Name: Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę przesiewową białek błonowych w Escherichia coli z wykorzystaniem fuzji GFP i chromatografii FSEC. Protokół umożliwia szybką ocenę ekspresji, stabilności i kompatybilności z detergentami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

OPPF-UK jest finansowane przez Radę Badań Medycznych w Wielkiej Brytanii (grant MR/K018779/1) oraz Laboratorium Białek Błonowych przez Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

1. Budowa wektorów wyrażeń
<ol>
	<li>Użyj klonowania infuzji PCR, aby skonstruować do 96 plazmidów ekspresyjnych równolegle przy użyciu wektorów pOPINE-3C-GFP i pOPIN-N-GFP, które dodają rozszczepialne fuzje C-końcowe lub N-końcowe GFP-His6 do sekwencjiodpowiednio 13. 
	nuta: Wybór wektora jest podyktowany topologią białka, ponieważ GFP musi być wyrażony w cytozolu, a zatem dla białka z cytozolowym N-końcem i zewnątrzkomórkowym C-końcem użylibyśmy pOPIN-N-GFP, a dla zewnątrzkomórkowego N-końca i cytozolowego C-końca w użyjemy pOPINE-3C-GFP. Tam, gdzie oba końce są cytozolowe, użyjemy pOPINE-3C-GFP, chyba że istnieje funkcjonalny powód, aby nie oznaczać C-końca.</li>
	<li>Amplifikować sekwencje DNA kodujące białka błonowe za pomocą starterów zawierających następujące pokazane rozszerzenia: 
	pOPINE-3C-GFP (Starter do przodu — AGGAGATATACCATG; Starter odwrotny — CAGAACTTCCAGTTT) i pOPIN-N-GFP (Starter do przodu — AAGTTCTTTTTCAGGGCCCG; Reverse primer — ATGGTCTAGAAAGCTTTA).</li>
	<li>Przeanalizuj reakcję PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po otrzymaniu czystych produktów PCR dodać 5 U DpnI do każdego dołka (uzupełnić w 5 μl 1x buforu reakcyjnego DpnI). Oczyść produkty PCR za pomocą kulek magnetycznych w formacie 96-dołkowym. 
	nuta: DpnI jest dodawany w celu usunięcia wektora szablonu; ten krok nie jest konieczny, jeśli genomowe DNA jest używane jako matryca.</li>
	<li>Dodać 1 μl (100 ng) odpowiedniego wektora linearyzowanego do każdego dołka płytki PCR.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać x μl oczyszczonej wkładki PCR do odpowiednich dołków płytki PCR. Upewnij się, że wszystkie produkty mieszczą się w zakresie 10-250 ng.</li>
	<li>Dodać (9 x) μl wody do studzienki i przenieść całe 10 μl do probówki zawierającej suchy odczynnik fuzyjny. Pozostaw na 30 sekund.</li>
	<li>Krótko wymieszać zawartość, pipetując w górę i w dół. Przenieś reakcje z powrotem na oryginalną płytkę PCR i zapieczętuj.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C w termocyklerze.</li>
	<li>Natychmiast po zakończeniu reakcji przenieść reakcje na lód i dodać 40 μl TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Zamroź od razu lub przekształć się w kompetentne komórki. Do przemiany należy użyć 3 μl rozcieńczonej reakcji na 50 μl podwielokrotności kompetentnych komórek E. coli o wysokiej kompetencji (> 5 x 109 transformantów/μg).</li>
	<li>Dodać 1 ml agaru LB uzupełnionego 50 μg/ml karbenicyliny na studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (do klonowania należy przygotować studzienki na 2 x więcej konstruktów).</li>
	<li>Po wyrośnięciu, Po wyroście z płytki 25 μl i 25 μl rozcieńczenia kultury 1:5 na agar zawierający 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Rozłóż komórki, delikatnie przechylając płytkę.</li>
	<li>Suszyć płytkę ze zdjętą pokrywką przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C lub w okapie przepływowym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Założyć pokrywkę, obrócić płytkę do góry nogami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz dwie kolonie i przygotuj wektory w mini.</li>
	<li>PCR weryfikuje konstrukty przy użyciu specyficznego dla konstruktu startera odwrotnego i startera do przodu specyficznego dla wektora (np. pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).</li>
</ol>
2. Transformacja szczepów E. coli Expression
Uwaga: Przed wykonaniem tego protokołu, kompetentne komórki E. coli są tworzone, porcjowane i przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C, jak opisano wcześniej13. Ekspresja białek błonowych jest rutynowo badana przesiewowo w dwóch szczepach, Lemo21(DE3) i C41(DE3)pLysS. Aby ułatwić interpretację wyników, pomocne może być uwzględnienie kontroli pozytywnej, np. plazmidu wykazującego ekspresję GFP lub białka błonowego połączonego z GFP, o którym wiadomo, że ulega ekspresji, oraz kontroli ujemnej pustego wektora.
