączeniu ze stężeniem mitochondriów może wpływać na dane poprzez wyczerpywanie się tlenu w okresach pomiaru.</li>
</ol>
6. Western Blot
UWAGA: Określ marker mitochondrialny COX IV i GAPDH całej tkanki za pomocą Western blot, aby zapewnić wzbogacenie mitochondriów w końcowej próbce
<ol>
	<li>Oddziel wyizolowane mitochondria i ekstrakt z całych tkanek za pomocą 12% żeli poliakryloamidowych z dodecylosiarczanu sodu.</li>
	<li>Przenieś białka na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem COX IV (1:20 000), a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP). W celu oznaczenia GAPDH należy usunąć blot i sondę z przeciwciałem monoklonalnym GAPDH (1:2,000). 
	UWAGA: Jeśli różnice w zanieczyszczeniu ER są niepokojące, uwzględnij w analizie markery ER, takie jak ERp72, kalneksyna lub kalretykulina.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity%3A+effects+of+EDTA+and+EGTA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392(2013).</li>
<li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li>
<li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li>
<li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

Autor, George Rogers, jest pracownikiem firmy Seahorse Bioscience, która produkuje instrument użyty w tym artykule. Opłaty za otwarty dostęp zostały wsparte przez Seahorse Biosciences.

Izolowane mitochondria są często wykorzystywane w badaniach, które badają rolę funkcji ETC, a także innych czynności mitochondrialnych, w tym transportu substratu i funkcji cyklu TCA. Testy respirometryczne z wykorzystaniem izolowanych organelli pozwalają na bezpośrednie zbadanie podstawowych procesów fosforylacji oksydacyjnej i wewnętrznych właściwości ETC. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów w porównaniu z całymi komórkami lub przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi ma zalety stosunkowo łatwej interpretacji danych i braku "interferencji" z procesami niemitochondrialnymi lub zmianami w masie/biogenezie mitochondriów. Normalizacja danych opiera się na zawartości białka mitochondrialnego, co pozwala na proste porównanie mitochondriów między próbkami. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów jest preferowanym podejściem, gdy celem badania jest określenie mechanizmów leżących u podstaw i identyfikacja konkretnych celów, takich jak składniki/kompleksy ETC lub mechanizmy transportu mitochondrialnego.
Opisano protokół biopsji mięśni i izolacji funkcjonalnych mitochondriów z małych próbek tkanek. Metoda ta daje powtarzalne wyniki między użytkownikami dzięki zastosowaniu automatycznego homogenizatora w porównaniu z ręcznymi homogenizatorami dounce. Izolację mitochondriów można przeprowadzić przy użyciu zaledwie 20 mg tkanki mięśniowej. Ilość wyizolowanych mitochondriów, którą można uzyskać z tej wielkości próbki, jest wystarczająca do przeprowadzenia respirometrii na płytkach Seahorse, pozostawiając nadwyżkę mitochondriów do innych eksperymentów i przechowywania do dalszych analiz molekularnych. Można zauważyć, że metodę tę można przełożyć na XF 96, gdzie można zastosować jeszcze mniejsze ilości mitochondriów (1-2 μg na studzienkę).
Kilka protokołów izolacji mitochondriów opiera się na homogenizatorach z odbiciem w celu początkowego rozerwania tkanki. Wadą tej metody jest praktyczny charakter początkowej homogenizacji tkanek. Siła i prędkość tłuczka w homogenizatorze może się znacznie różnić w zależności od operatora 6. Może to powodować różnice między eksperymentami, a także różnice między laboratoriami i prowadzić do trudności w porównywaniu danych między eksperymentami. Jest to szczególnie niepokojące w badaniach interwencyjnych na ludziach, gdy dane od uczestników są zbierane w oddzielnych punktach czasowych, zwykle przed i po leczeniu, a potencjalnie w wielu miejscach. Używamy zautomatyzowanego homogenizatora, aby uzyskać bardziej spójne podejście, które daje bardziej powtarzalne wyniki przy ograniczonej zmienności między osobami. Szybkość przygotowania sprawia, że podejście to nadaje się również do obsługi wielu próbek w tym samym czasie. Zazwyczaj w ciągu jednego dnia można przeprowadzić do trzech eksperymentów.
