Name: Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metody oceny arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym hipokampa u myszy. Naucz się śledzenia dendrytów w czasie rzeczywistym oraz techniki rozszerzonej głębi ostrości do szybkiej wizualizacji struktur neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Fundacji LuMind, Research Down Syndrome i Alzheimer's Association (AS). CP był częściowo wspierany przez grant na rozwój wydziału z College of Nursing and Health Professions na Uniwersytecie Stanowym Arkansas.

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w Systemie Opieki Zdrowotnej dla Weteranów w Palo Alto.
1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa
<ol>
	<li>Ekstrakcja i barwienie mózgu
	<ol>
		<li>Pierwszego dnia głęboko znieczulij myszy 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny przed eutanazją przez wykrwawienie.</li>
		<li>Ostrożnie usuń kalwarię i wypreparuj mózg.
		<ol>
			<li>Najpierw usuń skórę na szczycie czaszki, umieszczając zakrzywione nożyczki na szczycie móżdżku i delikatnie przeciąć kalwarię równolegle do środkowej bruzdy z czubkiem nożyczek skierowanym na zewnątrz, przesuwając się w kierunku opuszki węchowej. Powtórz ten proces po obu stronach.</li>
			<li>Użyj szczypiec chirurgicznych, aby podnieść kalwarię, obracając ją w kierunku opuszki węchowej i odłamać. Następnie odwróć czaszkę do góry nogami i użyj kilofa, aby przeciąć nerwy wzrokowe i rozluźnić mózg. Na koniec użyj kilofa, aby oddzielić mózg od rdzenia kręgowego na poziomie otworu wielkiego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Natychmiast zanurz mózg w 15 ml dostępnego w handlu, nierozcieńczonego roztworu Golgiego-Coxa. Przechowuj mózg w roztworze Golgiego w zakorkowanej szklanej butelce o pojemności 20 ml w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Drugiego dnia powoli wylej roztwór i zastąp go 15 ml świeżego roztworu Golgiego-Coxa. Zamknij butelkę zawierającą mózgi i pozostaw w spokoju na kolejne 9 dni w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekroje i osadzanie
	<ol>
		<li>W 11 dniu umieść mózgi w 30% roztworze sacharozy, przygotowanym w ddH2O w celu odwodnienia. Po 12 godzinach zmień roztwór na świeżo przygotowaną 30% sacharozy. Inkubować mózgi w 30% roztworze sacharozy przez 3 dni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Czternastego dnia napełnij zbiornik wibratomu 30% roztworem sacharozy, aż ostrze zostanie zakryte. Ustaw prędkość na 1 mm/s przy amplitudzie 0,95 mm.</li>
		<li>Osusz mózgi Kimwichel, aby usunąć nadmiar wilgoci i usuń móżdżek za pomocą żyletki, aby przeciąć koronę.</li>
		<li>Mocno zamontuj cały mózg na platformie wibratomu za pomocą superglue i pozwól mu zastygnąć przez 2-4 minuty. Włóż platformę z przylegającym mózgiem do zbiornika i dopasuj ostrze do górnej części mózgu.</li>
		<li>Za pomocą wibratomu pokrój mózg na sekcje o grubości 150 μm w temperaturze pokojowej, pamiętając o wymianie ostrza co 3 mózg.</li>
		<li>Zebrać skrawki ze zbiornika za pomocą małej szczoteczki z końcówką i zanurzyć je w szalce Petriego zawierającej 0,3% żelatyny wyprodukowanej w ddH2O. Podczas gdy skrawki pozostają na szalce Petriego, dodaj 0,5 ml 0,3% żelatyny na każde szkiełko i użyj pędzla, aby rozprowadzić i pokryć szkiełka superfrost +.</li>
		<li>Delikatnie podnieś zanurzone sekcje z szalki Petriego i umieść je na zżelowanych szkiełkach. Zorientuj sekcje mózgu, dotykając ich tylko po bokach, a nie na wierzchołkach.</li>
