Name: Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę patch-clamp do badania połączeń synaptycznych między neuronami w ostrych wycinkach mózgu. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę elektrofizjologiczną i morfologiczną mikroobwodów neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Grupy 'Funkcja Mikroukładów Neuronalnych' w Instytucie Neuronauki i Medycyny, INM-2, Centrum Badawcze Jülich oraz Grupy 'Funkcja Mikroukładów Korowych' w Departamencie Psychiatrii, Psychoterapii i Psychosomatyki, Szkoły Medycznej, JARA, Uniwersytetu RWTH Aachen za owocne dyskusje. Prace te były wspierane przez grupę badawczą DFG zajmującą się funkcją kory lufowej (BaCoFun).

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Sparowane zapisy z synaptycznie sprzężonych neuronów pobudzających i/lub hamujących są bardzo wszechstronnym podejściem do badania mikroobwodów neuronalnych. Takie podejście pozwala nie tylko oszacować łączność synaptyczną między typami neuronów, ale także pozwala określić funkcjonalne cechy połączenia i morfologię neuronów pre- i postsynaptycznych. Co więcej, agonista i/lub antagonista mogą być łatwo aplikowani na neurony w preparatach w plastrach. Pozwala to na badanie wpływu neuromodulatorów na właściwości przekaźnict...

Mikroobwody neuronalne między dwoma synaptycznie sprzężonymi neuronami są budulcem dużych sieci w mózgu i są podstawowymi jednostkami przetwarzania informacji synaptycznych. Warunkiem wstępnym do scharakteryzowania takich mikroobwodów neuronalnych jest poznanie morfologii i właściwości funkcjonalnych zarówno pre-, jak i postsynaptycznych neuronów partnerskich, rodzaju połączenia synaptycznego (połączeń) synaptycznych oraz ich struktury i mechanizmu funkcjonalnego. Jednak w wielu badaniach połączeń synaptycznych co najmniej jeden z neuronów w mikroukładzie nie jest dobrze scharakteryzowany. Wynika to ze stosunkowo mało specyficznych protokołów stymulacji, często stosowanych w badaniach nad łącznością synaptyczną. W związku z tym strukturalne i funkcjonalne właściwości neuronu presynaptycznego albo nie są zidentyfikowane wcale, albo są one ograniczone do niewielkiego stopnia (tj. ekspresja białek markerowych itp.). Sparowane zapisy w połączeniu z barwieniem wewnątrzkomórkowym za pomocą markerów, takich jak biocytyna, neurobiotyna lub barwniki fluorescencyjne, lepiej nadają się do badania małych mikroobwodów neuronalnych. Technika ta pozwala na jednoczesne badanie wielu parametrów strukturalnych i funkcjonalnych morfologicznie zidentyfikowanego połączenia synaptycznego.
Tak zwane 'unitarne' połączenia monosynaptyczne między dwoma neuronami zostały zbadane zarówno w korowych, jak i podkorowych obszarach mózgu1-10 przy użyciu preparatów do ostrych plastrów. Początkowo w eksperymentach tych używano ostrych mikroelektrod; Później zastosowano nagrywanie patch clamp w celu uzyskania nagrań sygnałów synaptycznych o niższym poziomie szumów i lepszej rozdzielczości czasowej.
Znaczącym postępem technicznym było użycie optyki IR-DIC (Differential Interference Contrasts)11-14, techniki mikroskopowej, która znacznie poprawiła widoczność i identyfikację neuronów w wycinku mózgu, dzięki czemu możliwe stało się uzyskanie nagrań z wizualnie zidentyfikowanych połączeń synaptycznych15-17. Ogólnie rzecz biorąc, nagrania w parach są wykonywane w preparatach do ostrych plastrów; Dostępnych jest tylko bardzo niewiele publikacji opisujących nagrania z neuronów połączonych synaptycznie in vivo18-20.
Najważniejszą zaletą sparowanych zapisów jest fakt, że charakterystyka funkcjonalna może być połączona z analizą morfologiczną zarówno na poziomie mikroskopu światła, jak i elektronów (patrz np.,7,16,21). Po przetworzeniu histochemicznym śledzona jest morfologia dendrytyczna i aksonalna pary neuronów połączonych synaptycznie. Następnie możliwe jest ilościowe określenie cech morfologicznych, takich jak długość, gęstość przestrzenna, orientacja, wzór rozgałęzień itp. Parametry te mogą następnie stanowić podstawę do obiektywnej klasyfikacji określonego połączenia synaptycznego. Ponadto, w przeciwieństwie do większości innych technik stosowanych do badania połączeń neuronalnych, sparowane nagrania pozwalają również na identyfikację kontaktów synaptycznych dla unitarnych połączeń synaptycznych. Można to zrobić bezpośrednio za pomocą kombinacji mikroskopii świetlnej i elektronowej16,21-27 lub za pomocą obrazowania wapniowego28,29 kolców dendrytycznych. Jednak w przypadku tego drugiego podejścia można badać tylko połączenia pobudzające, ale nie hamujące, ponieważ wymaga to napływu wapnia przez postsynaptyczne kanały receptorowe.
Oprócz szczegółowej analizy transmisji synaptycznej w zdefiniowanym mikroukładzie neuronalnym, nagrania par pozwalają również na badanie reguł plastyczności synaptycznej30,31 lub - w połączeniu z zastosowaniem agonisty/antagonisty - modulacji transmisji synaptycznej przez neuroprzekaźniki, takie jak acetylocholina32 i adenozyna33.

