Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie zakresu arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modelu mysiego. Osiąga się to za pomocą dwóch różnych metod. W pierwszej metodzie dendryty są śledzone ręcznie w czasie rzeczywistym na całej grubości każdej sekcji.

Po prześledzeniu można zrekonstruować i przeanalizować całe drzewo dendrytyczne. Korzystając z diagramu wentylatora, analiza różnych diagramów wentylatorów pochodzących z różnych myszy może być wykorzystana jako obiektywny środek porównania. Drugą metodą jest wizualizacja arboryzacji dendrytycznej z obrazowaniem o rozszerzonej głębi ostrości.

Wreszcie, metoda panoramiczna jest stosowana do łączenia wielu obrazów o dużym powiększeniu, aby uzyskać jeden złożony obraz o wysokiej rozdzielczości do jakościowej i ilościowej oceny dendrytów w całym obszarze zainteresowania. Badania AMI pochodzą z mojego laboratorium. Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metalami jest łatwość użycia oraz szybkość akwizycji i zbierania danych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, takie jak ocena dendrytyzmu w dotkniętych obszarach mózgu oraz ocena wpływu różnych terapii na dendryty. W tej procedurze, dzień po utrwaleniu mózgu myszy w 4% aldehydzie Paraform, umieść go w roztworze sacharozy w celu odwodnienia na 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń mózgi z sacharozy i umieść je bezpośrednio na miedzianych blokach umieszczonych na suchym lodzie.

Wypełnij blok OCT i zaznacz orientację mózgu, używając opuszki węchowej jako punktu orientacyjnego. Pokrój odcinki o grubości 70 mikronów w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza za pomocą kriostatu i umieść je w roztworze krioprotektantu i utrzymuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu użycia. Inkubować skrawki w nadtlenku wodoru w metanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie podgrzewać je w 37 stopniach Celsjusza w TBS przez pół godziny.

Inkubować skrawki z 0,3% Tritonem i normalną surowicą końską przez 45 minut w temperaturze pokojowej przed barwieniem przeciwciałem DCX następnego dnia. Umyj skrawki trzy razy z rzędu w TBS i inkubuj je z biotynylowanym antygo dla konia przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Umyj skrawki trzy razy z rzędu w TBS przez 10 minut każda i inkubuj je w świetle B, C przez 1,5 godziny.

W temperaturze pokojowej dodać nadtlenek wodoru do roztworu DAB i natychmiast inkubować skrawki w tym roztworze przez pięć minut i zakończyć reakcję, przemłukując je trzykrotnie lodowatym TBS, a następnie jednym roztworem. Prać w TT BS w temperaturze pokojowej. Odwodnić sekcje za pomocą szeregu roztworów etanolu.

Pięć minut każdy, przezroczysty i ksylenowy, a następnie szkiełko nakrywkowe za pomocą DPX. Po całkowitym wyschnięciu skrawków należy usunąć nadmiar DPX z powierzchni szkiełek ostrym ostrzem i umieszczać je pojedynczo na stoliku skanującym mikroskopu. System wizualizacji składa się z mikroskopu wyposażonego w joystick stolika skanującego oraz 12-bitowej kamery kolorowej.

Następnie uruchom program neuro lucita i otwórz nowy plik danych. Umieść punkt odniesienia na ekranie, klikając w dowolnym miejscu wskaźnikiem myszy, aby aktywować wszystkie ikony z panelu narzędzi okna programu. Następnie kliknij ikonę wolnego joysticka na pasku narzędzi i użyj joysticka, aby zlokalizować zakręt zębaty hipokampa.

W pierwszej sekcji na karcie narzędzia w oknie programu wybierz menedżera sekcji szeregowych. Kliknij ikonę nowej sekcji w lewym dolnym rogu okna, aby otworzyć okno ustawień sekcji szeregowej. Następnie wybierz okno ustawień sekcji szeregowej i wprowadź całkowitą liczbę sekcji zawierających regiony hipokampa.

Następnie wybierz przedział oceny i wprowadź grubość przekroju. Rozpocznij śledzenie obszaru zakrętu zębatego, klikając ikonę rysunku konturowego wolnej ręki na pasku narzędzi. Następnie obrysuj warstwę komórek ziarnistych zębatych.

Wybierz 100 x z menu powiększenia. Następnie dodaj kroplę olejku immersyjnego na sekcję i zmień obiektyw na 100 x. Zlokalizuj ząbkowane ziarniste ciała komórkowe i dendryty w tym celu.

Następnie skup się na wybranym neuronie i kliknij ikonę śledzenia neuronów. Na pasku narzędzi obrysuj obwód korpusu komórki ziarnistości zębatej. Po zakończeniu śledzenia kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Zakończ treść komórki.