<ol>
	<li>Rozmrozić porcjowaną E. coli na lodzie. Dodać 3 μl mini-przygotowanego plazmidu ekspresyjnego do każdej podwielokrotności kompetentnych komórek.</li>
	<li>Inkubować mieszankę na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Szok termiczny ogniw przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Pozwól komórkom zregenerować się na lodzie przez 2 minuty, a następnie dodaj 300 μl bulionu do każdej probówki.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze statycznym o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować agar LB na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, uzupełnionej 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu. Dodać ramnozę do końcowego stężenia 0,25 mM do studzienek zawierających Lemo21 (DE3). 
	nuta: Jeśli istnieje prawdopodobieństwo, że produkt jest toksyczny, studzienki zawierające pLysS C41(DE3) można uzupełnić 1% (w/v) glukozy.</li>
	<li>Przenieść 30 μl komórek z mieszanki transformacyjnej na płytki agarowe LB. Rozprowadzić i osuszyć płytkę zgodnie z opisem w 1.13-1.15.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur starterowych na noc
Uwaga: Zawsze przygotowuj kultury na noc dzień po transformacji, nigdy ze starej płytki transformacji.
<ol>
	<li>Dodać 0,7 ml bulionu energetycznego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki głębokiej uzupełnionej 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu. Dodać ramnozę do studzienek zawierających Lemo21 (DE3) do końcowego stężenia 0,25 mM. Opcjonalnie uzupełnij C41(DE3) pLysS o 1% (w/v) glukozy; Patrz wyżej (uwaga 2.6).</li>
	<li>Wybierz jedną kolonię z płytek transformacyjnych przez noc do każdej studzienki. Uszczelnij blok uszczelką przepuszczającą gaz.</li>
	<li>Wytrząsać blok z prędkością 250 obr./min w inkubatorze o dużym wyrzucie (np. orbita 25 mm) lub przy prędkości 600 obr./min w inkubatorze o małym wyrzucie (np. orbita 4,3 mm) w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>
4. Wzrost i indukcja kultur
<ol>
	<li>Dodać 3 ml bulionu energetycznego uzupełnionego 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu do każdej studzienki 24-dołkowej płytki głębinowej. Dodać L-ramnozę (i glukozę) zgodnie z opisem w punkcie 3.1. Użyć 3 ml kultury, aby umożliwić zbiór w dwóch egzemplarzach i umożliwić pewne odparowanie wody przez uszczelkę przepuszczającą gaz.</li>
	<li>Ustawić kultury ekspresyjne, dodając 150 μl nocnych kultur Lemo21 (DE3) lub C41(DE3) pLysS do każdej studzienki z 24-dołkowych bloków głębokich.</li>
	<li>Potrząsaj blokami w temperaturze 37 °C, aż średnia średnica zewnętrzna przy 595 nm wyniesie ~0,5 przez płytkę.</li>
	<li>Wywołać ekspresję poprzez dodanie IPTG do kultur do końcowego stężenia 1,0 mM IPTG.</li>
	<li>Hodować kultury przez noc (18-20 godzin) z wytrząsaniem w temperaturze 20 °C.</li>
</ol>
5. Analiza ekspresji za pomocą fluorescencji w żelu
<ol>
	<li>Zbierz w dwóch egzemplarzach. Przenieść 1 ml kultury z każdej studzienki do kwadratowego dołka o stożkowym dnie, 96-dołkowym bloku studni głębinowych. 
	nuta: Zebrać w dwóch egzemplarzach w przypadku pęknięcia bloku lub w celu umożliwienia przetestowania alternatywnego detergentu, jeśli jest to pożądane.</li>
	<li>Uszczelnić bloki i zebrać komórki przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odwróć blok i zdekantuj pożywkę. Delikatnie postukaj blokiem o ręcznik papierowy, aby spuścić pozostałe media.</li>
	<li>Uszczelnij płytki i przechowuj w temperaturze -80 °C przez co najmniej 20 minut. Opcjonalnie pozostaw eksperyment w tym miejscu, a blok przetworzony w dogodnym dla siebie czasie.</li>
	<li>Rozmrażaj granulki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj pipety wielokanałowej lub wytrząsarki orbitalnej (1 000 obr./min przez 10 min) w temperaturze 4 °C, aby całkowicie zawiesić komórki w 200 μl buforu do lizy (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% v/v Tween 20, dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH).</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu DLPI (20 μl DNaseI (4 000 jednostek/ml), 20 mg lizozymu i 20 μl koktajlu inhibitorów proteazy w końcowej objętości 2 ml wody). Inkubować przez 10 minut z wytrząsaniem (~1 000 obr./min) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 25 μl 10% n-dodecylu β-D-maltozydu (DDM). </li>
	<li>Inkubować przez 60 minut z wytrząsaniem (~1 000 obr./min) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować blok studzienki głębinowej przy 6 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 10 μl oczyszczonego lizatu na płytkę do mikromiareczkowania i dodać 10 μl żelowego buforu ładującego SDS PAGE (100 mM Tris, pH 6,8, 4% w/v SDS, 0,2% w/v błękitu bromofenolowego, 10% v/v β-merkaptoetanolu i 20% v/v glicerolu). ostrożność! NIE GOTUJ PRÓBKI.</li>
	<li>Załadować 10 μl próbki z kroku 5.11/studzienka na żel(e) SDS PAGE i uruchomić pod napięciem 100-120 V (stałe napięcie) w chłodnym pomieszczeniu, aż czoło barwnika osiągnie dno (2-2,5 godziny).</li>
	<li>Umieścić żel na imagerze (np. z filtrem światła niebieskiego do wykrywania białek fuzyjnych GFP). Czas naświetlania jest tak dobrany, aby zapewnić, że najjaśniejsze pasma nie są nasycone.</li>
</ol>
6. Zwiększanie skali hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Przekształć podwielokrotność kompetentnej E. coli, jak opisano w sekcji 2.</li>
	<li>Zebrać rodzinę posadczą do 10 ml bulionu energetycznego (uzupełnionego zgodnie z opisem w sekcji 3) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 ml nocnej kultury w 500 ml bulionu.</li>
	<li>Rosnąć z wytrząsaniem przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C, aż średnica zewnętrzna przy 595 nm wyniesie ~0,5.</li>