Potencjalne ograniczenia opisanej tutaj techniki wynikają z zastosowania izolowanych organelli i zastosowania formatu opartego na płytce. Na przykład Picard i wsp. wykazały, że izolowane mitochondria posiadają cechy funkcjonalne, które zasadniczo różnią się od cech nienaruszonych mitochondriów w przepuszczalnych włóknach mięśniowych. Zasugerowali, że techniki izolacji mitochondriów skutkują zmienionymi funkcjami bioenergetycznymi, takimi jak znacznie zwiększony RCR w porównaniu z przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi, którym towarzyszy większa produkcja reaktywnych form tlenu 13. W porównaniu z przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi, izolacja mitochondriów wymaga dłuższego czasu przygotowania. Ponadto utrata zawartości komórkowej zmniejsza znaczenie fizjologiczne, coś, co jest zatrzymywane w całych komórkach, a nawet we włóknach przepuszczalnych. Zastosowanie respirometrii opartej na płytce z opisaną techniką pozwala na powtórzenie próbki. Jednak mitochondria muszą przylegać do dna każdej studzienki. Ta konfiguracja różni się od ich normalnego środowiska i może wpływać na charakterystykę funkcjonalną. Ponadto należy zauważyć, że stosując ten protokół do izolacji mitochondriów, w preparacie mitochondrialnym może nadal występować zanieczyszczenie retikulum endoplazmatycznego (ER). Różnice w zanieczyszczeniu ER mogą wpływać na określenie wydajności mitochondriów i wpływać na wyniki.
Podsumowując, w badaniu przedstawiono dane, które potwierdzają, że mitochondria wyizolowane z tkanek za pomocą tej procedury są funkcjonalnie aktywne i mogą być wykorzystywane do badań/zastosowań, które wymagają wysokiej jakości izolowanych mitochondriów z minimalnej ilości próbek mięśni szkieletowych. Zaletą tej metody jest to, że: i) możliwe jest wyizolowanie mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych, ii) procedura jest szybka, iii) dzięki technologii opartej na płytkach możliwe jest badanie wielu próbek w tym samym czasie, oraz iv) po teście bioenergetycznym jest wystarczająca ilość nadwyżek tkanek i izolowanych mitochondriów do przechowywania próbki i innych badań biologii molekularnej.

Mitochondria są głównymi miejscami produkcji energii w komórce i odgrywają ważną rolę w starzeniu się, jak również w różnych zaburzeniach związanych z wiekiem, takich jak choroby układu krążenia, choroba Alzheimera, cukrzyca, rak i otyłość. Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów zapewnia bezpośrednią analizę funkcji łańcucha transportu elektronów (ETC) i znacząco przyczyniło się do naszego zrozumienia biologii mitochondriów i jej roli w zdrowiu i chorobie. Izolowane mitochondria są wykorzystywane do badania różnych aspektów bioenergetyki, takich jak transport substratu, aktywność syntazy ATP, wyciek protonów itp. Metodologia opisana w tym manuskrypcie została zoptymalizowana, aby umożliwić analizę respirometryczną mitochondriów wyizolowanych z biopsji tkanki mięśni szkieletowych uzyskanych od ludzi. Protokół biopsji opisany w tym manuskrypcji był używany przez nasz personel przez ostatnie 12 lat. Nasza grupa wykonała ponad 700 zabiegów u osób dorosłych w różnym wieku, do 90 roku życia i z różnymi chorobami przewlekłymi, bez żadnych negatywnych problemów związanych z bezpieczeństwem. Kluczowym aspektem tego protokołu jest to, że jest on specjalnie zaprojektowany do wykorzystania minimalnych ilości tkanki, ułatwiając w ten sposób jej wykorzystanie w badaniach klinicznych.
Opracowano różne protokoły izolowania mitochondriów. Fernandez-Vizarra i wsp.W artykule 1,2 opisano metodę izolowania mitochondriów z różnych tkanek szczurów, a także z hodowanych komórek. Garcia-Cazarin i wsp.3 zgłosiły metodę izolowania mitochondriów od mięśni szkieletowych od szczurów i myszy. Metoda izolowania mitochondriów od mózgu szczura została również opisana przez Iglesias-Gonzales i wsp.4 Gross i wsp.5 zgłosiło metodę izolacji mitochondriów przy użyciu barocyklera i/lub niszczarki PCT. Ostatnio Franko i wsp.6 opisało metodę izolowania wysoce wzbogaconych mitochondriów za pomocą kulek magnetycznych anty-TOM22.
