Name: Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj technikę kultur organotypowych do badania neurogenezy w zakręcie zębatym hipokampa. Metoda umożliwia manipulację neurogenezą in vitro oraz testowanie związków farmakologicznych w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant badawczy MOP 119271 dla JMW przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem. Autorzy pragną podziękować Pani Yao Fang Tan za jej wyjątkową pomoc techniczną.

UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące zdrowia i dobrostanu zwierząt były zgodne z wytycznymi Wydziału Medycyny Porównawczej Uniwersytetu w Toronto.
1. Przygotowanie plastrów hipokampa
<ol>
	<li>Sterylizuj następujące narzędzia za pomocą suchego autoklawu w temperaturze 125 °C: Rękojeść skalpela (#3) (2), Kleszcze standardowe, duże (1), Nożyczki do małych dyparowatych (pod kątem na bok) (1), Mikro łyżka (końcówki łyżki i płaskiej szpatułki) (1), Mikroszpatułki (zaokrąglone i zaokrąglone stożkowe końce) (2), Drobny pędzel (1), Pipeta Pasteura polerowana ogniowo (2), Kwadraty z gazy, 2 x 2 cale (5).</li>
	<li>Po sterylnym przelaniu narzędzi do sterylnego pojemnika i trzymaniu pod przykryciem do momentu użycia. Bezpośrednio przed sekcją zanurz narzędzia w 70% roztworze etanolu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury preparacji należy przygotować 6-dołkową płytkę hodowlaną z wkładką hodowlaną, dodając 1 ml pożywki/dołka i przechowując płytkę w inkubatorze w temperaturze 35 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Ułóż narzędzia do preparacji w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym
<ol>
	<li>Spryskaj okap z przepływem laminarnym 70% etanolem i usuń wysterylizowane narzędzia preparacyjne z alkoholu. Pozostaw narzędzia do wyschnięcia, spoczywając na sterylnej szalce Petriego, aby uniknąć kontaktu alkoholu z wypreparowaną tkanką mózgową.</li>
	<li>Umieść 5-7 ml wysterylizowanego, lodowatego roztworu preparacyjnego na 2 dużych sterylnych szalkach Petriego. Jedno naczynie schłodzi i oczyści głowę (brudną), drugie do schładzania i płukania wydrążonego mózgu (czystego). Umieść wysterylizowaną bibułę filtracyjną w jednej z pokrywek szalki Petriego, aby wypreparować mózg.</li>
	<li>Umieść małą, wysterylizowaną bibułę filtracyjną w jednej z małych pokrywek szalki Petriego, aby wyciąć hipokamp. Umieść 3-5 ml wysterylizowanego, lodowatego roztworu preparacyjnego na 2 małych, sterylnych szalkach Petriego. Jedno naczynie będzie trzymało zgarnięty hipokamp, drugie będzie trzymało sekcje podczas oddzielania odcinków hipokampa pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przygotuj rozdrabniacz do tkanek, przyklejając kawałek wysterylizowanej bibuły filtracyjnej do etapu cięcia i montując sterylną żyletkę. Zwilż bibułę filtracyjną wysterylizowanym roztworem preparacyjnym.</li>
	<li>Spryskaj czystą bio-torbę alkoholem i umieść ją w czystej ławce z przepływem laminarnym.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie hipokampa
<ol>
	<li>Spryskaj szczeniaka szczura P7 Sprague Dawley 70% etanolem na zewnątrz ławki z czystym przepływem laminarnym i szybko odetnij zwierzę za pomocą dużych sterylnych nożyczek chirurgicznych wewnątrz ławki z przepływem laminarnym. Niech głowa wpadnie do lodowatego roztworu preparacyjnego na jednej z szalek Petriego.</li>
	<li>Na szalce Petriego spłucz krew i szybko przenieś głowę na wysterylizowaną bibułę filtracyjną brzuszną stroną do dołu.</li>