	<li>Wywołać ekspresję przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1,0 mM.</li>
	<li>Rosnąć przez noc z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zbierać komórki przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Przygotowanie membran
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki (jeśli to konieczne) w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 1x PBS pH 7,5 w objętości 5 ml na gram osadu komórkowego; W razie potrzeby zwiększać objętość, aż lepkość zmniejszy się do rzadkiej konsystencji. Dodać MgCl2 do końcowego stężenia 1 mM, DNAzę I do końcowego stężenia 10 μg/ml i jedną paczkowaną tabletkę inhibitora proteazy na 20 g osadu komórkowego. Rozbij komórki za pomocą schłodzonego rozdzielacza komórek pod ciśnieniem 30 kpsi.</li>
	<li>Nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia osadzać w masie 30 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do probówki do ultrawirówki.</li>
	<li>Zebrać całkowitą frakcję membranową, odkręcając supernatant w ultrawirówce o sile 200 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad membranowy w lodowato zimnym 10 ml PBS o pH 7,5 za pomocą homogenizatora komórkowego. Dla każdego detergentu wymagane jest 1 ml zawieszonych membran. Opcjonalnie na tym etapie zawiesinę membranową należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Solubilizacja i analiza frakcji membranowej
<ol>
	<li>Rozmrozić frakcję membranową (jeśli to konieczne) i dla każdego detergentu, który ma być użyty do rozpuszczania, podamy 900 μl zawiesiny membranowej do probówki do mikrowirówki polialomerowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 100 μl każdego świeżo przygotowanego detergentu (10% w/v roztwory DDM, DM, Cymal-6 i LDAO) do końcowego stężenia 1% do podanej probówki o pojemności 1,5 ml. W celu rozpuszczania eukariotycznych białek błonowych do detergentów można dodać hemibursztynian cholesterolu (0,2% stężenia końcowego).</li>
	<li>Inkubować mieszaniny w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Frakcję nierozpuszczalną w detergencie osadnić za pomocą ultrawirówki stołowej, upewniając się, że probówki są co najmniej do połowy wypełnione, w temperaturze 150 000 g w temperaturze 4 °C przez 45 minut i zachowując supernatant. 
	nuta: Skuteczność solubilizacji detergentu można oszacować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, mierząc fluorescencję GFP rozpuszczonych membran z frakcją nierozpuszczalną w detergencie zawieszoną w tej samej objętości PBS.</li>
	<li>Przeanalizuj monodyspersyjność różnych kompleksów białek błonowych detergentu: za pomocą chromatografii wykluczającej z wykrywaniem fluorescencji (FSEC).</li>
	<li>W przypadku analizy FSEC należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość o szerokim zakresie frakcjonowania, np. od 5 000 do 5 000 000 masy cząsteczkowej, z buforem roboczym (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Należy użyć tego buforu dla wszystkich próbek, tj. nie jest on zmieniany dla każdego badanego detergentu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl rozpuszczonych membran do kolumny z natężeniem przepływu 0,3 ml/min. Monitorować profil elucji za pomocą optyki fluorescencyjnej (wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 512 nm). Jeśli wbudowany monitor fluorescencji nie jest dostępny, zbierz frakcje i odczytaj fluorescencję w czytniku płytek.</li>
	<li>Importuj dane dotyczące objętości elucji i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego w celu wyświetlenia graficznego.</li>
	<li>Przeanalizować pozostały rozpuszczony materiał membranowy za pomocą fluorescencji w żelu, jak opisano w sekcji 5.</li>
</ol>

<ol><li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial%2C+archaean%2C+and+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li>
<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li>
<li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin%3A+A+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li>
<li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li>
<li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems%3A+a+benchmarking+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li>
<li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li>
<li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole opisanym w tym artykule klonowanie niezależne od ligacji do wektora reporterowego GFP jest połączone z detekcją fluorescencyjną w celu szybkiego badania przesiewowego względnej ekspresji wielu białek błonowych w E. coli. Wektory można wykonać w ciągu czterech dni roboczych, a podstawowe badanie przesiewowe ekspresji zajmuje kolejny tydzień. Fluorescencja w żelu lizatów detergentowych całych komórek służy do klasyfikowania trafień ekspresji w celu dalszej analizy na wtórnym ekranie. Przedstawione pierwotne badanie przesiewowe nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza inkubatorem z wytrząsarką odpowiednim do hodowli komórek w blokach studni głębinowych. Wszystkie inne czynności związane z cieczami z użyciem 96-dołkowych płytek SBS można wykonywać za pomocą pipet wielokanałowych. Protokół może być łatwo zmodyfikowany w celu uwzględnienia innych szczepów E. coli hodowanych w innych warunkach ekspresji (np. w niższej temperaturze). W przypadku LEMO21(DE3) miareczkowanie poziomu ramnozy (od 0 do 2,0 mM) dodanego w celu modulacji szybkości transkrypcji może zwiększyć poziom ekspresji niektórych białek błonowych7 . Detergenty inne niż DDM mogą być używane do ekstrakcji w pierwotnym sicie, chociaż ostrzejsze detergenty mogą rozpuszczać białka z ciał inkluzyjnych, a tym samym dawać fałszywie dodatnie wyniki. Oczywiście, im bardziej skomplikowany staje się początkowy ekran, tym bardziej czasochłonny jest eksperyment.