Chociaż te protokoły dają doskonałe wyniki, wymagania dotyczące wielkości tkanki są wysokie w porównaniu do metody opisanej w tym manuskrypcie. Na przykład Gross i wsp.5 Zużyto 1,5-1,8 g mięśnia brzuchatego łydki i około 2 g tkanki nerkowej. Podobnie Franco i wsp.6 Użyto 500 mg tkanki wątroby myszy. Z naszego doświadczenia wynika, że typowe plony, których można się spodziewać po przezskórnej biopsji igłowej mięśni szkieletowych (Vastus lateralis) wahają się od 100-200 mg. Możliwość oceny funkcji mitochondriów w 20-50 mg tkanki mięśniowej przy użyciu opisanego tutaj protokołu pozwala użytkownikom na wykonywanie wielu ocen na biopsję i przechowywanie próbek do wykorzystania w przyszłości w innych eksperymentach biologii molekularnej. Jest to kluczowa cecha w badaniach klinicznych i innych badaniach, które wymagają starannego wykorzystania próbek. Należy zauważyć, że wcześniej zamrożone mitochondria nie nadają się do badania sprzężonego oddychania ze względu na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej i utratę aktywności cytochromu C. Nasza metoda została zaadaptowana i zmodyfikowana w stosunku do metody opublikowanej przez Chappella i Perry'ego7.
Korzystając z metod opisanych w tym manuskrypcie, niedawno informowaliśmy, że profil respirometryczny mitochondriów wyizolowanych z ludzkiego Vastus lateralis jest bezpośrednio skorelowany ze zdolnością fizyczną, mierzoną jako prędkość chodu8.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell późny wirnik&nbsp;</td>Strzykawka <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital</td><td>Needle Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc</td><td></td> 96-dołkowy czytnik płytek Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>(Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XF 24-3</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System żelu białkowego</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zespół aparatu fotograficznego Kodak</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Mikropłytka do hodowli komórkowej i wkład z czujnikiem XF24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza bakteryjna</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnez chlorek (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ sól)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Zestaw do testowania wysiłków mito komórkowych</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrany transferowe immobiliny (0,45 um)</td><td>Bufor do biegania Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE (20X)-1 litr</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe (mAB przeciwko VDAC1/Porynie)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe (mAB przeciwko GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG (koza), znakowane HRP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (koza), znakowany HRP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, kwas bursztynowy, kwas pirogronowy i kwas jabłkowy należy dostosować do pH 7,4 tylko za pomocą KOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Profilowanie respirometryczne izolowanych mitochondriów jest powszechnie używane do badania funkcji łańcucha transportu elektronów. Opisano metodę uzyskiwania próbek ludzkiego mięśnia obszernego bocznego, izolowanie mitochondriów z minimalnych ilości tkanki mięśni szkieletowych oraz profilowanie respirometryczne na płytkach przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (XF). Porównanie profili respirometrycznych uzyskanych przy użyciu mitochondriów 1,0, 2,5 i 5,0 μg wskazuje, że 1,0 μg jest wystarczające do pomiaru oddychania, a 5,0 μg zapewnia najbardziej spójne wyniki oparte na porównaniu błędów standardowych. Analiza Western blot izolowanych mitochondriów pod kątem markera mitochondrialnego COX IV i markera tkanki niemitochondrialnej GAPDH wskazuje, że zanieczyszczenie niemitochondrialne przy użyciu tego protokołu jest ograniczone. Możliwość badania respirometrii mitochondrialnej w zaledwie 20 mg tkanki mięśniowej pozwala użytkownikom na wykorzystanie indywidualnych biopsji dla wielu punktów końcowych badania w klinicznych projektach badawczych.

Rysunek 1 przedstawia szczegółowy schemat blokowy całego protokołu.
Profile Western blot COX IV/GAPDH (Rysunek 2>) przedstawiają ekspresję białka mitochondrialnego COX IV oraz markeru pozamitochondrialnego GAPDH. Ekspresja zarówno COX IV, jak i GAPDH jest widoczna w lizacie całego mięśnia. Po wyizolowaniu mitochondriów przy użyciu techniki opisanej w niniejszym protokole prążki COX IV pozostają widoczne, podczas gdy GAPDH nie występuje przy tym samym czasie ekspozycji. Dłuższe czasy ekspozycji mogą ujawnić słaby prążek GAPDH. Analizy te wskazują, że wyizolowane mitochondria charakteryzują się minimalnym zanieczyszczeniem frakcjami pozamitochondrialnymi. Ponadto ekspresja COX IV w wyizolowanych mitochondriach jest spójna pomiędzy próbkami.
