Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek błonowych ulegających ekspresji w SIA coli do analiz strukturalnych i funkcjonalnych. Po pierwsze, bakterie są zbierane, kłamane i analizowane przez stronę SDS w celu wizualizacji prawidłowo sfałdowanych białek GFP za pomocą fluorescencji Ingel. W drugim etapie produkcja E. coli, która ma ekspresję białek błonowych będących przedmiotem zainteresowania, jest zwiększana, a całkowita frakcja błonowa jest przygotowywana z komórek po indukcji ekspresji białka.

Na koniec całkowita frakcja membranowa jest rozpuszczana w czterech różnych detergentach i monodyspersji detergentu. Rozpuszczony. Białka GFP analizuje się metodą chromatografii wykluczania wielkości. Ostatecznie białka mogą być monitorowane za pomocą fluorescencji, a profile wyjaśnień wykreślane w celu oceny agregacji monodyspersji i wolnego GFP w próbkach.

Produkcja rekombinowanych białek błonowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na ich niską rozpuszczalność i dziedziczenie niestabilności po ekstrakcji do detergentów. Doświadczenie pokazuje, że badania przesiewowe wielu wariantów białek błonowych, takich jak ortologi różnych gatunków, mogą poprawić wskaźnik powodzenia ekspresji białek błonowych. Fuzja z białkami zielonej fluorescencji używana do zgłaszania autentycznego fałdowania.

Pierwszy krok w naszym protokole opartym na GFP do badania przesiewowego ekspresji białek błonowych i E. coli wykorzystuje fluorescencję ingel lizatów detergentowych z całych komórek do identyfikacji konstruktów białek błonowych do dalszej analizy w oparciu o poziom ekspresji w ekranie, Zachowanie selekcji białek błonowych i różnych detergentów jest następnie oceniane za pomocą detekcji fluorescencji sprzężonej z chromatografią wykluczania wielkości. Dostarcza to informacji na temat monodyspersyjności kompleksów białkowych detergentów. Aby przeanalizować ekspresję bakteryjną indukowaną przez IPTG, zacznij od przeniesienia jednego mililitra duplikatu koliny potraktowanej IPTG z nocnej hodowli 24 bloków głębokich dołków do 96 bloków głębokich studzienek, uszczelnij bloki, a następnie wiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 6 000 razy G w temperaturze pokojowej.

Następnie odwróć blok, aby zdekantować media, delikatnie stukając w ręcznik papierowy, aby spuścić pozostały płyn. Ponownie uszczelnij płytkę i przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po co najmniej 20 minutach. Rozmrażaj granulki przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie użyj pipety wielokanałowej, aby całkowicie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu do lizy.

Potraktuj komórki 20 mikrolitrami roztworu DLPI, który wstrząsał z prędkością 1000 obr./min i czterema stopniami Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 10% doda multiside do każdej studzienki i inkubuj komórki przez kolejne 60 minut z potrząsaniem. Po odwirowaniu do obróbki DDM studzienka głębinowa blokuje, a następnie przenosi 10 mikrolitrów oczyszczonego lizatu na płytkę do mikromiareczkowania i dodaje 10 mikrolitrów buforu ładującego żel do strony SDS.

Teraz załaduj żel 10 mikrolitrami roztworu buforu lizatu na studzienkę i uruchom żel pod stałym napięciem od 100 do 120 woltów w chłodni przez dwie do 2,5 godziny, gdy membrana dotrze do dna. Umieść żel na imagerze z filtrem światła niebieskiego, aby wykryć białka fuzyjne w celu zwiększenia skali kultur komórkowych. Po przekształceniu Eloqua kompetentnej E coli, wybierz kolonię w 10 mililitrów bulionu energetycznego do nocnego wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka rozcieńczyć pięć mililitrów nocnej kultury w 500 mililitrach bulionu i kontynuować wzrost kultur z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Gdy OD przy 595 nanometrach wynosi około 0,5, wywołaj ekspresję, dodając IPTG do końcowego stężenia jednego milimola, a następnie umieść kulturę z powrotem w wytrząsarce na noc, tym razem w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego ranka zbierz komórki przez odwirowanie i przechowuj granulki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przygotować błony komórkowe. Ponownie zawiesić trzecie granulki o temperaturze pokojowej w pięciu mililitrach PBS na gram granulki komórkowej, zwiększając objętość w razie potrzeby, aż lepkość zmniejszy się do płynnej konsystencji. Następnie dodać chlorek magnezu do końcowego stężenia jednego milimolowego DNA do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i jedną paczkowaną tabletkę inhibitora proteazy na 20 gramów osadu komórkowego do komórek.