Badanie wtórne polega na przygotowaniu całkowitej frakcji błonowej z trafień ekspresji zidentyfikowanych na ekranie pierwotnym. Jest to kluczowy krok, ponieważ potwierdzi lokalizację białek fuzyjnych w błonie komórek E. coli . Późniejsza ekstrakcja białka fuzyjnego GFP w różnych detergentach jest monitorowana za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość z wykrywaniem fluorescencji rozpuszczonego materiału w celu oceny monodyspersyjności kompleksów detergent-białko. Jest to kolejny krytyczny krok, ponieważ identyfikuje najbardziej odpowiedni detergent do rozpuszczania białka błonowego do dalszego przetwarzania. Doświadczenie pokazuje jednak, że dalsza optymalizacja doboru detergentów może być nadal wymagana podczas oczyszczania i krystalizacji. Dowody na jednolite zachowanie w różnych detergentach, w tym w tych o stosunkowo małym rozmiarze miceli (np. LDAO), wydają się być dobrym wskaźnikiem skłonności do tworzenia dobrze dyfrakujących kryształów, przynajmniej w przypadku prokariotycznych białekbłonowych14. Pod tym względem profil pokazany dla białka błonowego na rysunku 2B wydaje się bardzo korzystny.
Główną zaletą stosowania reportera GFP jest to, że zapewnia on szybki odczyt ekspresji w nieoczyszczonych próbkach. Wadą jest to, że białko fuzyjne GFP musi zostać usunięte podczas oczyszczania białka w celu krystalizacji. W przypadku zastosowanych tutaj wektorów, miejsce proteazy 3C rinowirusa umożliwia rozszczepienie GFP. Alternatywnie, łatwo jest ponownie sklonować białka kandydujące, zidentyfikowane na ekranie, do wektorów, które dodają tylko znacznik polihistydyny lub innego powinowactwa w celu późniejszego oczyszczenia. Zakłada się, że fuzja z GFP nie jest konieczna do wyrażenia. Główną alternatywą dla stosowania fuzji do GFP do wykrywania ekspresji białek błonowych i solubilizacji jest dodanie tylko znacznika histydyny. Jednak takie podejście zazwyczaj wymaga rozpoczęcia od frakcji membranowej15 , co w przypadku oceny wielu wariantów stałoby się bardzo czasochłonne.
Podsumowując, głównym celem protokołu opisanego w tym artykule jest umożliwienie szybkiej oceny dużej liczby wariantów sekwencji białek błonowych pod względem ekspresji i solubilizacji detergentów oraz nadania im priorytetu w celu głębszej analizy.

Oszacowano, że białka błonowe stanowią około 20-30% genów kodowanych we wszystkich sekwencjonowanych genomach 1, w tym w genomie ludzkim 2. Biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, na przykład w transporcie metabolitów, wytwarzaniu energii i jako cele leków, istnieje duże zainteresowanie określeniem ich trójwymiarowej struktury. Jednak w porównaniu z białkami rozpuszczalnymi, białka błonowe są bardzo niedostatecznie reprezentowane w Banku Danych o Białkach. W rzeczywistości z 99 624 uwolnionych struktur w PDB (<a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a>) tylko 471 (<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>) jest sklasyfikowanych jako białka błonowe. Odzwierciedla to trudności techniczne związane z pracą z białkami błonowymi, które naturalnie ulegają ekspresji na stosunkowo niskich poziomach; Rodopsyna jest jednym z nielicznych wyjątków3,4. Nadmierna ekspresja wersji rekombinowanych w komórkach heterologicznych często powoduje nieprawidłowe fałdowanie i słabe ukierunkowanie na błonę, co ogranicza ogólny poziom produkcji. Wybór najlepszego detergentu do ekstrakcji i solubilizacji białka błonowego po ekspresji utrudnia późniejsze oczyszczanie i wymaga starannej optymalizacji.
Escherichia coli pozostaje najczęściej używanym gospodarzem ekspresji dla białek błonowych, stanowiąc 72% (<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>) struktur rozwiązanych do tej pory, które pochodzą prawie wyłącznie ze źródeł bakteryjnych. Wyizolowano specyficzne szczepy E. coli, C41(DE3) i C43(DE3), które nie prowadzą do nadmiernej ekspresji białek błonowych, a tym samym pozwalają uniknąć skutków toksyczności obserwowanych dla innych szczepów BL215,6. Dostrojenie poziomu ekspresji rekombinowanych białek błonowych wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla optymalizacji poziomu produkcji6,7.
W wielu przypadkach udana produkcja białek błonowych do określenia struktury wymagała oceny wielu wersji, w tym delecji amino- i karboksylowo-końcowych, wielu ortologów w celu wykorzystania naturalnej zmienności sekwencji i różnych białek fuzyjnych6-8. Dlatego niezbędna jest metoda badania przesiewowego ekspresji wielu białek błonowych równolegle. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest fuzja białka z białkiem zielonej fluorescencji (GFP), co umożliwia śledzenie ekspresji bez konieczności oczyszczania białka. W ten sposób informacje o poziomie ekspresji, stabilności i zachowaniu w różnych detergentach można ocenić przy użyciu niewielkich ilości nieoczyszczonego materiału9-12.