Rysunek 3 przedstawia typowe profile respirometryczne napędzane przez kompleks II (bursztynian i rotenon) z zastosowaniem 1,0 μg, 2,5 μg i 5,0 μg mitochondriów. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowite OCR wzrasta wraz ze zwiększoną ilością mitochondriów. Obliczony współczynnik kontroli oddechowej (RCR) dla tego testu wynosi 7,95, co wskazuje na wysoką jakość preparatu mitochondrialnego. Co więcej, OCR w stanie 3u jest nieco wyższy niż w stanie 3, co potwierdza jakość mitochondriów.
Aby porównać spójność wyników podczas profilowania różnych ilości mitochondriów, przeprowadzono analizę wariancji (ANOVA) i obliczono sumę kwadratów (SS) jako rzeczywiste wartości wariancji, wykorzystując 1,0 µg, 2,5 µg oraz 5,0 µg mitochondriów naniesionych na dołek (Rysunek 4). Wartości SS przedstawiono dla stanu 2, stanu 3, stanu 3u, antymycyny A oraz RCR. W przypadku pomiarów dla stanu 2 i stanu 3 jednoczynnikowa analiza ANOVA była statystycznie istotna (odpowiednio p&lt;0,01 i p&lt;0,05). Podobnie jednoczynnikowa analiza ANOVA była statystycznie istotna dla antymycyny i RCR (odpowiednio p&lt;0,01 i p&lt;0,0001). Nie stwierdzono istotnych różnic dla stanu 3u pomiędzy grupami. Wyniki te wskazują, że 5,0 μg mitochondriów na dołek zapewniło najniższą wartość SS w porównaniu z innymi stężeniami i jest to optymalna ilość do zastosowania w systemie XF 24 dla naszej populacji uczestników.
Rysunek 5 służy jako pomoc w określeniu spodziewanej ilości białka mitochondrialnego na podstawie początkowej wielkości próbki mięśnia. Zgodnie z oczekiwaniami, występuje silna korelacja między ilością przetworzonego mięśnia (mg) a całkowitą zawartością białka mitochondrialnego (mg) w końcowej próbce.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">bufor Chappela-Perry'ego I (CPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiczny</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">bufor Chappela-Perry’ego II (CPII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiczny</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA wolna od kwasów tłuszczowych</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) (2X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiczny</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacharoza</td>
			<td>35 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>110 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>2,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2</td>
			<td>2,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1,0 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA wolna od kwasów tłuszczowych</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) z warunkami początkowymi dla kompleksu II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiczny</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X MAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bursztynian</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenon</td>
			<td>2 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do analizy mitochondrialnej (MAS) z warunkami początkowymi dla kompleksu I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiczny</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X MAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piwian</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas jabłkowy</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">*Wszystkie bufory należy przygotować w wodzie dejonizowanej</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Składy roztworów i buforów.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Kroki protokołu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Rozpocznij procedurę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polecenie</td>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalibrować</td>
			<td>0.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczekiwanie</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknąć</td>
			<td></td>
			<td>A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>6.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknąć</td>
			<td></td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknąć</td>
			<td></td>
			<td>C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknąć</td>
			<td></td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Koniec protokołu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Ustawienia cyklu mieszania, pomiaru i ponownego mieszania dla respirometru.