Następnie rozbij komórki za pomocą schłodzonego zakłócacza komórek pod ciśnieniem 30 KPSI, a następnie granuluj nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia przez 15 minut w temperaturze 30 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przenieś supinat do probówki ultrawirówkowej i zbierz całkowitą frakcję membrany, wirując supinat przez jedną godzinę w temperaturze 200 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie użyj homogenizatora komórkowego, aby ponownie zawiesić osad membrany w 10 mililitrach lodowatego PBS, aby rozpuścić membrany dla każdego detergentu, który ma być użyty.

Porcja 900 mikrolitrów zawiesiny membranowej do 1,5 mililitrowej rurki poliwirowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów każdego świeżo przygotowanego detergentu do odpowiednich 1,5 mililitrowych probówek i inkubuj mieszaniny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z łagodną roślinnością. Po godzinie zdegranulować detergent i rozpuszczalne frakcje za pomocą ultrawirówki stołowej, upewniając się, że probówki są wypełnione co najmniej do połowy i zachowują czynnik leżący na wznak do fluorescencyjnej chromatografii wykluczającej wykrytą wielkość lub analizy FEC.

Następnie kolumna wykluczająca wielkość równika o szerokim zakresie frakcjonowania z uruchomionym buforem przepływu z szybkością 0,3 mililitra na minutę. Następnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów rozpuszczonej próbki membranowej do kolumny przy tym samym natężeniu przepływu i monitorować profil elucian za pomocą optyki fluorescencyjnej. Na koniec zaimportuj wyjaśnione dane dotyczące objętości i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego w celu wyświetlenia graficznego i przeanalizuj pozostały rozpuszczony materiał membranowy za pomocą fluorescencji ingelowej.

Jak wykazano wcześniej, wspomniana rodzina białek jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. Na tych zdjęciach pokazany jest przedstawiciel w żelowej wizualizacji fluorescencyjnej 24 OUTTA 47 wspomnianych konstruktów. Intensywność pasm daje wskazówkę co do poziomu ekspresji.

Na przykład białko fuzyjne w czwartej scenie pasa jest dobrze wyrażone w obu szczepach. Jednak dodatkowe pasma o niższej masie cząsteczkowej sugerują, że białko jest częściowo degradowane na wielu ścieżkach. Istnieje prążek, którego rozmiar odpowiada samej GFP.

Na przykład G four i H four są całkowicie podzielone na wolne GFP w C 41 DE trzy P leży S. Natomiast w LEMO 21 DE three, na tych wykresach znajduje się trochę nienaruszonego białka. Analiza dwóch konstruktów, które dobrze wypadły w pierwotnym badaniu przesiewowym poprzez wykluczenie wielkości wykryte przez fluorescencję, pokazuje, jak białka zachowują się inaczej w zależności od tego, który z czterech testowanych detergentów był testowany.

Na przykład, białko to dało tylko symetryczny pik z agregacją ściółki w Dool Multiside, co czyni je detergentem z wyboru do późniejszego oczyszczania. Z kolei drugie białko fuzyjne wykazywało podobny profil we wszystkich badanych detergentach. Protokół ten można łatwo rozszerzyć, aby objąć na przykład różne szczepy E. coli hodowane w różnych warunkach ekspresji oraz dodatkowe środki odstraszające zarówno w pierwotnych, jak i wtórnych badaniach przesiewowych.

Podsumowując, głównym celem tego protokołu jest umożliwienie badania przesiewowego dużej liczby białek błonowych pod względem ekspresji i detergentów w celu zidentyfikowania kandydatów do dalszej analizy.