W tym artykule opisujemy uproszczony protokół klonowania i badania przesiewowego ekspresji białek błonowych u E. coli, wykorzystując fuzję do GFP jako raportowanie produkcji i późniejszą charakterystykę kompleksów detergent: białkowe (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>pOPIN-N-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pOPINE-3C-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3)pLysS</td><td>Lucigen (http://lucigen.com/)</td><td>60444-1</td><td></td></tr><tr><td>LEMO21(DE3)</td><td>New England Biolabs</td><td>C2528H</td><td></td></tr><tr><td>System klonowania In-Fusion HD EcoDry, 96 Rxns</td><td>Clontech/Takara</td><td>639688</td><td></td></tr><tr><td>Rosół mocy</td><td>Wymiary molekularne (http://www.moleculardimensions.com/)</td><td>MD12-106-1</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, bez EDTA; Koktajl inhibitorów proteazy&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat L-ramnozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Hemibursztynian cholesterolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>CYMAL-6 (6-Cykloheksylo-1-Heksyl-&beta;-D-Maltozyd)</td><td>Anatrace</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecyl &beta;-maltozyd)</td><td>Generon</td><td>D97002</td><td></td></tr><tr><td>DM (n-decyl &beta;-maltozyd)</td><td>Generon</td><td>D99003</td><td></td></tr><tr><td>LDAO (N,N-dimetylo-n-dodecylamina N-tlenek)</td><td>Generon</td><td>D71111</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Eq384 8&nbsp; Kanały 1-30 i mikro; l</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4672030</tr><tr><td>Pipeta Rainin Pipet-Lite XLS 6-kanałowa 100-1 200 &mikro; l LTS Spacer</td><td>Anachem</td><td>LA6-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Rainin Lekka XLS + 8-kanałowa 2-20 i mikro; l Pipeta LTS</td><td>Anachem</td><td>L8-20XLSPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS 8-kanałowa 100-1,200 i mikro; l Końcówka</td><td>LTS Anachem</td><td>L8-1200XLS</td> 24-dołkowe <td></td></tr><tr><td>bloki głębinowe V z dnem</td><td>Porvair sciences</td><td>360115</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fluorescencyjne białko Standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 10% żele białkowe Bis-Tris Midi, 26 dołków</td><td>Life Technologies</td><td>WG1203BOX</td><td></td></tr><tr><td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>Vibramax 100</td><td>Heidolph</td><td>544-21200-00</td><td></td></tr><tr><td>Przystawka do rolek napinających</td><td>Heidolph</td><td>549-81000-00</td><td></td></tr><tr><td>ptima L-100 Ultrawirówka z wirnikiem 45-Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>ultrawirówka Optima Max-XP z wirnikiem TLA-55</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stojąca, Avanti J-26S XPI z JA-17 i wirniki JS-5.3&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14535</td><td></td></tr><tr><td>Prominence UFLC z RF-20A Detektor fluorescencji</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6 10/300 GL rozmiar kolumny wykluczającej</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SSI5R-HS SHEL LAB Inkubator z wytrząsaniem modeli podłogowych, 5 stóp sześciennych (144&nbsp; L), 30-850 obr./min</td><td>Shel Lab&nbsp;</td><td>SSI5R-HS</td><td></td></tr><tr><td>Innova44R Inkubator</td><td>New Brunswick /Eppendorf</td><td>Innova44R</td><td></td></tr><tr><td>TS Series 0,75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1&nbsp; PH (40 kpsi)</td><td>Systemy stałe</td><td>PL083016</td><td></td></tr><tr><td>monohydrat L-ramnozy</td><td>Sigma</td><td>83650</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe białek błonowych escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Produkcja rekombinowanych białek błonowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych pozostaje technicznie trudna ze względu na niski poziom ekspresji i nieodłączną niestabilność wielu białek błonowych po rozpuszczeniu w detergentach. Opisano protokół, który łączy klonowanie białek błonowych niezależne od ligacji jako fuzje GFP z ekspresją w Escherichia coli wykrywaną przez fluorescencję GFP. Umożliwia to konstruowanie i badanie przesiewowe ekspresji wielu białek/wariantów błonowych w celu zidentyfikowania kandydatów odpowiednich do dalszej inwestycji czasu i wysiłku. Reporter GFP jest używany w pierwotnym ekranie ekspresji poprzez wizualizację fluorescencji GFP po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE). Białka błonowe, które wykazują zarówno wysoki poziom ekspresji, jak i minimalną degradację, na co wskazuje brak wolnego GFP, są wybierane do wtórnego badania przesiewowego. Konstrukty te są skalowane, a całkowita frakcja membranowa jest przygotowywana i rozpuszczana w czterech różnych detergentach. Po ultrawirowaniu w celu usunięcia materiału nierozpuszczalnego w detergentach, lizaty są analizowane za pomocą chromatografii wykluczającej z detekcji fluorescencji (FSEC). Monitorowanie profilu wykluczania wielkości za pomocą fluorescencji GFP dostarcza informacji na temat monodyspersyjności i integralności białek błonowych w różnych detergentach. Białko: kombinacje detergentów, które eluują się z symetrycznym pikiem z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnego GFP i minimalną agregacją, są kandydatami do późniejszego oczyszczania. Korzystając z powyższej metodologii, przeanalizowano heterologiczną ekspresję białek SED (kształt, wydłużenie, podział i zarodnikowanie) w E. coli z 47 różnych gatunków bakterii. Białka te mają zazwyczaj dziesięć domen transbłonowych i są niezbędne do podziału komórek. Wyniki pokazują, że produkcja ortologów SED u E. coli była bardzo zmienna w odniesieniu do poziomów ekspresji i integralności białek fuzyjnych GFP. W eksperymencie zidentyfikowano podzbiór do dalszych badań.