<img alt="Schemat etapów przygotowania mitochondriów; obejmuje biopsję, analizę białek oraz proces wirowania." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat całego protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Western blot dla COX IV i GAPDH w surowym lizacie i oczyszczonych mitochondriach; porównanie białek." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny Western blot dla całej tkanki mięśnia szkieletowego oraz wyizolowanych mitochondriów. Ekstrakt z całej tkanki oraz wyizolowane mitochondria poddano immunoblottingowi z użyciem przeciwciała przeciwko COX IV jako markera mitochondrialnego oraz przeciwciała przeciwko GAPDH jako kontroli niemitochondrialnej. W wyizolowanych mitochondriach nie zaobserwowano prążka GAPDH, co wskazuje na niewielkie lub brak zanieczyszczeń z źródeł niemitochondrialnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres oddychania mitochondrialnego; analiza OCR w czasie, ADP, oligomycyny, FCCP, antymycyny-A." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny profil respirometryczny mitochondriów wyizolowanych z ludzkiego mięśnia Vastus lateralis. W badaniu tym zastosowano trzy stężenia wyizolowanych mitochondriów: 5.0 μg, 2.5 μg oraz 1.0 μg. Końcowe stężenia związków po wstrzyknięciu przez porty wynosiły: 2 mM ADP (port A); 2 μM oligomycyny (port B); 6 μM FCCP (port C) oraz 2 μM antymycyny A (port D). Obliczony współczynnik RCR dla tego pomiaru wyniósł 7.95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe oddychania mitochondrialnego; podstawowe, stan 3/3u, wpływ antymycyny A, statystyczne wartości P." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Suma kwadratów. Suma kwadratów dla różnych stanów oddychania mitochondrialnego i RCR z zastosowaniem 5,0 μg, 2,5 μg i 1,0 μg mitochondriów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza korelacji między masą mięśni a ilością białka; wykres rozrzutu przedstawia regresję liniową, y=mx+c, nachylenie=0,0062." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Może ona służyć jako wskazówka do oszacowania ilości białka mitochondrialnego, jakiej można się spodziewać na podstawie początkowej masy próbki mięśnia. Analiza regresji: ilości mięśnia (mg) i całkowitej wydajności białka mitochondrialnego (mg). Zgodnie z oczekiwaniami występuje bezpośrednia dodatnia korelacja między ilością mięśnia a całkowitą ilością uzyskanego białka mitochondrialnego.

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie kontroli oddychania w mitochondriach wyizolowanych z pobranej biopsją tkanki mięśni szkieletowych. Jest to realizowane poprzez uprzednią pobraną niewielkiej ilości mięśnia za pomocą biopsji igłowej przezskórnej. Drugim krokiem jest izolacja mitochondriów z pobranego mięśnia poprzez homogenizację.Następnie wyizolowane mitochondria są płukane i oddzielane od frakcji niemitochondrialnych poprzez wirowanie i przeciskanie próbki przez zwiniętą gazę. W ostatnim kroku wyizolowane mitochondria nanosi się na płytkę w celu przeprowadzenia analizy respirometrycznej za pomocą testów przepływu zewnątrzkomórkowego, aby zwizualizować tempo zużycia tlenu. Ostatecznie analizator przepływu zewnątrzkomórkowego Seahorse służy do badania kontroli oddychania w wyizolowanych mitochondriach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że wymaga ona minimalnej ilości tkanki mięśniowej, już od 20 milligrams, oraz ogranicza zmienność międzyeksperymentalną. Cechy te sprawiają, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych. Zastosowanie tej techniki polega na diagnozowaniu dysfunkcji mitochondrialnych u pacjentów.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ biopsja mięśnia i izolacja mitochondriów wymagają precyzyjnych manipulacji, które najlepiej zademonstrować wizualnie, zamiast polegać wyłącznie na opisie tekstowym. Aby wykonać biopsję miejscowo, podaj 1% lidokainy, dbając o to, aby nie infiltrować mięśnia. Następnie odczekaj 10 minut.Aby zapewnić odpowiednie znieczulenie, pobierz biopsje z obszaru środkowego mięśnia, pomiędzy przyczepem a początkiem, unikając obszarów podpowiekowych i mięśniowo-ścięgnistych. W tym celu najpierw użyj igły przezskórnej i kieruj się odczuciem „pęknięcia” powięzi lub oporem powięzi. Oszacuj głębokość za pomocą igły do znieczulenia, następnie