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>z 2 - 3 przedwzmacniaczami</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>z 2 portami kamery, obiektywem 4X i obiektywem 40X zanurzonym w wodzie</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td> kamera <td>CCD na podczerwień</td></tr><tr><td>Stacja robocza</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>z zmotoryzowanym stolikiem x-y i zmotoryzowaną osią ostrości do mikroskopu</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z manipulatory do 2 - 3 przedwzmacniaczy</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>System Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>z oprogramowaniem Neurolucida i Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Połączenie nagrań z dwóch (lub więcej) synaptycznie sprzężonych neuronów (sparowanych nagrań) w ostrych preparatach do wycinków mózgu z jednoczesnym wewnątrzkomórkowym wypełnieniem biocytyną pozwala na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zarówno neuronów pre-, jak i postsynaptycznych na podstawie ich morfologii i wzorca reakcji elektrofizjologicznej. Sparowane nagrania pozwalają na badanie wzorców połączeń między tymi neuronami, a także właściwości zarówno chemicznej, jak i elektrycznej transmisji synaptycznej. W tym miejscu podajemy krok po kroku opis procedur wymaganych do uzyskania wiarygodnych sparowanych nagrań wraz z optymalnym przywróceniem morfologii neuronu. Opiszemy, w jaki sposób pary neuronów połączone synapsami chemicznymi lub połączeniami szczelinowymi są identyfikowane w preparatach do wycinków mózgu. Opiszemy, w jaki sposób neurony są rekonstruowane w celu uzyskania ich morfologii 3D domeny dendrytycznej i aksonalnej oraz jak identyfikowane i lokalizowane są kontakty synaptyczne. Omówimy również zastrzeżenia i ograniczenia techniki nagrywania w parach, w szczególności te związane z dendrytycznymi i aksonalnymi cięciami podczas przygotowywania wycinków mózgu, ponieważ mają one silny wpływ na oszacowania połączeń. Jednak ze względu na wszechstronność podejścia opartego na sparowanym zapisie, pozostanie ono cennym narzędziem w charakteryzowaniu różnych aspektów transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych mikroobwodach neuronalnych w mózgu.

Rejestracje parowe są preferowaną metodą w celu szczegółowej charakterystyki zidentyfikowanych morfologicznie jednokierunkowych lub dwukierunkowych połączeń synaptycznych, a także połączeń elektrycznych poprzez złącza szczelinowe (Rycina 1). Przykład rejestracji parowej w warstwie 4 somatosensorycznej kory beczkowej przedstawiono na Rycynie 1A. Możliwa jest charakterystyka zarówno jednokierunkowych połączeń synaptycznych pobudzających, jak i hamujących (Rycina 1B,C). Pon...

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pokazanie, w jaki sposób połączenia synaptyczne między morfologicznie zidentyfikowanymi neuronami są scharakteryzowane zarówno funkcjonalnie, jak i strukturalnie. Osiąga się to poprzez uzyskanie ostrych wycinków mózgu, które są zoptymalizowane pod kątem badania określonego połączenia synaptycznego. Zaciskanie łat jest następnie wykorzystywane do testowania neuronów sprzężonych synaptycznie.W tym celu łata się pojedynczy potencjalny neuron postsynaptyczny, a następnie używa się drugiej pipety do stymulacji otaczających neuronów w celu ustalenia istnienia połączenia synaptycznego. Jeśli nie widać żadnej odpowiedzi, elektroda stymulująca jest przesuwana. Po znalezieniu połączenia neuron presynaptyczny jest ponownie dopasowywany w trybie hurtowym.Po zapisach elektrofizjologicznych z tych neuronów i jednoczesnym wypełnieniu biotyną, wycinek jest utrwalany, przetwarzany na biotynę i wykonywana jest wspomagana komputerowo rekonstrukcja 3D neuronów. Ostatecznie nasza metoda ma na celu skorelowaną ilościową analizę strukturalną i funkcjonalną mikroukładów neuronalnych. Główną zaletą sparowanych nagrań z neuronów sprzężonych synaptycznie jest to, że

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Charakterystyka elektrofizjologiczna i morfologiczna mikroobwodów neuronowych w ostrych skorupach mózgowych z wykorzystaniem parzystych rejestracji Patch-Clamp

Omówiono wieloaspektowe podejście do badania zmian funkcjonalnych w obwodach hipokampa. Opisano techniki elektrofizjologiczne wraz z protokołem wywoływania urazu, testami behawioralnymi oraz metodą sekcji regionalnej. Kombinację tych technik można zastosować w podobny sposób w odniesieniu do innych obszarów mózgu i innych problemów naukowych.

Badania nad zmianami w funkcjonowaniu obwodów hipokampa po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Poznaj metodę patch-clamp do badania połączeń synaptycznych między neuronami w ostrych wycinkach mózgu. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę elektrofizjologiczną i morfologiczną mikroobwodów neuronalnych.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp (Wideo) | JoVE Journal

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Przeglądaj więcej filmów