Rodzina białek SEDS (shape, elongation, division, and sporulation) jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. Te białka integralne posiadają zazwyczaj dziesięć domen transbłonowych, przy czym zarówno koniec aminowy, jak i karboksylowy znajdują się wewnątrz komórki. Aby zilustrować opisany powyżej protokół, 47 ortologów SEDS sklonowano do wektora pOPINE-3C-eGFP. Przesiewanie ekspresji konstruktów w małej skali przeprowadzono w dwóch szczepach E .coli : Lemo21(DE3), hodowanym w obecności 0,25 mM ramnozy w celu zablokowania nieszczelnej ekspresji, oraz C41(DE3) pLysS, które są rutynowo stosowane do ekspresji białek błonowych5-8.
Lizaty z indukowanych kultur, solubilizowane detergentem, przeanalizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Wykorzystanie fluorescencji w żelu do wizualizacji ekspresyjnych białek fuzyjnych GFP wykazało, że spośród obu szczepów wyprodukowano 38 z 47 konstruktów SEDs. Co ciekawe, zaobserwowano różnice między dwoma szczepami ekspresyjnymi. Z 38 ekspresyjnych konstruktów tylko 18 było produkowanych w obu szczepach, 14 tylko w Lemo21(DE3) i 6 tylko w C41(DE3) pLysS. Ogólnie wskaźnik sukcesu był wyższy dla Lemo21(DE3) w porównaniu do C41(DE3) pLysS (38 vs 24). Jednak obserwacja, że niektóre białka wydawały się specyficzne dla danego szczepu, oznacza, że screening w obu szczepach jest użyteczny.
Reprezentatywne dane dla 24 z 47 konstruktów SED przedstawiono na Rysunku 1. Intensywność prążków wskazuje na poziom ekspresji, np. białko fuzyjne w studzience C4 na Rysunku 1A i 1B jest dobrze eksponowane w obu szczepach, jednak dodatkowe prążki o niższej masie cząsteczkowej sugerują, że białko uległo częściowej degradacji. W wielu ścieżkach widoczny jest prążek, którego wielkość odpowiada samej GFP. Jakościową ocenę integralności białka można przeprowadzić, analizując intensywność białka fuzyjnego w stosunku do wolnej GFP; np. G4 i H4 uległy całkowitemu rozkładowi do wolnej GFP w szczepie C41(DE3) pLysS (Rysunek 1B), podczas gdy w szczepie Lemo21(DE3) występuje pewna ilość nienaruszonego białka (Rysunek 1A). W przypadku 14 z 38 ekspresowanych białek intensywność prążka wolnej GFP jest zbliżona do intensywności białka fuzyjnego, dla 21 białek intensywność prążka wolnej GFP jest większa niż białka fuzyjnego, a niewielka część białek fuzyjnych (3/38 ekspresowanych), np. F6 i G6 na Rysunku 1A, wykazuje relatywnie niewielką ilość wolnej GFP w porównaniu do białka fuzyjnego.
Dwa z konstruktów, które wykazały dobrą ekspresję w badaniu wstępnym B5 (intensywne prążki dla wolnego GFP i białek fuzyjnych) oraz G6 (mało wolnego GFP), zostały wyekspresjonowane, a z 500 ml hodowli komórkowej przygotowano całkowitą frakcję błonową. Resuspensowane błony podzielono na aliquoty i przeanalizowano za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego z detekcją fluorescencyjną (FSEC). Profile FSEC przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2A i 2B; wskazują one, że dwa białka SED zachowują się różnie w czterech testowanych detergentach. W jednym przypadku (Rysunek 2A: próbka B5) białko dawało symetryczny pik z niewielką agregacją tylko w DDM, który zatem byłby detergentem z wyboru do dalszej puryfikacji. W przeciwieństwie do tego, drugie białko fuzyjne (Rysunek 2B: próbka G6) wykazało podobny profil we wszystkich testowanych detergentach.
<img alt="Schemat procesu klonowania do FSEC: kroki obejmują PCR, test ekspresji, screening i analizę fluorescencji." src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy dla screeningu ekspresji białek błonowych w E. coli z wykorzystaniem reportera GFP.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej pokazujące rozdzielenie białek fuzyjnych GFP oraz detekcję wolnego GFP." src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wstępny skrining ekspresji białek błonowych z wykorzystaniem fluorescencji w żelu. Lizaty detergentowe komórek E. coli analizowano metodą SDS-PAGE, a żele obrazowano przy użyciu oświetlenia Blue Epi i filtra 530/28. Wyniki przedstawiono dla 24 konstruktów (oznaczonych od A4 do H6 na podstawie ich pozycji w płytce 96-dołkowej). Wskazano pozycje prążków dla wolnego GFP oraz białek fuzyjnych GFP. (A) Białka ekspresjonowane w Lemo21(DE3). (B) Białka ekspresjonowane w C41(DE3) pLysS.