		<li>Po około dziesięciu minutach pokryj skrawki 30% sacharozy, zanim tkanka całkowicie wyschnie. Następnie przygotowane preparaty należy suszyć na powietrzu w ciemnym miejscu w stojaku na slajdy przez 3 dni.</li>
		<li>Rozcieńczyć dostępny w handlu 10x roztwór do wywoływania do 1x za pomocą ddH2O. Zanurzyć szkiełka w roztworze do wywoływania na 7-10 min. Przepłukać szkiełka 3 razy w ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory etanolu 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 95% za pomocą destylowanego ddH2O.</li>
		<li>Namocz szkiełka w roztworach o coraz wyższej zawartości etanolu na 10 minut każda.</li>
		<li>Namocz szkiełka w 100% roztworze etanolu 3 razy przez 10 minut za każdym razem.</li>
		<li>Namocz szkiełka w 100% ksylenie 3 razy z rzędu po 5 minut każde, utrzymując sekcje w końcowym roztworze, aż zostaną pokryte pokrywką.</li>
		<li>Umieść dużą ilość pożywki montażowej DPX (ftalan di-n-butylu w ksylenie) (około 1-1,5 ml) na każdym szkiełku za pomocą plastikowej pipety transferowej. Ostrożnie umieść szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
		<li>Sucha pokrywa na powietrzu zsuwane sekcje mózgu poziomo przez 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie podwójnej kortyny
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić (patrz krok 1.1.1) zwierzęta.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję serca świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydem wyprodukowanym w buforze fosforanowym12.</li>
	<li>Pobrać mózgi (patrz 1.1.2) i przechowywać przez noc w 45 ml 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C na bujanym shakerze.</li>
	<li>Przenieść mózgi do 30% roztworu sacharozy i poczekać na całkowite odwodnienie przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Usunąć mózgi z sacharozy i umieścić je bezpośrednio na miedzianych blokach umieszczonych na suchym lodzie.</li>
	<li>Wypełnij blok związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zaznacz orientację mózgu, używając opuszki węchowej jako punktu orientacyjnego.</li>
	<li>Za pomocą kriostatu pociąć odcinki o grubości 70 mikronów w temperaturze -20 °C i umieścić je w roztworze krioprotektantu (25% glikolu etylenowego, 25% glicerolu, w 0,05 M buforze fosforanu sodu, pH 7,4) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotuj roztwór składający się z 50% krioprotektantu i 50% metanolu. Do tego roztworu dodać 0,5% nadtlenku wodoru (obj./obj.). Inkubować sekcje pływające przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ciepłe skrawki w temperaturze 37 ºC w TBS (soli fizjologicznej buforowanej tris) przez 30-40 minut, umieszczając je w piecu histologicznym.</li>
	<li>Inkubować skrawki z 0,3% trytonu i 3% normalnej surowicy końskiej przez 45 minut w temperaturze pokojowej przed barwieniem immunologicznym. Skrawki inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w 3 ml roztworze przeciwciała DCX rozcieńczonego w stosunku 1:500 w TBS z 0,3% trytonem i 1% normalną surowicą końską.</li>
	<li>Następnego dnia umyj sekcje 3 razy z rzędu w TBS (10 min każda).</li>
	<li>Inkubować sekcje z biotynylowanym anty-kozim kozim (1:200 w TBS) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 3 razy z rzędu w TBS (10 min każda).</li>
	<li>Inkubuj je z ABC Lite (1:1,000) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5 μl 30% H2O2 do jednej tabletki 10 mg roztworu DAB (3,3"-diaminobenzydyny) rozpuszczonego w 15 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Natychmiast inkubować skrawki w tym roztworze przez 5 minut.</li>