	<li>Za pomocą skalpela przetnij wzdłuż powierzchni grzbietowej w płaszczyźnie strzałkowej, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę. Przeciąć skórę, ale nie kość znajdującą się pod spodem, która jest miękka i łatwo przenikalna u szczurów w tym wieku. Odłóż ten "brudny" skalpel na bok i nie używaj go na tkankę mózgową.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek do dysekcji (pod kątem na bok) i kleszczy rozetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego czaszki do bregmy, anatomicznego punktu na czaszce, w którym szew koronalny jest przecięty prostopadle przez szew strzałkowy. Użyj kleszczy, aby podciągnąć płaty czaszki do góry i odsunąć je od linii środkowej czaszki.</li>
	<li>Umieść mikro łyżeczkę na spodzie mózgu, pod pniem mózgu, aby delikatnie wyjąć mózg z czaszki. Podnieś mózg, aby odsłonić nerwy wzrokowe i opuszkę węchową na podstawowej powierzchni mózgu. Przetnij te struktury małymi nożyczkami, aby całkowicie odłączyć mózg od czaszki. Usuń i przenieś nienaruszony mózg na drugą dużą szalkę Petriego zawierającą lodowaty roztwór preparacyjny.</li>
	<li>Za pomocą mikro łyżeczki przenieś mózg do małej pokrywki na szalkę Petriego zawierającej sterylną bibułę filtracyjną. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura przepłucz mózg kilkoma kroplami roztworu preparacyjnego, aby utrzymać wilgotność tkanki.</li>
	<li>Za pomocą "czystego" ostrza skalpela odetnij dwie półkule. Przenieś lewą półkulę z powrotem na dużą szalkę Petriego za pomocą mikro łyżki i umieść półkulę pia do dołu w lodowatym roztworze preparacyjnym do późniejszego użycia.</li>
	<li>Zobacz przyśrodkową powierzchnię prawej półkuli i zidentyfikuj krawędź fornix, wyraźny pas istoty białej wzdłuż przyśrodkowej krawędzi hipokampa. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj strzałkowe nacięcie przez sklepienie, ale uważaj, ponieważ tylko 0,5 cm końcówki skalpela wystarczy do przecięcia sklepienia.</li>
	<li>Za pomocą 2 mikroszpatułek usuń pierwszy hipokamp z prawej półkuli, umieszczając prawą szpatułkę na pniu mózgu i unosząc leżącą nad nią korę za pomocą szpatułki po lewej stronie. Delikatnie unieś korę, aby odsłonić boczną komorę i przyśrodkową powierzchnię hipokampa. Biała zakrzywiona linia, fimbria, powinna być teraz widoczna.</li>
	<li>Dopasuj krzywiznę szpatułki do krzywizny fimbrii i delikatnie wciśnij szpatułkę pod fimbrię. Przesuń szpatułkę w lewo i jedź wzdłuż osi rostralno-ogonowej, a następnie podnieś szpatułkę w kierunku grzbietowym, aby usunąć hipokamp.</li>
	<li>Przenieś hipokamp na drugą małą szalkę Petriego z lodowatym roztworem preparacyjnym. Powtórz tę samą procedurę na lewej półkuli, aby usunąć lewy hipokamp.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki ostrożnie przenieś hipokamp do etapu rozdrabniania tkanek. Ułóż je obok siebie i równolegle do siebie oraz prostopadle do osi ostrza rozdrabniacza. Użyj pędzla, aby ustawić tkankę i dodaj kilka kropli roztworu preparacyjnego na wierzch hipokampa.</li>
	<li>Pokrój tkankę na plastry o wielkości 400 μm bez przerwy na usunięcie pojedynczych plasterków (zwykle nie przylegają one do ostrza). Po przecięciu całego hipokampa użyj pędzla, aby delikatnie przenieść skrawki na 2małą szalkę Petriego z roztworem preparacyjnym.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie oddziel pływające plastry za pomocą mikroszpatułki i pędzla.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora przygotowaną płytkę hodowlaną z wkładką hodowlaną i umieścić w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura wciągnij 4-5 plasterków do pipety i przenieś plastry na wierzchołkową powierzchnię membrany wkładu hodowlanego. Następnie dostosuj ustawienie pędzlem i pozostaw odstęp między poszczególnymi sekcjami a obramowaniem wkładu kulturowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety Pasteura usuń nadmiar roztworu preparacyjnego z wierzchołkowej powierzchni membrany. 