<img alt="Wykres chromatografii filtracyjnej; elucja białka GFP; intensywność fluorescencji względem objętości; schemat." src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wstępne przesiewanie ekspresji białek błonowych z wykorzystaniem chromatografii wykluczania z detekcją fluorescencyjną (FSEC). Całkowite frakcje błonowe zostały wyekstrahowane w czterech różnych detergentach, a solubilizowane białka błonowe przeanalizowano metodą chromatografii wykluczania za pomocą systemu FPLC sprzężonego z detektorem fluorescencyjnym. Profile FSEC dla (A) białka błonowego B5 oraz (B) białka błonowego G6. Oznaczono pozycje pików odpowiadających zagregowanemu białku, solubilizowanemu białku fuzyjnemu z GFP oraz wolnemu GFP. Detergenty poddane badaniu są wskazane pod profilami.

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja białek błonowych eksprymowanych w SIA coli do analiz strukturalnych i funkcjonalnych. W pierwszej kolejności bakterie są zbierane, lizowane i analizowane metodą SDS-PAGE w celu wizualizacji prawidłowo sfałdowanych białek GFP za pomocą fluorescencji Ingel. W drugim kroku zwiększa się skalę produkcji szczepu E. coli, w którym stwierdzono ekspresję interesujących białek błonowych, a następnie, po indukcji ekspresji białek, przygotowuje się z komórek frakcję całkowitych błon.Na koniec całkowitą frakcję błonową solubilizuje się w czterech różnych detergentach, a monodyspersyjność białek GFP po solubilizacji analizuje się za pomocą chromatografii wykluczania. Ostatecznie białka można monitorować za pomocą fluorescencji, a uzyskane profile elucji wykreślić w celu oceny agregacji, monodyspersyjności oraz zawartości wolnego GFP w próbkach.Produkcja rekombinowanych białek błonowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na ich niską rozpuszczalność oraz niestabilność po ekstrakcji do detergentów. Doświadczenie wykazało, że screening wielu wariantów białek błonowych, takich jak ortologi z różnych gatunków, może zwiększyć skuteczność ekspresji białek błonowych. Fuzja z zielonymi białkami fluorescencyjnymi służy do raportowania prawidłowego fałdowania.Pierwszy krok w naszym protokole opartym na GFP do przesiewania ekspresji białek błonowych w e coli wykorzystuje fluorescencję w żelu lizatów detergentowych z całych komórek w celu zidentyfikowania konstruktów białek błonowych do dalszej analizy na podstawie poziomu ekspresji w przesiewie. Następnie ocenia się zachowanie wybranych białek błonowych w różnych detergentach, wykorzystując detekcję fluorescencji sprzężoną z chromatografią wykluczania rozmiarów. Dostarcza to informacji o monodyspersyjności kompleksów białko-detergent. Aby przeanalizować bakteryjną ekspresję indukowaną IPTG, należy rozpocząć od przeniesienia jednego mililitra e coli traktowanej IPTG z dubletów hodowli nocnej z bloków 24-dołkowych do bloków 96-dołkowych, zamknąć bloki, a następnie odwirować komórki przez 10 minut przy 6 000 ×g w temperaturze pokojowej.Następnie odwrócić blok, aby odlać medium, delikatnie opukując go o ręcznik papierowy w celu usunięcia pozostałej cieczy. Ponownie zamknąć płytkę i przechowywać komórki w temperaturze -80 °C po upływie co najmniej 20 minut. Rozmrozić pellety przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej całkowicie resuspendować komórki w 200 µL buforu do lizy.Komórki inkubowano z 20 µL roztworu DLPI, wytrząsając przy 1000 RPM w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie do każdej studni dodano 25 µL 10% DDM i inkubowano komórki przez kolejne 60 minut z wytrząsaniem. Po obróbce DDM blok z głębokimi studniami odwirowano, a następnie 10 µL oczyszczonego lizatu przeniesiono na płytkę mikrotitracyjną i dodano 10 µL buforu do ładowania żelu SDS-PAGE.Następnie napełnij każdą studzienkę żelu 10 µL roztworu buforu do lizy i prowadź elektroforezę przy stałym napięciu od 100 do 120 V w pomieszczeniu chłodniczym przez 2 do 2,5 godziny, aż czoło prądu dotrze do dolnej krawędzi żelu. Umieść żel w systemie obrazowania z filtrem światła niebieskiego w celu detekcji białek fuzyjnych, aby zwiększyć skalę hodowli komórkowych. Po transformacji kompetentnych komórek e coli, przenieś pojedynczą kolonię do 10 mL pożywki LB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.Następnego ranka należy rozcieńczyć 5 ml kultury nocnej w 500 ml pożywki power broth i kontynuować hodowlę z wytrząsaniem przy 250 RPM i 37 °C. Gdy wartość OD przy 595 nm wyniesie około 0,5, należy indukować ekspresję poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 1 mM, a następnie umieścić kulturę z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem na noc, tym razem w temperaturze 20 °C. Następnego ranka należy zebrać komórki poprzez wirowanie i przechowywać osady w temperaturze -80 °C.Aby przygotować błony komórkowe, resuspenduj trzecie osady w temperaturze pokojowej w 5 ml PBS na gram osadu komórkowego, zwiększając objętość w razie potrzeby, aż lepkość spadnie do konsystencji płynnej. Następnie dodaj