	<li>Zakończ reakcję, przemywając je trzykrotnie lodowatym TBS, a następnie jednokrotnie myjąc w TBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwodnić skrawki za pomocą szeregu roztworów etanolu (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min każdy), oczyścić z ksylenu, a następnie nakryć szkiełko za pomocą DPX, jak w kroku 1.3.</li>
</ol>
3. Wizualizacja
<ol>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu skrawków usuń nadmiar DPX z wierzchu szkiełek za pomocą ostrego ostrza i umieść je na stoliku skanującym mikroskopu. System składa się z mikroskopu wyposażonego w stolik skanujący, joysticka oraz kolorowej 12-bitowej kamery.</li>
	<li>Uruchom program. Otwórz nowy plik danych.</li>
	<li>Umieść punkt odniesienia na ekranie, klikając wskaźnikiem myszy w dowolnym miejscu. Spowoduje to aktywację wszystkich ikon z panelu narzędzi okna programu.</li>
	<li>Kliknij ikonę "Joystick Free" na pasku narzędzi, a następnie użyj joysticka, aby zlokalizować zakręt zębaty hipokampa w pierwszej sekcji.</li>
	<li>W zakładce "Narzędzia" w oknie programu wybierz "Menedżer sekcji szeregowej". Kliknij ikonę "Nowa sekcja" w lewym dolnym rogu okna. Spowoduje to otwarcie okna "Ustawienia sekcji szeregowej".</li>
	<li>Wybierz okno Ustawienia sekcji szeregowej, a następnie wprowadź łączną liczbę sekcji zawierających regiony hipokampa. Wybierz interwał oceny. Wprowadź grubość ciętego przekroju (70 μm dla DCX i 150 μm dla sekcji barwionych metodą Golgiego).</li>
	<li>Rozpocznij śledzenie obszaru zakrętu zębatego, klikając ikonę "Rysunek konturu odręcznego" na pasku narzędzi. Nakreśl warstwę komórek ziarnistych zębatych.</li>
	<li>Wybierz "100X" z menu "Powiększenie". Dodaj kroplę olejku immersyjnego na sekcję i przełącz obiektyw na 100X. Zlokalizuj ząbkowane ziarniste ciała komórkowe i dendryty w tym celu.</li>
	<li>Skoncentruj się na wybranym neuronie i kliknij ikonę "Śledzenie neuronów" na pasku narzędzi. Prześledź obwód korpusu komórki ziarnistej zębatki. Po zakończeniu śledzenia kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "Zakończ treść komórki".</li>
	<li>Rozpocznij ręczne śledzenie dendrytów w kierunkach x, y i z i podążaj za każdą gałęzią za pomocą joysticka i pokrętła z-motor. W węźle bifurkacji lub trifurkacji wybierz odpowiednią opcję z menu rozwijanego po kliknięciu prawym przyciskiem myszy. Prześledź każdą z gałęzi, które powstają z tych węzłów. Na końcu każdej gałęzi kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zakończenie" z menu rozwijanego.</li>
	<li>Za pomocą ikon strzałek w oknie oprogramowania losowo wybierz inną komórkę ziarnistości zębatej i postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w kroku 3.9-3.10. Zapisz całe śledzenie.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do śledzenia neuronów.</li>
	<li>Otwórz pierwszy plik danych NRX z pierwszej myszy w grupie eksperymentalnej. Dołącz plik NRX drugiej myszy z grupy eksperymentalnej. Kontynuuj, aż zostaną dołączone wszystkie pliki NRX z tej grupy.</li>
	<li>Na karcie Analiza wybierz opcję "Wentylator na schemacie". Spowoduje to otwarcie okna Wentylator w analizie. Zaznacz "dendryty" i kliknij przycisk Display, który przedstawia długości i wzory rozgałęzień dendrytów dla tej grupy myszy (Rysunek 1).</li>
</ol>
4. EDFI
UWAGA: Ta metoda umożliwia użytkownikowi szybkie rejestrowanie dużej liczby obrazów przez oś z każdego pola i generowanie obrazu 2D, który zawiera wszystkie skupione piksele na całej osi z. Wynikiem będzie obraz kompozytowy, który zawiera wszystkie zogniskowane piksele z zebranych obrazów.