sprawdź ją wąskim ostrzem skalpela i wykonaj nacięcie powięzi o długości od czterech do pięciu milimetrów.Przesuń igłę przez nacięcie, aż zostanie wprowadzona do mięśnia. Pobierz kilka próbek, obracając okienkiem igły w różnych kierunkach. Stosuj ciągłe ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm³, wprowadzając i wycofując igłę przezskórną z próbek mięśnia dwa do czterech razy w różnych kierunkach.Przerwij zasysanie i wyjmij igłę. Asystent powinien uciskać miejsce nakłucia przez pięć minut. Aby uzyskać hemostazę, odłącz igłę od rurki ssącej i ostrożnie wyjmij próbki mięśni z okienka i cylindra.Jeśli wymagana jest większa ilość mięśnia, powtórz tę procedurę, wykonując drugie przejście. Usuń widoczne skrzepy krwi z próbki mięśnia za pomocą pęsety. Następnie zważ próbkę i natychmiast umieść ją w probówce z lodem.Schłodzić ECCOs w roztworze soli fosforanowej (PBS) lub DPBS. Usunąć widoczną tkankę łączną z próbki za pomocą ostrych nożyczek i pęsety. Dokładnie przemyć preparaty trzy-cztery razy lodowatym buforem DPBS.Aby usunąć krew, przechowywać próbki w lodowatym DPBS i przetworzyć je tak szybko, jak to możliwe. W ciągu 45 minut od pobrania biopsji należy zachować ostrożność i starannie usunąć wszelkie ścięgna lub tkankę tłuszczową z próbki mięśnia. Usunąć niewielką część nadmiaru tkanki w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.Metoda ta może być stosowana w innych eksperymentach, takich jak analiza Western blot. Natychmiast posiekaj tkankę mięśniową na drobne kawałki. Używając sterylnych nożyczek, zawieś je następnie w 500 µL do 1 mL inhibitora proteazy cysteinowej, takiego jak nagars rozpuszczony w buforze CP1 w stężeniu 0,2 mg/g tkanki.Rozdrobnij próbkę, aż zostanie dobrze zawieszona. Następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem na lód, upewniając się, że homogenizator został dokładnie umyty. Wcześniej zhomogenizuj rozdrobnioną tkankę potraktowaną agarami.Użycie automatycznego homogenizatora. Przez cały czas trwania tego procesu należy przechowywać próbkę w lodzie. Każdą próbkę tkanki należy homogenizować czterokrotnie, stosując impulsy trwające po dwie sekundy.Używając automatycznego homogenizatora przy ustawieniu prędkości 10 000 RPM, umieść próbkę ponownie w lodzie. Pomiędzy tkankami myj sondę 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną. Teraz przemyj zhomogenizowaną tkankę równą objętością buforu chapel Perry one lub CP one.Następnie przemyć tkankę podwójną objętością buforu CP dwa. Wypełnij probówkę do tej samej objętości wodą w innej probówce stożkowej. Przenieś zawartość do probówki do wirowania i wiruj przy 600 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Wcześniej zwilż gazę, aby umożliwić przejście wszystkich cząsteczek i zapobiec ich zatrzymaniu na materiale.Przefiltruj supernatant przez zwilżoną gazę, zbierając filtrat i odrzucając osad, aby usunąć większość frakcji pozymitochondrialnych. Następnie poddaj supernatant ultracentryfugacji przy 10 000 g w temperaturze 4°C przez 10 minut. Resuspenderuj osad w 4 mL buforu CP 2, a następnie przeprowadź ponowne wirowanie w ten sam sposób.Odlej supernatant i resuspenduj pellet w dwóch mililitrach buforu CP one. Na tym etapie przelej niewielką alykwot z tej zawiesiny do oddzielnej probówki w celu oznaczenia stężenia białka. Resuspenduj pozostałą próbkę w buforze CP one i odwiruj.Podobnie jak wcześniej, należy pamiętać, że płytka z białkiem powinna zostać przygotowana ze standardami podczas wcześniejszych etapów wirowania. Na koniec resuspender końcowy osad w minimalnej ilości roztworu do analizy mitochondrialnej lub masy. Przeprowadzić analizy XF w celu wizualizacji szybkości zużycia tlenu lub OCR w pikomolach tlenu na minutę lub bezwzględnych poziomach tlenu i pH.Do wyjściowych danych. Do portów od A do D respirometru płytkowego dodaj 10-krotne stężenie związków w masie X, aby uzyskać stężenie końcowe wymienione w protokole tekstowym. Przygotuj odpowiednią objętość związków dla wymaganej liczby studzienek.Wykorzystaj obliczenia ilości białka wykonane wcześniej, aby określić stężenia dodawanych mitochondriów. Wyznacz optymalną ilość mitochondriów, przeprowadzając miareczkowanie z użyciem 1 µg, 2,5 µg oraz 5 µg mitochondriów na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej, aby