	UWAGA: Podczas wyjmowania roztworu należy unikać wciągania skrawków tkanek do pipety. Alternatywnie użyj zwykłej pipety (P200 lub P1000) ze wysterylizowanymi końcówkami pipet, aby powoli usunąć roztwór.</li>
	<li>Umieścić płytkę hodowlaną z pożywką zawierającą surowicę i plastry hipokampa z powrotem w inkubatorze w temperaturze 35 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Jeśli eksperyment wymaga wytworzenia kultur z wielu zwierząt, dokładnie wyczyść czystą ławkę z przepływem laminarnym między sekcjami. Włożyć narzędzia z powrotem do roztworu alkoholu i wymienić wszystkie szalki Petriego, bibuły filtracyjne i sterylne żyletki przed drugim rozbiorem.</li>
</ol>
4. Karmienie i pielęgnacja plastrów organotypowych
<ol>
	<li>Podawaj kultury w sterylnej, czystej ławce z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Pierwsze karmienie skrawków kultury należy wykonać 2 dni po sekcji. Odessać starą pożywkę hodowlaną za pomocą wysterylizowanej szklanej pipety.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać do studzienek 1 ml świeżej, sterylnej pożywki zawierającej surowicę.</li>
	<li>Delikatnie wymień wkładkę hodowlaną i uważaj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać pod powierzchnią membrany.</li>
	<li>Po pierwszym karmieniu zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
</ol>
5. Inkubacja wycinków tkanek z analogami tymidyny do oznaczania nowo narodzonych neuronów
<ol>
	<li>W celu zbadania dojrzewania i integracji komórek ziarnistości zębatkowej w hipokampie, należy inkubować wycinki organotypowe z analogiem tymidyny, takim jak bromodeoksyurydyna (BrdU) lub chlorodeoksyurydyna (CldU). Tutaj używamy CldU ze względu na jego wyższą rozpuszczalność w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Po 3DIV dodać 1 μl 10 mg/ml roztworu podstawowego CldU w soli fizjologicznej do 1 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml. Jeśli stosuje się BrdU, należy skorygować stężenie o różnice w masie cząsteczkowej. Dodać pożywkę z CldU do studzienek hodowlanych i inkubować tkankę z pożywką zawierającą CldU przez 2 godziny w temperaturze 35 °C.</li>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 35 °C usunąć pożywkę zawierającą CldU i zastąpić ją zwykłą pożywką, aby wznowić normalny harmonogram karmienia (opisany powyżej).</li>
</ol>
6. Utrwalanie i przechowywanie tkanek
<ol>
	<li>Ustal harmonogram stosowania zabiegów i mocowania próbek tkanek przed rozpoczęciem eksperymentów z kulturami (ryc. 2B).</li>
	<li>W ustalonym z góry dniu po rozbiorze należy przygotować następujące składniki pod wyciągiem laboratoryjnym: zlewkę o pojemności 10-50 ml zawierającą 4% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pustą zlewkę na wyrzuconą pożywkę hodowlaną, małe kleszcze oraz pipetę o pojemności 1 000 ml z jednorazowymi końcówkami.</li>
	<li>Wyjąć płytkę (płytki) hodowlane z komory inkubacyjnej i przenieść do dygestoriów. Przechylić poszczególne wkładki płytki studzienkowej za pomocą kleszczy. Następnie za pomocą pipety usuń pożywkę hodowlaną i przenieś do zlewki do utylizacji. Przechyl płytkę hodowlaną pod kątem, aby upewnić się, że cała pożywka hodowlana została usunięta.</li>
	<li>Zakończ usuwanie pożywki dla jednej płytki hodowlanej na raz. Po usunięciu pożywki dodać 1 ml 4% PFA do każdej studzienki hodowlanej i uszczelnić płytkę dołka parafilmem. Powtórzyć dla tylu płytek hodowlanych, ile to konieczne i przenieść płytki do lodówki w temperaturze 4 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach przygotuj następujące składniki w dygestorium: 10-50 ml zlewki zawierającej 0,1% azydku sodu w PBS, pustą zlewkę na wyrzucony PFA (przestrzegaj środków ostrożności podczas wyrzucania substancji toksycznych), małe kleszcze i pipetę o pojemności 1 000 ml z jednorazowymi końcówkami.</li>
	<li>Postępować zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 6.4 dla dodawania PFA, ale zamiast tego dodać 1 ml PBS z azydkiem sodu. Po całkowitym przeniesieniu należy uszczelnić płytki dołkowe do wykorzystania w przyszłości, owijając brzegi w folię parafilmową i przechowując w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Cięcie tkanki do immunohistochemii
<ol>
	<li>Wykonaj sekcję tkanek za pomocą wibratomu. Poniższa seria kroków pomaga zmaksymalizować wydajność użytecznych skrawków tkanek z kultur organotypowych. 