<ol>
	<li>Podłącz mikroskop do aparatu cyfrowego. Umieść sekcje najpierw na stoliku skanującym podłączonym do mikroskopu, a następnie przełącz się na obiektyw 10X. Przenieś scenę do obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Uruchom program do przechwytywania wideo.</li>
	<li>Naciśnij przycisk nagrywania. Po naciśnięciu przycisku nagrywania użyj pokrętła ostrości makro, aby przesunąć się z góry na dół sekcji na łącznie 4 sekundy. Zapisz wynikowy plik wideo.</li>
	<li>Użyj darmowego oprogramowania ImageJ, aby przekonwertować pliki wideo AVI na nieskompresowany format, otwierając plik i zapisując je w nieskompresowanym formacie pliku.</li>
	<li>Uruchom program do analizy obrazu i otwórz plik AVI. Przejdź do menu "Proces" i kliknij "Rozszerzona głębia ostrości". Wybierz odpowiedni plik wideo. W opcjach "Wyjście" wybierz "Generuj obraz kompozytowy o najlepszej ostrości".</li>
	<li>W opcjach "Analiza ostrości" wybierz opcje "Znormalizowane oświetlenie" i "Maksymalny kontrast lokalny". Następnie wybierz "Utwórz". Wynikowy obraz przedstawia wszystkie skupione piksele na całej osi z (rysunek 2).</li>
	<li>Zapisz wynikowy obraz.</li>
</ol>
5. Generowanie obrazów o ekstremalnie wysokiej rozdzielczości
UWAGA: Ta metoda pozwala użytkownikowi na automatyczne generowanie obrazów o małym powiększeniu i ekstremalnie wysokiej rozdzielczości z obrazów o dużym powiększeniu i wysokiej rozdzielczości.
<ol>
	<li>Umieść skrawki najpierw na stoliku skanującym podłączonym do mikroskopu. Mikroskop jest podłączony do kamery cyfrowej. Przenieś scenę do obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Uruchom program do pozyskiwania obrazów.</li>
	<li>Użyj obiektywu 10X i rejestruj i zapisuj obrazy o wysokiej rozdzielczości (4076 x 3116) z obszaru zainteresowania, upewniając się, że pokrywają się one w co najmniej 10%.</li>
	<li>Uruchom Edytor kompozytów obrazów, aby zszyć obrazy.</li>
	<li>Przejdź do menu Plik i kliknij "Nowa panorama". Wybierz folder, w którym przechowywane są obrazy. Wybierz obrazy należące do tego samego regionu i naciśnij "ok".</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Eksportuj na dysk" i zapisz obraz. Obraz ten przedstawia obraz obszaru zainteresowania o bardzo wysokiej rozdzielczości, który można wykorzystać do analizy i/lub demonstracji (rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse%3A+center+stage+for+many+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li>
<li>Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synapses and Alzheimer’s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777(2012).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li>
<li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formoterol%2C+a+long-acting+%CE%B22+adrenergic+agonist%2C+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li>
<li>Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Nerv+Syst+Agents+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li>
<li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li>
<li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566(2011).</li>
<li>Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult%3A+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li>
<li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693(2013).</li>
<li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
</ol>

Opłaty za publikację tego artykułu są sponsorowane przez MBF Bioscience.

W tym miejscu opisano dwie metody ilościowego określenia zakresu arboryzacji dendrytycznej w dojrzałych i nowo narodzonych neuronach przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia w połączeniu z RTI i EDFI. Akwizycja obrazów neuronów o wysokiej rozdzielczości stanowi niezwykle przydatną metodę testowania szkodliwych skutków zaburzeń neurodegeneracyjnych, a co za tym idzie, zapewnia środki do oceny strategii terapeutycznych ukierunkowanych na neurony hipokampa.
Podczas gdy metoda RTI została wyko...