zminimalizować zmienność między studzienkami.Najpierw rozcień mitochondria 10x w zimnym, jednokrotnym podłożu z substratem. Następnie nanieś 50 µL tej zawiesiny do każdej studzienki. Pozostaw cztery studzienki zawierające jedynie 50 µL podłoża, które posłużą jako pomiary tła.Umieść wcześniej namoczoną płytkę kalibracyjną wraz z górnym wkładem z poprzedniego etapu w respirometrze w celu przeprowadzenia kalibracji urządzenia. Przygotowując płytkę testową do pomiaru, wiruj ją w wirówce z prędkością 2000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu.Ostrożnie dodaj 450 µL roztworu 1x Mass, plus succynian i rotenon do każdej studni. Przed przeniesieniem płytki do analizatora XF obejrzyj mitochondria pod mikroskopem, aby upewnić się, że przylegają one jednorodnie do dna studni. Sekwencyjnie zmierz respirację mitochondrialną w czasie rzeczywistym za pomocą respirometru, programując go zgodnie z ustawieniami respirometru podanymi w protokole tekstowym; przedstawione tutaj typowe profile respirometryczne napędzane kompleksem II przy użyciu 1 µg, 2,5 µg i 5 µg mitochondriów są zgodne z oczekiwaniami.Ogólnie OCR wzrasta wraz z większą ilością mitochondriów. Obliczony współczynnik kontroli oddychania lub RCR dla tego testu wynosi 7,95, co wskazuje na wysoką jakość preparatu mitochondrialnego. W celu porównania spójności wyników podczas profilowania różnych ilości mitochondriów przeprowadzono analizę wariancji lub Inova i obliczono sumę kwadratów. Suma kwadratów lub SS jest przedstawiona dla stanu drugiego, stanu trzeciego, stanu trzeciego po rozsprzężeniu, dla antymycyny A oraz RCR dla pomiarów stanu drugiego i stanu trzeciego metodą jednoczynnikową.Wynik dla Innova był statystycznie istotny, podobnie jak dla ANTIMYCIN i RCR. Nie stwierdzono istotnych różnic w stanie trzech rozprzęgniętych między grupami. Wyniki te wskazują, że pięć mikrogramów mitochondriów na dołek zapewniło najniższą wartość SS w porównaniu z innymi stężeniami.Wykres ten służy jako wskazówka określająca, jakiej ilości białka mitochondrialnego można się spodziewać na podstawie początkowej wielkości próbki mięśnia. Zgodnie z oczekiwaniami, występuje silna korelacja między ilością przetworzonego mięśnia a całkowitą zawartością białka mitochondrialnego w końcowej próbce. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż trzy godziny, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Po wykonaniu biopsji mięśnia należy upewnić się, że pacjent nie przyjmuje aspiryny, ibuprofenu ani innych dostępnych bez recepty leków niesteroidowych przez kolejne trzy dni, aby zapewnić prawidłowe gojenie się pobranych tkanek. Ponadto należy dopilnować, aby pacjent nie podejmował żadnej intensywnej aktywności przez następny półtora dnia, w szczególności czynności wiążących się z wstrząsami, takich jak gra w koszykówkę czy skakanie na trampolinie; codzienne, normalne czynności są jednak dozwolone.Prosimy również, aby pacjenci utrzymywali ten obszar w suchości przez 24 godziny, a pierwszy kontakt z wodą miał miejsce podczas prysznica, aby zapobiec przedostaniu się do nacięcia wszelkich rodzajów bakterii znajdujących się na skórze, których nie usunięto podczas oczyszczania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie tego, jak wykonać biopsję tkanki mięśni szkieletowych bocznych, wyizolować mitochondria oraz zmierzyć kontrolę oddychania.

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów izolowanych z tkanki mięśniowej szkieletowej uzyskanej przez igłową biopsję przezskórną

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy mobilne laboratorium do pomiaru tempa oddychania w izolowanych mitochondriach dzikich zwierząt schwytanych w terenie. W tym miejscu opisujemy projekt i wyposażenie mobilnego laboratorium mitochondrialnego oraz związane z nim protokoły laboratoryjne.

Opracowanie mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów do pomiaru energetyki mitochondriów w terenie

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę izolacji mitochondriów z tkanki mięśni szkieletowych uzyskanej przez biopsję igłową oraz ocenę ich funkcji oddechowej. Technika wymaga minimalnej ilości materiału, co czyni ją przydatną w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przeglądaj więcej filmów