	UWAGA: Bezpośrednio po rozwarstwieniu hipokampa i posieciu plastrów tkanka ma grubość około 400 μm. Jednak po 2-3 tygodniach w komorze inkubacyjnej plastry tkanki zaczną się spłaszczać, co spowoduje końcową grubość przekroju 150-300 μm.</li>
	<li>Przygotuj następujące elementy do sekcji hodowanej tkanki: ostrze skalpela i rękojeść #11, szklaną szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS, kleszcze do mikropreparacji i czysty etap cięcia wibratomem w celu zamontowania tkanki.</li>
	<li>Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć wzdłuż obwodu okrągłej membrany wkładki, tak aby można ją było odłączyć od plastikowej obudowy wkładki. Pozostaw dużo miejsca między plastrem kultury kulturowej a skalpelem.</li>
	<li>Przenieść odłączoną membranę wkładkową na płytkę Petriego zawierającą PBS. Po spłukaniu w PBS za pomocą kleszczy przenieś membranę do etapu montażu wibratomu.</li>
	<li>Następnie użyj skalpela, aby usunąć nadmiar błony otaczającej plastry kultury i odetnij nadmiar materiału, aby uzyskać czyste krawędzie. Ten krok zapewni, że membrana będzie płaska i będzie mogła łatwo przylegać do powierzchni cięcia.</li>
	<li>Umieść 1-2 krople kleju na etapie cięcia wibratomu i rozprowadź równomierną warstwą za pomocą igły 22 G. Rozprowadź klej w kształcie prostokąta z długą krawędzią równoległą do ostrza tnącego wibratomu. Wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec wyschnięciu kleju.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś przyciętą błonę zawierającą plastry hipokampa do etapu cięcia i delikatnie ułóż membranę na kleju i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Gdy klej superglue wyschnie, przenieś stopień wibratomu z przyklejoną membraną z powrotem do PBS zawierającego szalkę Petriego. Przygotuj ostrze wibratomu i 48-dołkową płytkę zawierającą azydek sodu do przechowywania skrawków tkanki.</li>
	<li>Za pomocą wibratomu wygeneruj 30 μm skrawków organotypowej tkanki wycinka i przenieś do 48-dołkowej płytki zawierającej azydek sodu w celu przechowywania, a następnie barwienia immunohistochemicznego.</li>
	<li>Zapoznaj się z istniejącymi wcześniej protokołami barwienia immunohistochemicznego26,29.</li>
</ol>

<ol><li>Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+modifications+associated+with+synaptic+development+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures.</a> Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+synaptic+development+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures.</a> Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).</li>
<li>Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+glial+fibrillary+acidic+protein-immunoreactive+glial+cells+in+organotypic+slice+cultures+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus.</a> Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).</li>
<li>Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-glucose+deprivation+promotes+gliogenesis+and+microglia+activation+in+organotypic+hippocampal+slice+culture%3A+involvement+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).</li>
<li>Subramanian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Lhx2+is+necessary+and+sufficient+to+suppress+astrogliogenesis+and+promote+neurogenesis+in+the+developing+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).</li>
<li>Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+treatment+with+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+inhibitor+SB239063+is+neuroprotective%2C+decreases+the+number+of+activated+microglia+and+facilitates+neurogenesis+in+oxygen-glucose-deprived+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+Of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures.</a> European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).</li>
<li>Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kainic+acid+induces+rapid+cell+death+followed+by+transiently+reduced+cell+proliferation+in+the+immature+granule+cell+layer+of+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).</li>
<li>Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+glucose+deprivation+in+an+organotypic+hippocampal+slice+model+of+the+developing+rat+brain%3A+the+effects+on+N-methyl-D-aspartate+subunit+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition.</a> Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage%2C+neuroprotection+and+neurorepair.+Current+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+And+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets.</a> CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).</li>
<li>Berdichevsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-Akt+signaling+activates+mTOR-mediated+epileptogenesis+in+organotypic+hippocampal+culture+model+of+post-traumatic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).</li>
<li>Koyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+excitation+after+febrile+seizures+induces+ectopic+granule+cells+and+adult+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).</li>
<li>Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+spikes%3A+harbingers+or+causes+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy.</a> Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).</li>
<li>Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+mediates+the+network+activity-dependent+facilitation+of+axonal+outgrowth+from+the+newborn+granule+cells+in+the+early+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+Of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus.</a> The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).</li>
