Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja białek błonowych eksprymowanych w SIA coli do analiz strukturalnych i funkcjonalnych. W pierwszej kolejności bakterie są zbierane, lizowane i analizowane metodą SDS-PAGE w celu wizualizacji prawidłowo sfałdowanych białek GFP za pomocą fluorescencji Ingel. W drugim kroku zwiększa się skalę produkcji szczepu E. coli, w którym stwierdzono ekspresję interesujących białek błonowych, a następnie, po indukcji ekspresji białek, przygotowuje się z komórek frakcję całkowitych błon.

Na koniec całkowitą frakcję błonową solubilizuje się w czterech różnych detergentach, a monodyspersyjność białek GFP po solubilizacji analizuje się za pomocą chromatografii wykluczania. Ostatecznie białka można monitorować za pomocą fluorescencji, a uzyskane profile elucji wykreślić w celu oceny agregacji, monodyspersyjności oraz zawartości wolnego GFP w próbkach.

Produkcja rekombinowanych białek błonowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na ich niską rozpuszczalność oraz niestabilność po ekstrakcji do detergentów. Doświadczenie wykazało, że screening wielu wariantów białek błonowych, takich jak ortologi z różnych gatunków, może zwiększyć skuteczność ekspresji białek błonowych. Fuzja z zielonymi białkami fluorescencyjnymi służy do raportowania prawidłowego fałdowania.

Pierwszy krok w naszym protokole opartym na GFP do przesiewania ekspresji białek błonowych w e coli wykorzystuje fluorescencję w żelu lizatów detergentowych z całych komórek w celu zidentyfikowania konstruktów białek błonowych do dalszej analizy na podstawie poziomu ekspresji w przesiewie. Następnie ocenia się zachowanie wybranych białek błonowych w różnych detergentach, wykorzystując detekcję fluorescencji sprzężoną z chromatografią wykluczania rozmiarów. Dostarcza to informacji o monodyspersyjności kompleksów białko-detergent. Aby przeanalizować bakteryjną ekspresję indukowaną IPTG, należy rozpocząć od przeniesienia jednego mililitra e coli traktowanej IPTG z dubletów hodowli nocnej z bloków 24-dołkowych do bloków 96-dołkowych, zamknąć bloki, a następnie odwirować komórki przez 10 minut przy 6 000 ×g w temperaturze pokojowej.

Następnie odwrócić blok, aby odlać medium, delikatnie opukując go o ręcznik papierowy w celu usunięcia pozostałej cieczy. Ponownie zamknąć płytkę i przechowywać komórki w temperaturze -80 °C po upływie co najmniej 20 minut. Rozmrozić pellety przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej całkowicie resuspendować komórki w 200 µL buforu do lizy.

Komórki inkubowano z 20 µL roztworu DLPI, wytrząsając przy 1000 RPM w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie do każdej studni dodano 25 µL 10% DDM i inkubowano komórki przez kolejne 60 minut z wytrząsaniem. Po obróbce DDM blok z głębokimi studniami odwirowano, a następnie 10 µL oczyszczonego lizatu przeniesiono na płytkę mikrotitracyjną i dodano 10 µL buforu do ładowania żelu SDS-PAGE.

Następnie napełnij każdą studzienkę żelu 10 µL roztworu buforu do lizy i prowadź elektroforezę przy stałym napięciu od 100 do 120 V w pomieszczeniu chłodniczym przez 2 do 2,5 godziny, aż czoło prądu dotrze do dolnej krawędzi żelu. Umieść żel w systemie obrazowania z filtrem światła niebieskiego w celu detekcji białek fuzyjnych, aby zwiększyć skalę hodowli komórkowych. Po transformacji kompetentnych komórek e coli, przenieś pojedynczą kolonię do 10 mL pożywki LB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.

Następnego ranka należy rozcieńczyć 5 ml kultury nocnej w 500 ml pożywki power broth i kontynuować hodowlę z wytrząsaniem przy 250 RPM i 37 °C. Gdy wartość OD przy 595 nm wyniesie około 0,5, należy indukować ekspresję poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 1 mM, a następnie umieścić kulturę z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem na noc, tym razem w temperaturze 20 °C. Następnego ranka należy zebrać komórki poprzez wirowanie i przechowywać osady w temperaturze -80 °C.

