Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie kontroli oddychania w mitochondriach wyizolowanych z pobranej biopsją tkanki mięśni szkieletowych. Jest to realizowane poprzez uprzednią pobraną niewielkiej ilości mięśnia za pomocą biopsji igłowej przezskórnej. Drugim krokiem jest izolacja mitochondriów z pobranego mięśnia poprzez homogenizację.

Następnie wyizolowane mitochondria są płukane i oddzielane od frakcji niemitochondrialnych poprzez wirowanie i przeciskanie próbki przez zwiniętą gazę. W ostatnim kroku wyizolowane mitochondria nanosi się na płytkę w celu przeprowadzenia analizy respirometrycznej za pomocą testów przepływu zewnątrzkomórkowego, aby zwizualizować tempo zużycia tlenu. Ostatecznie analizator przepływu zewnątrzkomórkowego Seahorse służy do badania kontroli oddychania w wyizolowanych mitochondriach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że wymaga ona minimalnej ilości tkanki mięśniowej, już od 20 milligrams, oraz ogranicza zmienność międzyeksperymentalną. Cechy te sprawiają, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych. Zastosowanie tej techniki polega na diagnozowaniu dysfunkcji mitochondrialnych u pacjentów.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ biopsja mięśnia i izolacja mitochondriów wymagają precyzyjnych manipulacji, które najlepiej zademonstrować wizualnie, zamiast polegać wyłącznie na opisie tekstowym. Aby wykonać biopsję miejscowo, podaj 1% lidokainy, dbając o to, aby nie infiltrować mięśnia. Następnie odczekaj 10 minut.

Aby zapewnić odpowiednie znieczulenie, pobierz biopsje z obszaru środkowego mięśnia, pomiędzy przyczepem a początkiem, unikając obszarów podpowiekowych i mięśniowo-ścięgnistych. W tym celu najpierw użyj igły przezskórnej i kieruj się odczuciem „pęknięcia” powięzi lub oporem powięzi. Oszacuj głębokość za pomocą igły do znieczulenia, następnie sprawdź ją wąskim ostrzem skalpela i wykonaj nacięcie powięzi o długości od czterech do pięciu milimetrów.

Przesuń igłę przez nacięcie, aż zostanie wprowadzona do mięśnia. Pobierz kilka próbek, obracając okienkiem igły w różnych kierunkach. Stosuj ciągłe ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm³, wprowadzając i wycofując igłę przezskórną z próbek mięśnia dwa do czterech razy w różnych kierunkach.

Przerwij zasysanie i wyjmij igłę. Asystent powinien uciskać miejsce nakłucia przez pięć minut. Aby uzyskać hemostazę, odłącz igłę od rurki ssącej i ostrożnie wyjmij próbki mięśni z okienka i cylindra.

Jeśli wymagana jest większa ilość mięśnia, powtórz tę procedurę, wykonując drugie przejście. Usuń widoczne skrzepy krwi z próbki mięśnia za pomocą pęsety. Następnie zważ próbkę i natychmiast umieść ją w probówce z lodem.

Schłodzić ECCOs w roztworze soli fosforanowej (PBS) lub DPBS. Usunąć widoczną tkankę łączną z próbki za pomocą ostrych nożyczek i pęsety. Dokładnie przemyć preparaty trzy-cztery razy lodowatym buforem DPBS.

Aby usunąć krew, przechowywać próbki w lodowatym DPBS i przetworzyć je tak szybko, jak to możliwe. W ciągu 45 minut od pobrania biopsji należy zachować ostrożność i starannie usunąć wszelkie ścięgna lub tkankę tłuszczową z próbki mięśnia. Usunąć niewielką część nadmiaru tkanki w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

Metoda ta może być stosowana w innych eksperymentach, takich jak analiza Western blot. Natychmiast posiekaj tkankę mięśniową na drobne kawałki. Używając sterylnych nożyczek, zawieś je następnie w 500 µL do 1 mL inhibitora proteazy cysteinowej, takiego jak nagars rozpuszczony w buforze CP1 w stężeniu 0,2 mg/g tkanki.

Rozdrobnij próbkę, aż zostanie dobrze zawieszona. Następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem na lód, upewniając się, że homogenizator został dokładnie umyty. Wcześniej zhomogenizuj rozdrobnioną tkankę potraktowaną agarami.

Użycie automatycznego homogenizatora. Przez cały czas trwania tego procesu należy przechowywać próbkę w lodzie. Każdą próbkę tkanki należy homogenizować czterokrotnie, stosując impulsy trwające po dwie sekundy.

Używając automatycznego homogenizatora przy ustawieniu prędkości 10 000 RPM, umieść próbkę ponownie w lodzie. Pomiędzy tkankami myj sondę 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną. Teraz przemyj zhomogenizowaną tkankę równą objętością buforu chapel Perry one lub CP one.

Następnie przemyć tkankę podwójną objętością buforu CP dwa. Wypełnij probówkę do tej samej objętości wodą w innej probówce stożkowej. Przenieś zawartość do probówki do wirowania i wiruj przy 600 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Wcześniej zwilż gazę, aby umożliwić przejście wszystkich cząsteczek i zapobiec ich zatrzymaniu na materiale.