<li>Raineteau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+labeling+of+newborn+granule+cells+to+visualize+their+integration+into+established+circuits+in+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).</li>
<li>Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in hippocampal slice cultures.</a> Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).</li>
<li>Kamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+spontaneous+neurogenesis+in+the+postnatal+slice+culture+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+Of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus.</a> The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).</li>
<li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain%3A+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacology+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li>
<li>Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+hippocampal+slices+as+in+vitro+models+for+neurodegeneration%3A+Studies+on+cell+viability+and+apoptotic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes.</a> Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).</li>
<li>Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+granule+layer+cell+count%2C+cell+density%2C+and+single-pulse+BrdU+incorporation+in+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures+with+respect+to+culture+medium%2C+septotemporal+position%2C+and+time+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro.</a> The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).</li>
<li>Mielke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal%2C+synaptic%2C+and+nuclear+protein+changes+associated+with+rat+interface+organotypic+hippocampal+slice+culture+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development.</a> Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).</li>
<li>Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+pre-+and+postsynaptic+distribution+of+AMPA+receptors+at+synapses+in+CA3+stratum+radiatum+of+hippocampal+slice+cultures+compared+with+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).</li>
<li>Laplagne, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+convergence+of+neurons+generated+in+the+developing+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus.</a> PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).</li>
<li>McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats.</a> Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).</li>
<li>Stone, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+convergence+of+developmentally+and+adult-generated+granule+cells+in+dentate+gyrus+circuits+supporting+hippocampus-dependent+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory.</a> Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).</li>
<li>Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogenous+properties+of+dentate+granule+neurons+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat.</a> Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li>
<li>Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+Methods%2C+Vol.+1%3A+Practical+Methods+for+Biological+Morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Allgemeine+Mikrobiologie%22%5BJournal%5D)">Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry.</a> Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).</li>
<li>Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-induced+injury+of+mouse+organotypic+hippocampal+slice+cultures+triggers+delayed+neuroblast+proliferation+in+the+dentate+gyrus%3A+an+in+vitro+model+for+the+study+of+neural+precursor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation.</a> Brain Research. 1359, 22-32 (2010).</li>
<li>Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+postnatal+injections+of+bromodeoxyuridine+produce+age-dependent+morphological+and+behavioral+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).</li>
<li>Morris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+toxicology+of+5-bromodeoxyuridine+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells.</a> Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).</li>
<li>Bannigan, J., Langman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+effect+of+5-bromodeoxyuridine+on+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Embryology+And+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).</li>
<li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+that+glitters+isn%27t+gold%3A+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li>
<li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+bromodeoxyuridine+and+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation%2C+position%2C+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).</li>
<li>Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+in+hippocampal+slice+cultures%3A+early+in+vitro+labeling+of+neural+precursor+cells+leads+to+efficient+neuronal+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production.</a> Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Po podaniu CldU (lub BrdU) można wybrać harmonogram stosowania środków farmakologicznych tak, aby był ukierunkowany na noworodkowe DGC w określonych oknach rozwojowych. Na przykład, hipotetyczny środek może być stosowany w drugim tygodniu po wstrzyknięciu CldU, co sugeruje się, aby zbiegło się z wiekiem niedojrzałych neuronów, które są na etapie rozwoju, w którym GABA ulega depolaryzacji. Przyszłe badania z wykorzystaniem tego protokołu mogą dostosować środek farmakologiczny i okno ekspozycji, aby "dostosować" podejście ...