Aby przygotować błony komórkowe, resuspenduj trzecie osady w temperaturze pokojowej w 5 ml PBS na gram osadu komórkowego, zwiększając objętość w razie potrzeby, aż lepkość spadnie do konsystencji płynnej. Następnie dodaj do komórek chlorek magnezu do stężenia końcowego 1 mM, DNA do stężenia końcowego 10 µg/ml oraz jedną gotową tabletkę inhibitora proteaz na 20 g osadu komórkowego.

Następnie rozbij komórki za pomocą schłodzonego homogenizatora komórkowego pod ciśnieniem 30 KPSI, a następnie odwirowuj niezniszczone komórki i resztki komórkowe przez 15 minut przy 30 000 ×g i temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do probówki do ultrawirowania i wyizoluj całkowitą frakcję błonową, wirowując nadsącz przez jedną godzinę przy 200 000 ×g i temperaturze 4 °C. Następnie użyj homogenizatora komórkowego, aby zawiesić osad błonowy w 10 ml lodowatego PBS w celu solubilizacji błon dla każdego z użytych detergentów.

Przenieś 900 µL zawiesiny błonowej do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL. Następnie dodaj 100 µL każdego ze świeżo przygotowanych detergentów do odpowiednich probówek 1,5 mL i inkubuj mieszaniny w temperaturze 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu. Po godzinie odwirowuj frakcje detergentowe i rozpuszczalne za pomocą ultra wirówki stołowej, upewniając się, że probówki są wypełnione co najmniej do połowy, a następnie zachowaj nadsącz do chromatografii wykluczania z detekcją fluorescencyjną lub analizy FEC.

Następnie należy przygotować kolumnę do chromatografii wykluczania o szerokim zakresie frakcjonowania, przepuszczając przez nią bufor płuczący z prędkością 0,3 ml/min. Następnie na kolumnę nanosi się 100 µl zsolubilizowanej próbki błony z tą samą prędkością przepływu, monitorując profil elucji za pomocą optyki fluorescencyjnej. Na koniec dane dotyczące objętości elucji i natężenia fluorescencji importuje się do programu arkusza kalkulacyjnego w celu prezentacji graficznej, a pozostały zsolubilizowany materiał błonowy analizuje się za pomocą fluorescencji w żelu.

Jak wykazano wcześniej, wspomniana rodzina białek jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. Na tych obrazach przedstawiono reprezentacyjną wizualizację fluorescencji w żelu 24 z 47 wspomnianych konstruktów. Intensywność prążków wskazuje na poziom ekspresji.

Na przykład białko fuzyjne w ścieżce cztery wykazuje wysoką ekspresję w obu szczepach. Jednak obecność dodatkowych prążków o niższej masie cząsteczkowej sugeruje, że białko uległo częściowej degradacji w wielu ścieżkach. Widoczny jest prążek, którego wielkość odpowiada samemu białku GFP.

Na przykład G four i H four ulegają całkowitej degradacji do wolnego GFP w szczepie C 41 DE three P lies S. Natomiast w LEMO 21 DE three w tych wykresach występuje pewna ilość nienaruszonego białka. Analiza dwóch konstruktów, które uzyskały dobre wyniki w badaniu przesiewowym pierwotnym za pomocą fluorescencyjnej chromatografii wykluczania wielkości, pokazuje, jak białka zachowują się różnie w zależności od tego, który z czterech detergentów został przetestowany.

Na przykład białko to dało jedynie symetryczny piku przy niewielkiej agregacji w Dool Multiside, co uczyniło ten detergent wyborem optymalnym do dalszej puryfikacji. W przeciwieństwie do niego, drugie białko fuzyjne wykazywało podobny profil we wszystkich testowanych detergentach. Niniejszy protokół można łatwo rozszerzyć, aby uwzględnić na przykład różne szczepy e coli hodowane w odmiennych warunkach ekspresji oraz dodatkowe detergenty zarówno w przesiewach pierwotnych, jak i wtórnych.

Podsumowując, głównym celem niniejszego protokołu jest umożliwienie przesiewowej analizy ekspresji i solubilizacji w detergentach dla dużej liczby białek błonowych, aby zidentyfikować kandydatów do dalszych badań.