Przefiltruj supernatant przez zwilżoną gazę, zbierając filtrat i odrzucając osad, aby usunąć większość frakcji pozymitochondrialnych. Następnie poddaj supernatant ultracentryfugacji przy 10 000 g w temperaturze 4°C przez 10 minut. Resuspenderuj osad w 4 mL buforu CP 2, a następnie przeprowadź ponowne wirowanie w ten sam sposób.

Odlej supernatant i resuspenduj pellet w dwóch mililitrach buforu CP one. Na tym etapie przelej niewielką alykwot z tej zawiesiny do oddzielnej probówki w celu oznaczenia stężenia białka. Resuspenduj pozostałą próbkę w buforze CP one i odwiruj.

Podobnie jak wcześniej, należy pamiętać, że płytka z białkiem powinna zostać przygotowana ze standardami podczas wcześniejszych etapów wirowania. Na koniec resuspender końcowy osad w minimalnej ilości roztworu do analizy mitochondrialnej lub masy. Przeprowadzić analizy XF w celu wizualizacji szybkości zużycia tlenu lub OCR w pikomolach tlenu na minutę lub bezwzględnych poziomach tlenu i pH.

Do wyjściowych danych. Do portów od A do D respirometru płytkowego dodaj 10-krotne stężenie związków w masie X, aby uzyskać stężenie końcowe wymienione w protokole tekstowym. Przygotuj odpowiednią objętość związków dla wymaganej liczby studzienek.

Wykorzystaj obliczenia ilości białka wykonane wcześniej, aby określić stężenia dodawanych mitochondriów. Wyznacz optymalną ilość mitochondriów, przeprowadzając miareczkowanie z użyciem 1 µg, 2,5 µg oraz 5 µg mitochondriów na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej, aby zminimalizować zmienność między studzienkami.

Najpierw rozcień mitochondria 10x w zimnym, jednokrotnym podłożu z substratem. Następnie nanieś 50 µL tej zawiesiny do każdej studzienki. Pozostaw cztery studzienki zawierające jedynie 50 µL podłoża, które posłużą jako pomiary tła.

Umieść wcześniej namoczoną płytkę kalibracyjną wraz z górnym wkładem z poprzedniego etapu w respirometrze w celu przeprowadzenia kalibracji urządzenia. Przygotowując płytkę testową do pomiaru, wiruj ją w wirówce z prędkością 2000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu.

Ostrożnie dodaj 450 µL roztworu 1x Mass, plus succynian i rotenon do każdej studni. Przed przeniesieniem płytki do analizatora XF obejrzyj mitochondria pod mikroskopem, aby upewnić się, że przylegają one jednorodnie do dna studni. Sekwencyjnie zmierz respirację mitochondrialną w czasie rzeczywistym za pomocą respirometru, programując go zgodnie z ustawieniami respirometru podanymi w protokole tekstowym; przedstawione tutaj typowe profile respirometryczne napędzane kompleksem II przy użyciu 1 µg, 2,5 µg i 5 µg mitochondriów są zgodne z oczekiwaniami.

Ogólnie OCR wzrasta wraz z większą ilością mitochondriów. Obliczony współczynnik kontroli oddychania lub RCR dla tego testu wynosi 7,95, co wskazuje na wysoką jakość preparatu mitochondrialnego. W celu porównania spójności wyników podczas profilowania różnych ilości mitochondriów przeprowadzono analizę wariancji lub Inova i obliczono sumę kwadratów. Suma kwadratów lub SS jest przedstawiona dla stanu drugiego, stanu trzeciego, stanu trzeciego po rozsprzężeniu, dla antymycyny A oraz RCR dla pomiarów stanu drugiego i stanu trzeciego metodą jednoczynnikową.

Wynik dla Innova był statystycznie istotny, podobnie jak dla ANTIMYCIN i RCR. Nie stwierdzono istotnych różnic w stanie trzech rozprzęgniętych między grupami. Wyniki te wskazują, że pięć mikrogramów mitochondriów na dołek zapewniło najniższą wartość SS w porównaniu z innymi stężeniami.

Wykres ten służy jako wskazówka określająca, jakiej ilości białka mitochondrialnego można się spodziewać na podstawie początkowej wielkości próbki mięśnia. Zgodnie z oczekiwaniami, występuje silna korelacja między ilością przetworzonego mięśnia a całkowitą zawartością białka mitochondrialnego w końcowej próbce. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż trzy godziny, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.

Po wykonaniu biopsji mięśnia należy upewnić się, że pacjent nie przyjmuje aspiryny, ibuprofenu ani innych dostępnych bez recepty leków niesteroidowych przez kolejne trzy dni, aby zapewnić prawidłowe gojenie się pobranych tkanek. Ponadto należy dopilnować, aby pacjent nie podejmował żadnej intensywnej aktywności przez następny półtora dnia, w szczególności czynności wiążących się z wstrząsami, takich jak gra w koszykówkę czy skakanie na trampolinie; codzienne, normalne czynności są jednak dozwolone.

Prosimy również, aby pacjenci utrzymywali ten obszar w suchości przez 24 godziny, a pierwszy kontakt z wodą miał miejsce podczas prysznica, aby zapobiec przedostaniu się do nacięcia wszelkich rodzajów bakterii znajdujących się na skórze, których nie usunięto podczas oczyszczania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie tego, jak wykonać biopsję tkanki mięśni szkieletowych bocznych, wyizolować mitochondria oraz zmierzyć kontrolę oddychania.