Neurogeneza dorosłego osobnika w hipokampie ssaków stanowi niezwykły przykład wrodzonej zdolności mózgu do adaptacji i plastyczności. Komórki ziarniste zębatki (DGC) są generowane z odnawialnej puli nerwowych komórek progenitorowych w zakręcie zębatym hipokampa, który jest jednym z dwóch obecnie dobrze scharakteryzowanych regionów neurogennych w mózgu ssaków i uważa się, że jest szczególnie ważny dla uczenia się i pamięci. Hipokamp jest częścią układu limbicznego i znajduje się głęboko w mózgu ssaków, co czyni go trudnym celem dla precyzyjnej manipulacji farmakologicznej. Ponadto nieprawidłowa neurogeneza została zaangażowana w takie stany, jak padaczka, schizofrenia i choroba Alzheimera, co wzbudziło zainteresowanie zrozumieniem wpływu różnych czynników farmakologicznych podczas dojrzewania i przeżycia nowo narodzonych neuronów. Rozróżnienie między neurogenezą postnatalną a neurogenezą wieku dorosłego jest nieostre, a wcześniejsze badania wykazały, że wiele cech rozwoju neuronów in vivo we wczesnym okresie poporodowym i dorosłym jest podobnych. W tym miejscu kładziemy nacisk na neurogenezę postnatalną i sugerujemy możliwe zastosowania do neurogenezy dorosłych.
Organotypowe kultury plastrów dostarczają efektywną metodę in vitro do badania różnych fizjologicznych właściwości hipokampa ssaków. Wartość kultur warstwowych przygotowanych z mózgów gryzoni można podsumować trzema głównymi cechami: 1) protokół jest prosty i wymaga łatwo dostępnych materiałów; 2) Hodowle warstwowe pozwalają na badania farmakologiczne, które eliminują złożone zmienne, takie jak głęboka anatomiczna lokalizacja hipokampa i omija barierę krew-mózg1; oraz 3) zachowana jest dobrze scharakteryzowana struktura hipokampa i obwodu trisynaptycznego2. Poprzedni badacze wykorzystali organotypową hodowlę hipokampa do badania rozwoju i fizjologii synaps3,4, glejogenezy5-7, niedokrwiennego uszkodzenia mózgu8,9, neuroprotekcji i neuronaprawy10-12, a także epilepsji13-15. Hodowle warstwowe mogą również stanowić użyteczny system modelowy pozwalający na monitorowanie rozwoju komórek w połączeniu ze znakowaniem komórek za pomocą białka zielonej fluorescencji (GFP) lub innych ważnych markerów.
Kultury Slice były również wcześniej wykorzystywane do badania pourodzeniowej neurogenezy hipokampa16-19, ale jednym z ważnych czynników w większości tych badań jest dobrze scharakteryzowane zwyrodnienie, które wynika z eksplantacji tkanek od dorosłych zwierząt po około 2 tygodniach in vitro20,21. Z tego powodu kultury plastrów są zwykle przygotowywane z wczesnych postnatalnych (P5-P10) myszy lub szczeniąt szczurów, co wykorzystuje zwiększoną żywotność wczesnej postnatalnej tkanki mózgowej do hodowli22. Podczas gdy wcześniejsze badania wykazały, że wczesny hipokamp po urodzeniu i dorosły różnią się pod względem fizjologii synaps i ekspresji określonych podtypów neuronów23,24, istnieje znaczne zachowanie choreograficznego programu rozwojowego, przez który przechodzą nowonarodzone komórki ziarniste zęba podczas dojrzewania25. Ponadto ostatnie badania sugerują, że fizjologiczne cechy nowonarodzonych DGC w hodowli są bardzo podobne do niedojrzałych neuronów w ostrym preparacie plastrów hipokampa16.