Teraz zacznij ręcznie śledzić dendryty oraz kierunki X, Y i Z, a następnie podążaj za każdą gałęzią za pomocą joysticka i pokrętła silnika Z W węźle bifurkacji lub trifurkacji wybierz odpowiednią opcję. Z menu rozwijanego prześledź każdą z gałęzi, które powstają z tych węzłów na końcu każdej gałęzi. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz zakończenie z menu rozwijanego.

Za pomocą ikon strzałek w oknie oprogramowania. Losowo wybierz inną komórkę ziarnistości zębatej i powtórz procedurę śledzenia, jak pokazano poniżej. Zapisz całe śledzenie.

Teraz uruchom eksploratora neuro lucita do analizy neuronów. Otwórz pierwszy plik danych NRX z pierwszej myszy w grupie eksperymentalnej. Dołącz plik NRX drugiej myszy grupy eksperymentalnej i kontynuuj, aż wszystkie pliki NRX z tej grupy zostaną dołączone.

Na karcie analizy wybierz wentylator na schemacie, aby otworzyć okno wentylatora w analizie, zaznacz dendryty i kliknij wyświetl, aby wyświetlić linki i wzory rozgałęzień dendrytów dla tej grupy myszy. W tej procedurze podłącz mikroskop do kamery cyfrowej. Umieść sekcję na stoliku skanującym podłączonym do mikroskopu i przełącz się na obiektyw 10x.

Następnie przenieś scenę do obszaru zainteresowania. Uruchom program do przechwytywania wideo i naciśnij przycisk nagrywania. Jak tylko przycisk nagrywania zostanie naciśnięty, użyj pokrętła ostrości makro, aby przesunąć się od góry do dołu sekcji przez łącznie cztery sekundy Przed zapisaniem wynikowego pliku wideo użyj teraz darmowego oprogramowania Image J, aby przekonwertować pliki wideo a VI na nieskompresowany format.

Uruchom program do analizy obrazu i otwórz plik a VI. Przejdź do menu procesu i kliknij rozszerzoną głębię ostrości. Wybierz odpowiedni plik wideo w opcjach wyjściowych.

Wybierz opcję Wygeneruj kompozytowy obraz o najlepszej ostrości w opcjach analizy ostrości. Wybierz opcje znormalizowanego oświetlenia i maksymalnego kontrastu lokalnego. Następnie kliknij przycisk Utwórz, aby wygenerować wynikowy obraz, który reprezentuje wszystkie skupione piksele na całej osi Z.

Następnie zapisz wynikowy obraz. W tym kroku umieść sekcję na stoliku skanującym podłączonym do mikroskopu. Przenieś scenę do obszaru zainteresowania.

Następnie uruchom program do akwizycji obrazu za pomocą obiektywu 10x, pobierz i zapisz obrazy w wysokiej rozdzielczości z obszaru zainteresowania, upewniając się, że obrazy nakładają się na siebie w co najmniej 10%. Następnie uruchom edytor kompozycji obrazów, aby następnie zszyć obrazy. Przejdź do menu plików i kliknij nową panoramę.

Wybierz folder, w którym przechowywane są obrazy. Następnie wybierz obrazy należące do tego samego regionu i naciśnij OK. Naciśnij przycisk eksportu na dysk i zapisz obraz.

Ten obraz przedstawia obraz obszaru zainteresowania o bardzo wysokiej rozdzielczości, który można wykorzystać do analizy. Rysunek ten przedstawia wizualizację arboryzacji dendrytycznej z metodami EDFI i bez nich. Tradycyjna metoda znajdowania najlepszej płaszczyzny ostrości została porównana z EDFI i znacznie wyższymi wartościami powierzchni dendrytycznej.

Znaleziono metodę EDFI. Przedstawiono tutaj kwantyfikację długości i objętości zajmowanej przez dendryty w różnych kolejnościach rozgałęzień. Maksymalna długość i objętość zostały osiągnięte w zamówieniu pierwszym.

Oto histogram długości dendrytycznej komórek ziarnistości zębatej. Większość segmentów dendrytycznych barwników DCX DDR miała długość od 13 do 26 lat. Ta czerwona przerywana linia przedstawia rozkład normalny danych przedstawionych zgodnie z tą procedurą.

Inne klasyczne metody, takie jak neuro Lucid, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące objętości i obszaru zajmowanego przez dendryty. Ta technika, którą tutaj pokazaliśmy, ogromnie pomoże naukowcom w dziedzinie neurobiologii nie tylko ocenić strukturę neuronalną, ale także ocenić małe struktury nieneuronalne, takie jak mikroglej w grubych sekcjach mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić zakres projekcji neuronalnych w stosunkowo krótkim czasie.