Dynamiczne zmiany w liczbie i strukturze synaps są cechami charakterystycznymi rozwoju, starzenia się i licznych zaburzeń neurodegeneracyjnych1-3. Zdolność neuronów do odbierania i integrowania informacji synaptycznych zależy od morfologii dendrytycznej i dynamicznych zmian w połączeniach synaptycznych. Rzeczywiście, istnieje pozytywna korelacja między kolcem dendrytycznym a liczbą synaps, które wpływają na funkcje poznawcze4. Nic więc dziwnego, że zmniejszenie liczby kolców dendrytycznych wiąże się z dysfunkcją poznawczą w wielu zaburzeniach neurologicznych5-7, co powoduje duże zainteresowanie kwantyfikacją kolców dendrytycznych. Niemniej jednak kwantyfikacja gęstości kręgosłupa pozostaje czasochłonnym i żmudnym zadaniem, które nie generuje użytecznych informacji dotyczących topografii i rozmieszczenia synaps w drzewie dendrytycznym. Na szczęście metody barwienia (np. Golgiego-Coxa i podwójnej kortyny (DCX)) w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania mogą być wykorzystane do pokonania obecnych barier i uzyskania obrazów arboryzacji dendrytycznej o wysokiej rozdzielczości w niezawodny i szybki sposób. Podczas gdy metoda barwienia Golgiego-Coxa może być stosowana do oceny stanu arboryzacji dendrytycznej we wszystkich neuronach8, DCX może być stosowana do znakowania nowo narodzonych neuronów, szczególnie w zakręcie zębatym i strefie podkomorowej9, co jest ważnym czynnikiem, biorąc pod uwagę, że neurogeneza zachodzi w obu tych regionach przez całe życie10,11.
Po barwieniu, zastosowano dwie metody obrazowania do oceny cech dendrytycznych: i) obrazowanie w czasie rzeczywistym (RTI) oraz ii) obrazowanie o rozszerzonej głębi ostrości (EDFI). Technika RTI zapewnia średnią do śledzenia i ilościowego określania długości i kolejności arboryzacji wzdłuż poszczególnych segmentów i gałęzi dendrytycznych. W ten sposób można oszacować całkowitą powierzchnię i objętość zajmowaną przez każde drzewo dendrytyczne. Mówiąc dokładniej, w metodzie RTI użytkownik w sposób ciągły identyfikuje segmenty i iteracyjnie zmienia ostrość, podczas gdy oprogramowanie do śledzenia neuronów zbiera współrzędne x, y i z struktury dendrytycznej i rekonstruuje trajektorię struktury dendrytycznej w 3D. Dla porównania, metoda EDFI zapewnia raczej prosty i przyspieszony sposób oceny gęstości dendrytycznej w dość grubych próbkach tkanek poprzez generowanie obrazu złożonego, dostarczającego informacji na temat całej osi z. W tym celu użytkownik nagrywa pliki wideo w wysokiej rozdzielczości na całej grubości przekroju, a następnie używa oprogramowania do przeszukiwania klatek wideo w celu zidentyfikowania punktów, w których piksel jest całkowicie ostry. Następnie skupione piksele są łączone i integrowane w kompozytowy obraz 2D o wysokiej rozdzielczości. Ten złożony obraz zawiera wszystkie piksele, które były ostre niezależnie od ich położenia na osi z. Analiza jakościowa i ilościowa tych obrazów 2D może być następnie wykorzystana do określenia gęstości rozgałęzień dendrytycznych w każdym polu.
Na koniec, prezentujemy panoramiczną metodę generowania obrazów o bardzo wysokiej rozdzielczości do analizy i oceny dendrytów w całym obszarze zainteresowania. Technika ta może być stosowana w celu przezwyciężenia braku dostępu do drogich aparatów cyfrowych o bardzo wysokiej rozdzielczości. Korzystając z tej metody, przechwytuje się obrazy szeregowe w różnych miejscach wzdłuż osi x i y, a następnie automatycznie łączy je ze sobą za pomocą darmowego oprogramowania (np. Image Composite Editor). Warto zauważyć, że metoda ta może być stosowana do jakościowej i ilościowej oceny arboryzacji dendrytycznej na dość szerokim obszarze.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowany roztwór do barwienia Golgiego-Coxa&nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>sklep pod adresem 4&deg; C do użycia</td></tr><tr><td>1x Roztwór do opracowywania (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>sklep pod adresem 4&deg; C do użycia</td></tr><tr><td>30% sacharozy,</td> <td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>zrobić świeże &nbsp; w ddH2O</td></tr><tr><td>0,3% żelatyna</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Stopniowane roztwory etanolu (20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medium</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) biały</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Przeciwciało</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>Numer CAS 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr> pkt.<tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>Numer CAS 77-86-1 &nbsp;</td><td>nie</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12-bitowy aparat&nbsp;</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Edytor kompozytów obrazu</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Arboryzacja dendrytyczna okazała się wiarygodnym markerem do badania strukturalnej i funkcjonalnej integralności neuronów. Rzeczywiście, złożoność i zakres arboryzacji dendrytycznej dobrze koreluje z plastycznością synaptyczną w tych komórkach. Potrzebna jest wiarygodna metoda oceny arboryzacji dendrytycznej, aby scharakteryzować szkodliwy wpływ zaburzeń neurologicznych na te struktury i określić efekty interwencji terapeutycznych. Jednak kwantyfikacja tych struktur okazała się ogromnym zadaniem, biorąc pod uwagę ich złożony i dynamiczny charakter. Na szczęście wyrafinowane techniki obrazowania można połączyć z konwencjonalnymi metodami barwienia w celu oceny stanu arboryzacji dendrytycznej, zapewniając bardziej wiarygodny i szybszy sposób oceny. Poniżej znajduje się przykład, w jaki sposób te techniki obrazowania zostały połączone z metodami barwienia w celu scharakteryzowania arboryzacji dendrytycznej u myszy typu dzikiego. Te uzupełniające się metody obrazowania można wykorzystać do jakościowej i ilościowej oceny arboryzacji dendrytycznej, która obejmuje dość szeroki obszar w regionie hipokampa.

Zakres arboryzacji istniejących i nowo powstałych komórek ziarnistych zakrętu zębatego analizowano u myszy typu dzikiego, stosując barwienie Golgi-Cox lub DCX (Rysunek 1). Ustalono, że segmenty dendrytów komórek DCX-dodatnich mają długość od 13 do 36 mikronów. Rozkład normalny długości dendrytów sprawdzono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa (D = 0.1217, p &lt;0.01, p Lilieforsa &lt;0.001; Rysunki 4 i 5).
W analizie długości segmentów w zależ...

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie zakresu arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modelu mysiego. Zostanie to osiągnięte za pomocą dwóch różnych metod. W pierwszej metodzie dendryty są śledzone ręcznie w czasie rzeczywistym przez całą grubość każdego przekroju.Po prześledzeniu można zrekonstruować i przeanalizować całe drzewo dendrytyczne. Analiza różnych diagramów wachlarzowych pochodzących od różnych myszy może służyć jako obiektywny środek porównania. Drugą metodą jest wizualizacja arboryzacji dendrytycznej za pomocą obrazowania z rozszerzoną głębią ostrości.Na koniec zastosowano metodę panoramiczną w celu zszycia wielu obrazów o dużym powiększeniu, aby uzyskać jeden kompozytowy obraz o wysokiej rozdzielczości do jakościowej i ilościowej oceny dendrytów w całym obszarze zainteresowania. Prezentacja tej procedury zostanie przeprowadzona przez GI mobi. AMI research flows z mojego laboratorium. Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami jest łatwość użycia oraz szybkość akwizycji i gromadzenia danych.Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, takie jak ocena dendrytyzacji w objętych procesem obszarach mózgu oraz ewaluacja wpływu różnych terapii na dendryty. W tej procedurze, jeden dzień po utrwaleniu mózgu myszy w 4% paraformaldehydzie, należy umieścić go w roztworze sacharozy w celu odwodnienia na 48 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie należy wyjąć mózgi z sacharozy i umieścić je bezpośrednio na blokach miedzianych ustawionych na suchym lodzie.Wypełnij bloczek OCT i zaznacz orientację mózgu, wykorzystując opuszki węchowe jako punkt orientacyjny. Za pomocą kriostatu wytnij przekroje o grubości 70 µm w temperaturze -20 °C, a następnie umieść je w roztworze krioprotekcyjnym i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Inkubuj przekroje w nadtlenku wodoru w metanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ogrzewaj je w temperaturze 37 °C w buforze TBS przez pół godziny.Przed barwieniem przeciwciałem DCX w dniu następnym, inkubować skrawki w 0,3% Tritonie i normalnej surowicy konia przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć skrawki trzykrotnie w TBS, a następnie inkubować je z biotynilowanym przeciwciałem wtórnym konia przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć skrawki trzykrotnie w TBS przez 10 minut w każdym cyklu i inkubować je z kompleksem streptawidyna-peroksydaza (ABC) przez 1,5 godziny.W temperaturze pokojowej dodać nadtlenek wodoru do roztworu DAB, a następnie natychmiast inkubować skrawki w tym roztworze przez pięć minut i przerwać reakcję, płucząc je trzykrotnie lodowatym buforem TBS, a następnie raz w TT BS w temperaturze pokojowej. Odwodnić skrawki, stosując serię roztworów etanolu.Po pięć minut w każdym z roztworów: klarowniku i ksylenie, a następnie przykrycie szkiełkiem podstawowym przy użyciu DPX. Po całkowitym wyschnięciu preparatów należy usunąć nadmiar DPX z powierzchni szkiełek za pomocą ostrego ostrza i umieszczać je pojedynczo na stoliku skanującym mikroskopu. System wizualizacyjny składa się z mikroskopu wyposażonego w joystick stolika skanującego oraz 12-bitową kamerę kolorową.Następnie uruchom program neuro lucita i otwórz nowy plik danych. Umieść punkt odniesienia na ekranie, klikając w dowolnym miejscu wskaźnikiem myszy, aby aktywować wszystkie ikony z panelu narzędzi okna programu. Następnie kliknij ikonę joystick free na pasku narzędzi i użyj joysticka, aby zlokalizować zakręt zębaty hipokampa.W pierwszej sekcji karty narzędzi w oknie programu wybierz manager sekcji seryjnych (serial section manager). Kliknij ikonę nowej sekcji w dolnym lewym rogu okna, aby otworzyć okno konfiguracji sekcji seryjnych. Następnie w oknie konfiguracji sekcji seryjnych wprowadź całkowitą liczbę sekcji zawierających obszary hipokampa.Następnie należy wybrać przedział oceny i wprowadzić grubość przekroju. Rozpocznij obrysowywanie obszaru zakrętu zębatego, klikając ikonę rysowania konturu ręcznego na pasku narzędzi. Następnie obrysuj warstwę komórek ziarnistych zakrętu zębatego.Wybierz powiększenie 100 x z menu powiększenia. Następnie nanieś kroplę olejku imersyjnego na skrawek i przełącz obiektyw na 100 x. Zlokalizuj ciała komórek ziarnistych zębatej warstwy oraz ich dendryty przy użyciu tego obiektywu.Następnie należy skupić się na wybranym neuronie i kliknąć ikonę śledzenia neuronu. Za pomocą paska narzędzi należy obrysować obwód ciała komórki ziarnistej zakrętu zębatego. Po zakończeniu obrysowywania należy kliknąć prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję zakończenia obrysowywania ciała komórki.Następnie rozpocznij ręczne śledzenie dendrytów w kierunkach X, Y i Z, podążając za każdą gałęzią za pomocą dżojstika i pokrętła silnika Z. W węźle bifurkacji lub trifurkacji wybierz odpowiednią opcję. Z menu rozwijanego śledź każdą z gałęzi wychodzących z tych węzłów. Na końcu każdej gałęzi kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję zakończenia z menu rozwijanego.Używając ikon klawiszy strzałek w oknie oprogramowania, należy losowo wybrać inną komórkę ziarnistą hipokampa i powtórzyć procedurę śledzenia, która została właśnie zaprezentowana. Następnie należy zapisać cały przebieg śledzenia.Następnie uruchom program NeuroLucita Explorer w celu analizy neuronów. Otwórz pierwszy plik danych NRX pochodzący od pierwszej myszy z grupy eksperymentalnej. Dołącz plik NRX drugiej myszy z grupy eksperymentalnej i kontynuuj tę czynność, aż wszystkie pliki NRX z tej grupy zostaną dołączone.W karcie analizy wybierz fan in diagram, aby otworzyć okno fan in analysis, zaznacz dendrites i kliknij display, aby wyświetlić połączenia i wzorce rozgałęzień dendrytów dla tej grupy myszy. W tej procedurze podłącz mikroskop do kamery cyfrowej. Umieść przekrój na stole skanującym podłączonym do mikroskopu i przełącz na obiektyw 10 x.Następnie przesuń stolik do obszaru zainteresowania. Uruchom program do przechwytywania wideo i naciśnij przycisk nagrywania. Natychmiast po naciśnięciu przycisku nagrywania, użyj pokrętła ostrości makro, aby przesunąć się od góry do dołu przekroju w czasie czterech sekund. Przed zapisaniem otrzymanego pliku wideo, użyj darmowego oprogramowania Image J, aby przekonwertować pliki wideo AVI do formatu nieskompresowanego.Uruchom program do analizy obrazu i otwórz plik VI. Przejdź do menu procesów i kliknij opcję zwiększona głębia ostrości (extended depth of field). W opcjach wyjściowych wybierz odpowiedni plik wideo.W opcjach analizy ostrości wybierz funkcję generate composite best focus image. Zaznacz opcje normalized illumination oraz max local contrast. Następnie kliknij create, aby wygenerować obraz wynikowy, który reprezentuje wszystkie piksele w ostrości wzdłuż osi Z.Następnie zapisz otrzymany obraz. W tym kroku umieść przekrój na stoliku skanującym podłączonym do mikroskopu. Przesuń stolik do obszaru zainteresowania.Następnie uruchom program do akwizycji obrazów, korzystając z obiektywu 10 x, a następnie wykonaj i zapisz obrazy o wysokiej rozdzielczości z obszaru zainteresowania, dbając o to, aby obrazy nachodziły na siebie w co najmniej 10%. Następnie użyj programu Image Composite Editor, aby zszyć obrazy. Przejdź do menu Plik i kliknij Nowa panorama.Wybierz folder, w którym przechowywane są obrazy. Następnie zaznacz obrazy należące do tego samego obszaru i kliknij OK. Naciśnij przycisk eksportu do dysku i zapisz obraz.Ten obraz przedstawia zdjęcie obszaru zainteresowania w niezwykle wysokiej rozdzielczości, które może zostać wykorzystane do analizy. Rysunek ten pokazuje wizualizację arboryzacji dendrytycznej z zastosowaniem i bez zastosowania metod EDFI. Tradycyjną metodę wyznaczania optymalnej płaszczyzny ostrości porównano z metodą EDFI, co wykazało znacząco wyższe wartości powierzchni dendrytycznej.Zastosowano metodę EDFI. Przedstawiono tutaj ilościowe określenie długości oraz objętości zajmowanej przez dendryty o różnych rzędach rozgałęzień. Maksymalna długość i objętość zostały osiągnięte w rzędzie pierwszym.Poniżej znajduje się histogram długości dendrytów komórek ziarnistych zakrętu zębatego. Większość segmentów dendrytycznych DDR barwionych DCX miała długość od 13 do 26. Ta czerwona przerywana linia przedstawia rozkład normalny danych uzyskanych po zastosowaniu tej procedury.Do odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące objętości i powierzchni zajmowanej przez dendryty można wykorzystać inne klasyczne metody, takie jak neuro Lucid. Technika, którą tutaj zaprezentowaliśmy, w ogromnym stopniu pomoże badaczom w dziedzinie neurobiologii nie tylko w ocenie struktur neuronalnych, ale także w ocenie niewielkich struktur nieneuronalnych, takich jak mikroglej, w grubych przekrojach mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ocenić zakres projekcji neuronalnych w stosunkowo krótkim czasie.

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena rozgałęziania się dendrytów w zakręcie zębatym regionu hipokampalnego u myszy

W tym nagranym protokole zaprezentowano technikę sekcji służącą do usunięcia zakrętu zębatego u dorosłej myszy przy użyciu stereomikroskopu.

Disekcja zakrętu zębatego hipokampa dorosłej myszy

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Poznaj metody oceny arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym hipokampa u myszy. Naucz się śledzenia dendrytów w czasie rzeczywistym oraz techniki rozszerzonej głębi ostrości do szybkiej wizualizacji struktur neuronalnych.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Przeglądaj więcej filmów