<table><tbody><tr><td>5-chloro-2'-deoksyurydyna (CldU)</td><td>MP Biomedicals</td><td>105478</td><td>Niebezpieczne, rakotwórcze</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych, średnica 30 mm, 0,4 i mikro; m wielkość porów</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>140660</td><td>Powłoka Nuclon delta na tych wkładkach zapewnia lepszą przyczepność tkanek i poprawia jakość plastrów.</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe (sterylne)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do dyssektorowania (ustawione pod kątem na bok)</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych&nbsp;</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna pożywka niezbędna (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095; płyn</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Eclipse Ni-U mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej do tkanek</td><td>Krazy Glue</td><td>KG585</td><td>Użyj minimalnej ilości kleju, aby uzyskać przyczepność, ponieważ każda tkanka wystawiona na działanie kleju będzie bezużyteczna dla IHC.</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Surowica konia inaktywowana termicznie (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Przygotuj 50 ml porcji i przechowuj w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>TW 31KYPBX</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane szklane pipety (spód pipety Pasteura usunięty i krawędź wygładzona płomieniem Bunsena)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 mm x 15 mm) i (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Brand</td><td>FB0875712 i FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>Grzywna Narzędzia naukowe</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Sorfa Medical Plastic Co.</td><td>P8050</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr próżniowy</td><td>Thermo-Scientific</td><td>565-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca napędzana strzykawką</td><td>Millipore-Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek z ruchomym stolikiem</td><td>Stoelting& nbsp;</td><td>51425</td><td></td></tr><tr>Pędzel <td></td><td></td><td></td><td>z cienką końcówką</td></tr></tbody></table>

organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy hipokampa po urodzeniu mózgu gryzoni za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta zachowuje charakterystyczną morfologię topograficzną hipokampa, umożliwiając jednocześnie bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do rozwijającego się zakrętu zębatego hipokampa. Dodatkowo, kultury plastrów mogą być utrzymywane do 4 tygodni, co pozwala na badanie procesu dojrzewania nowonarodzonych neuronów ziarnistych. Hodowle Slice pozwalają na skuteczną manipulację farmakologiczną wycinkami hipokampa, wykluczając jednocześnie złożone zmienne, takie jak niepewności związane z głęboką lokalizacją anatomiczną hipokampa, a także barierą krew-mózg. Z tych powodów staraliśmy się zoptymalizować organotypowe kultury warstwowe specjalnie do badań nad neurogenezą po urodzeniu.

Określenie, czy hodowle organotypowe będą odpowiednie do badań nad neurogenezą u osobników dorosłych, wymagało spełnienia dwóch głównych kryteriów: 1) aby skrawki zachowały charakterystyczne cechy morfologiczne skrawków hipokampa po 10–21 dniach in vitro (DIV) oraz 2) aby nowo powstałe komórki ziarniste zakrętu zębatego (DGCs) mogły być ilościowo oznaczane przy użyciu standardowych technik immunohistochemicznych powszechnie stosowanych w badaniach nad neurogenezą u dorosłych. Odnośnie do pierwszego kryterium, <s...

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie hodowli plastrów z wyraźną topografią hipokampa oraz ocena neurogenezy w zakręcie zębatym hipokampa. Cel ten osiąga się poprzez wstępną hodowlę plastrów hipokampa w naczyniu hodowlanym wyposażonym w specjalną membranę, a następnie znakowanie dzielących się komórek markerem mitotycznym.Następnie oznakowaną tkankę tnie się na sekcje. Na koniec sekcje barwi się przy użyciu standardowych procedur immunohistochemicznych w celu identyfikacji nowo powstałych neuronów. Ostatecznie immunohistochemia i liczenie komórek służą do pomiaru gęstości komórek oraz ich właściwości.Zazwyczaj osoby rozpoczynające naukę tej techniki mogą uznać ją za wymagającą, ponieważ wymaga ona dużej wprawy. Demonstracja wizualna jest kluczowa, gdyż etapy sekcji oraz proces przenoszenia tkanki z płytki hodowlanej na stoлик wibracyjny mogą być trudne do opanowania. Procedurę zademonstruje Adam Moza, doktorant w naszym laboratorium, który za pomocą czystego ostrza skalpela rozdzieli dwie półkule wyizolowanego mózgu szczura.Przenieś lewą półkulę z powrotem do dużej szalki Petriego, a drugą umieść stroną PS skierowaną w dół w lodzie z zimnym roztworem do sekcji. Obej

organotypic-slice-cultures-for-studies-of-postnatal-neurogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hodowanie tkanek w cienkich warstwach do badań nad neurogenezą pourodzeniową

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Ten film demonstruje metodę przygotowania organotypowych kultur wycinków hipokampa z mózgu szczeniaka szczura. Przedstawia etapy związane z sekcją hipokampa, krojeniem i warunkami hodowli wymaganymi do promowania żywotności i wzrostu komórek w wycinkach hipokampa, ostatecznie generując organotypowe kultury warstwowe.

Przygotowanie organtypowych kultur plasterkowych z hipokampa szczeniaka szczura

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Poznaj technikę kultur organotypowych do badania neurogenezy w zakręcie zębatym hipokampa. Metoda umożliwia manipulację neurogenezą in vitro oraz testowanie związków farmakologicznych w kontrolowanych warunkach.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Przeglądaj więcej filmów