do komórek chlorek magnezu do stężenia końcowego 1 mM, DNA do stężenia końcowego 10 µg/ml oraz jedną gotową tabletkę inhibitora proteaz na 20 g osadu komórkowego.Następnie rozbij komórki za pomocą schłodzonego homogenizatora komórkowego pod ciśnieniem 30 KPSI, a następnie odwirowuj niezniszczone komórki i resztki komórkowe przez 15 minut przy 30 000 ×g i temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do probówki do ultrawirowania i wyizoluj całkowitą frakcję błonową, wirowując nadsącz przez jedną godzinę przy 200 000 ×g i temperaturze 4 °C. Następnie użyj homogenizatora komórkowego, aby zawiesić osad błonowy w 10 ml lodowatego PBS w celu solubilizacji błon dla każdego z użytych detergentów.Przenieś 900 µL zawiesiny błonowej do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL. Następnie dodaj 100 µL każdego ze świeżo przygotowanych detergentów do odpowiednich probówek 1,5 mL i inkubuj mieszaniny w temperaturze 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu. Po godzinie odwirowuj frakcje detergentowe i rozpuszczalne za pomocą ultra wirówki stołowej, upewniając się, że probówki są wypełnione co najmniej do połowy, a następnie zachowaj nadsącz do chromatografii wykluczania z detekcją fluorescencyjną lub analizy FEC.Następnie należy przygotować kolumnę do chromatografii wykluczania o szerokim zakresie frakcjonowania, przepuszczając przez nią bufor płuczący z prędkością 0,3 ml/min. Następnie na kolumnę nanosi się 100 µl zsolubilizowanej próbki błony z tą samą prędkością przepływu, monitorując profil elucji za pomocą optyki fluorescencyjnej. Na koniec dane dotyczące objętości elucji i natężenia fluorescencji importuje się do programu arkusza kalkulacyjnego w celu prezentacji graficznej, a pozostały zsolubilizowany materiał błonowy analizuje się za pomocą fluorescencji w żelu.Jak wykazano wcześniej, wspomniana rodzina białek jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. Na tych obrazach przedstawiono reprezentacyjną wizualizację fluorescencji w żelu 24 z 47 wspomnianych konstruktów. Intensywność prążków wskazuje na poziom ekspresji.Na przykład białko fuzyjne w ścieżce cztery wykazuje wysoką ekspresję w obu szczepach. Jednak obecność dodatkowych prążków o niższej masie cząsteczkowej sugeruje, że białko uległo częściowej degradacji w wielu ścieżkach. Widoczny jest prążek, którego wielkość odpowiada samemu białku GFP.Na przykład G four i H four ulegają całkowitej degradacji do wolnego GFP w szczepie C 41 DE three P lies S. Natomiast w LEMO 21 DE three w tych wykresach występuje pewna ilość nienaruszonego białka. Analiza dwóch konstruktów, które uzyskały dobre wyniki w badaniu przesiewowym pierwotnym za pomocą fluorescencyjnej chromatografii wykluczania wielkości, pokazuje, jak białka zachowują się różnie w zależności od tego, który z czterech detergentów został przetestowany.Na przykład białko to dało jedynie symetryczny piku przy niewielkiej agregacji w Dool Multiside, co uczyniło ten detergent wyborem optymalnym do dalszej puryfikacji. W przeciwieństwie do niego, drugie białko fuzyjne wykazywało podobny profil we wszystkich testowanych detergentach. Niniejszy protokół można łatwo rozszerzyć, aby uwzględnić na przykład różne szczepy e coli hodowane w odmiennych warunkach ekspresji oraz dodatkowe detergenty zarówno w przesiewach pierwotnych, jak i wtórnych.Podsumowując, głównym celem niniejszego protokołu jest umożliwienie przesiewowej analizy ekspresji i solubilizacji w detergentach dla dużej liczby białek błonowych, aby zidentyfikować kandydatów do dalszych badań.

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie ekspresji białek błonowych opartych na Zielonym Fluorescencyjnym Białku w Escherichia coli

Źródło: Rugjee, K. N., et al. Opracowanie wysokoprzepustowego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film przedstawia badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych bakterii, które eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wrażliwego na c-di-GMP. Fluorescencję mierzy się na płytce wielodołkowej zawierającej różne badane...

Badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP z wykorzystaniem bakterii wyrażających fluorescencyjne białko reporterowe 

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Modyfikacja genów za pośrednictwem PCR może być wykorzystana do generowania fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida, co ułatwia wizualizację i ocenę ilościową komórek i białek drożdży. W niniejszym artykule przedstawiono strategię konstruowania fuzji białek fluorescencyjnych (Eno1-FP) w parapsilosie Candida.

Generowanie fuzji białek fluorescencyjnych u gatunków Candida

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Poznaj metodę przesiewową białek błonowych w Escherichia coli z wykorzystaniem fuzji GFP i chromatografii FSEC. Protokół umożliwia szybką ocenę ekspresji, stabilności i kompatybilności z detergentami.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów