Name: Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność przez pojedyncze muchy brudne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj metodę PCR do wykrywania patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność z pojedynczych much brudnych. Technika ta umożliwia szybkie izolowanie Cronobacter spp., Salmonella enterica i Listeria monocytogenes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podziękowania dla Bena D. Talla, Yi Chena i Thomasa Hammaka z Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) za krytyczną recenzję manuskryptu. Autorzy dziękują również Hannah Lee (program staży badawczych, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) za pomoc laboratoryjną oraz Davidowi Weingaertnerowi (FDA, CFSAN) za przygotowanie rysunku schematycznego przeglądu pokazanego na filmie.

1. Kolekcja much
<ol>
	<li>Zbieraj pojedyncze muchy za pomocą sterylnych entomologicznych siatek do zamiatania. Umieść siatki w lodówce i przenieś je do laboratorium.</li>
</ol>
2. Sekcja much
<ol>
	<li>Unieruchomić aseptyczne muchy, umieszczając je w temperaturze -20 °C na 5 - 7 minut.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść jedną muchę w sterylnej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) buforowanej wody peptonowej (BPW). Delikatnie mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 2 minuty. Istotne jest, aby całe ciało muchy miało kontakt z podłożem, tak aby mikrobiota obecna na powierzchni ciała (S) muchy została przeniesiona do BPW (BPW-S). Oznacz rurkę numerem i częścią ciała muchy (np. 1S). 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Specyficznych Odczynników/Sprzętu, aby uzyskać szczegółowy opis materiałów i odczynników wymienionych w niniejszym protokole.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy usuń muchę z podłoża BPW-S i przenieś ją do pustej i czystej probówki o pojemności 2 ml w celu dezynfekcji muchy na powierzchni. Inkubować probówkę zawierającą pożywkę BPW-S w temperaturze 37 °C, wykonując protokół dezynfekcji i preparacji.
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj powierzchnię muchy, zanurzając ją w 1 ml 70% etanolu na 1 minutę, a następnie spłucz sterylną wodą destylowaną przed zanurzeniem jej w 1 ml świeżo przygotowanego 0,05% (v/v) roztworu wybielacza. Spłucz 3 razy sterylną wodą destylowaną. Przenieść wodę z ostatniego płukania do autoklawowanej probówki o pojemności 2 ml. 
		UWAGA: Płyn należy wylać za każdym razem, używając mikropipety o pojemności 1 000 μl lub odwracając probówkę, upewniając się, że mucha pozostała wewnątrz probówki. Delikatnie wymieszać przez odwrócenie na każdym etapie procesu dezynfekcji powierzchni.</li>
		<li>Aby ocenić skuteczność procesu dezynfekcji, przenieś 100 μl wody z ostatniego płukania na płytkę z agarem sojowym z tryptykazą (TSA) i rozprowadź za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Po inkubacji zarejestruj obecność kolonii bakterii. 
		UWAGA: Obecność kolonii bakteryjnych na płytkach TSA wskazuje na nieefektywny proces dezynfekcji powierzchni. Jeśli tak się stanie, obecność patogenów przenoszonych przez żywność należy zgłaszać tylko na powierzchni ciała muchy, ponieważ nie można wykluczyć zanieczyszczenia krzyżowego między powierzchnią ciała a przewodem pokarmowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zdezynfekowaniu powierzchni muchy przenieś ją na kawałek autoklawowanego ręcznika papierowego w celu usunięcia nadmiaru wody, a następnie na sterylną jednorazową szalkę Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego pod lunetą sekcyjną i zidentyfikuj muchę do poziomu gatunku za pomocą kluczy dychotomicznych dla rodzin muchówek20,21.</li>
	<li>Za pomocą autoklawowanych kleszczyków z cienką końcówką delikatnie wyciągnij odbyt i cały przewód pokarmowy (A) z muchy i aseptycznie przenieś je do innej sterylnej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) BPW z 0,5 mm kulkami cyrkonu/krzemionki (BPW-A). Oznacz rurkę tym samym numerem, który został wybrany dla pojedynczej muchy i części ciała muchy (np. 1A).</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj probówkę zawierającą BPW-A przez 5 - 10 minut za pomocą zakłócacza komórek. Inkubować w temperaturze 36 ± 1 °C, wykonując pozostałą część protokołu.</li>
	<li>Aby zakwitować i/lub przechować próbkę przez długi czas, umieść pozostałą część muchy w czystej probówce o pojemności 2 ml i dodaj 1-2 ml 95% etanolu.</li>
</ol>
3. Wzbogacenie pierwotne i wtórne
<ol>
	<li>Oznaczyć wszystkie pierwotne i wtórne probówki wzbogacające zawierające pożywkę zgodnie z numerem próbki i częścią ciała muchy.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem przenieś 300 μl BPW-S (powierzchnia) do sterylnych probówek o pojemności 2 ml zawierających następujące media:
	<ol>
		<li>W przypadku Salmonelli użyj 1 ml wstępnie podgrzanego (42 °C) BPW. Inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 42,5 °C przez 22 - 24 godziny. W celu wtórnego wzbogacenia przenieś 100 μl wzbogaconego BPW do 400 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) bulionu do infuzji serca mózgu (BHI) umieszczonego wcześniej w sterylnych probówkach zbiorczych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>W przypadku Cronobacter należy użyć 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) BPW z nowobiocyną (10 mg/l; Wallace, M., komunikacja osobista). Alternatywnie, użyj 1 ml bulionu wzbogacającego R & F Enterobacter sakazakii z suplementem (wankomycyną i cefsulodyną) jako pierwotne wzbogacenie. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 22 - 26 godzin. W celu wtórnego wzbogacenia przenieść 100 μl wzbogaconego BPW z nowobiocyną do 400 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) bulionu BHI umieszczonego uprzednio w sterylnych probówkach zbiorczych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>W przypadku L. monocytogenes należy użyć 1 ml świeżo przygotowanego bulionu wzbogacającego RT 24 Listeria (24 LEB) z selektywnym suplementem. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 44 ± 5 godzin. Do wykrycia L. monocytogenes nie jest wymagane wtórne wzbogacanie.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.3 powyżej, używając rurki oznaczonej jako BPW-A.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie systemu opartego na PCR do amplifikacji i wykrywania docelowego patogenu przenoszonego przez żywność
Kroki 4-8 używają komercyjnego systemu cyklera/detektora PCR, komputerowej stacji roboczej i gotowych do użycia zestawów do badań przesiewowych na obecność Salmonelli (standardowy zestaw testowy Salmonella 2), Cronobacter (standardowy zestaw testowy E. sakazakii) i Listeria monocytogenes (zestaw testowy L. monocytogenes 24E). Standardowe testy wykorzystują wykrywanie punktu końcowego PCR. Każdy zestaw zawiera tabletki gotowe do PCR z interkalacyjnym barwnikiem, który emituje sygnał fluorescencyjny podczas wiązania się z dwuniciowym DNA. Sygnał jest przechwytywany podczas fazy wykrywania programu systemu PCR, generując krzywą topnienia, która jest interpretowana przez oprogramowanie jako dodatnia lub ujemna.
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki i sprzęt zgodnie z protokołem producenta dla każdego docelowego patogenu przenoszonego przez żywność. 
	UWAGA: Protokoły wykrywania Salmonelli i Cronobacter wymagają jednoetapowej procedury lizy, podczas gdy protokół wykrywania L. monocytogenes wymaga dwuetapowej procedury lizy (patrz odpowiednio punkty 5 i 6).</li>
	<li>Włącz automatyczny blok grzewczy, wybierając konkretny program dla docelowego patogenu. Alternatywnie, jeśli bloki grzewcze są ręczne, należy ustawić temperaturę na 37 °C (dla Salmonelli, Cronobacter spp. i L. monocytogenes) lub na 55 ± 2 °C (dla L. monocytogenes część 2 lizy – patrz krok 6.2) i 95 ± 3 °C.</li>
	<li>Upewnij się, że bloki chłodzące zostały schłodzone O/N, w przeciwnym razie schładzaj je w temperaturze 2 - 8 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania komputerowego systemu wykrywania opartego na PCR, utwórz plik stojaka zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oznacz i ułóż probówki zbiorcze zawierające odczynnik do lizy w stojaku, zgodnie z plikiem stojaka.</li>
	<li>Zainicjuj przyrząd systemu wykrywania opartego na PCR.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie analizy w celu wykrycia salmonelli i Cronobacter
<ol>
	<li>Przygotować odczynnik do lizy, dodając 150 μl proteazy do jednej 12 ml butelki buforu do lizy.</li>
	<li>Przenieść 200 μl odczynnika do lizy do każdej z uprzednio oznakowanych probówek zbiorczych. 
	UWAGA: Probówki zbiorcze zawierające odczynnik do lizy można przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	<li>Za pomocą długich końcówek pipet przenieść 20 μl wtórnie wzbogaconych próbek (patrz kroki 3.2.1 i 3.2.2) do odpowiednich probówek zbiorczych zawierających 200 μl odczynnika do lizy. Do każdej próbki należy używać nowych końcówek do pipet. 
	UWAGA: Probówki z pierwotnym i wtórnym wzbogacaniem należy przechowywać w lodówce (Salmonella) lub w temperaturze pokojowej (Cronobacter) w celu dalszej analizy potwierdzającej próbki dodatnie/ujemne PCR.</li>
	<li>Przygotować kontrole ujemne, dodając 20 μl sterylnych pożywek BHI do probówek zbiorczych zawierających 200 μl odczynnika do lizy.</li>
	<li>Przygotować kontrole dodatnie, dodając 20 μl kultur bakterii O/N (hodowanych w BHI) dowolnego znanego szczepu Salmonelli lub Cronobacter do probówek zbiorczych zawierających 200 μl odczynnika do lizy.</li>
	<li>Zakryj rurki zbiorcze i mocno dokręć za pomocą narzędzia do zamykania.</li>
	<li>Umieść stojak z probówkami klastrowymi w automatycznym bloku grzewczym po wybraniu konkretnego programu dla docelowego patogenu. Alternatywnie, inkubować probówki zbiorcze w temperaturze 37 ± 2 °C przez 20 minut, a następnie inkubować w temperaturze 95 ± 3 °C przez 10 minut. Na koniec przenieś probówki klastrowe do bloków chłodzących (2 - 8 °C) przez 5 min. 
	UWAGA: Probówki zbiorcze zawierające lizat można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni.</li>
</ol>
6. Przeprowadzanie lizy w celu wykrycia L. monocytogenes
<ol>
	<li>Wykonaj pierwszą część lizy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać 1,8 ml sterylnej wody dejonizowanej do butelki całkowicie rozmrożonego środka lizującego 1, 
		UWAGA: Środek lizujący 1 należy przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C do momentu przygotowania do użycia. Po otwarciu i rozcieńczeniu przechowywać w temperaturze pokojowej (20 - 30 °C) przez okres do 6 miesięcy.</li>
		<li>Połączyć czynniki lizujące 1 i 2 w stosunku 4:1 (40 μl rozcieńczonego czynnika lizującego 1 i 10 μl czynnika lizującego 2 na każdą próbkę). Przenieść 50 μl połączonych czynników lizujących do probówek zbiorczych. Mieszaninę zużyć w ciągu 4 godzin.</li>
		<li>Dodać 500 μl pierwotnie wzbogaconej próbki (patrz krok 3.2.3) do probówki zbiorczej zawierającej 50 μl połączonych czynników lizujących.</li>
		<li>Przygotować kontrolę ujemną, dodając 500 μl sterylnego 24 LEB do 50 μl połączonych czynników lizujących.</li>
		<li>Przygotować kontrolę pozytywną, dodając 500 μl kultury O/N L. monocytogenes wyhodowanej w 24 LEB do 50 μl połączonych czynników lizujących.</li>
		<li>Zakryj probówki zbiorcze, delikatnie wymieszaj i umieść w bloku grzewczym w temperaturze 37 ± 1 °C na 30 min. 
		UWAGA: Probówki należy przechowywać w lodówce w celu dalszej analizy potwierdzającej próbki dodatnie/ujemne PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj część 2 lizy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przygotować odczynnik do lizy zgodnie z instrukcjami w krokach 5.1 i 5.2.</li>
		<li>Za pomocą długich końcówek pipet przenieść 20 μl pierwszej części lizatu do probówek zbiorczych zawierających 200 μl odczynnika do lizy. Do każdej próbki należy używać nowych końcówek do pipet.</li>
		<li>Zakryj rurki zbiorcze i mocno dokręć za pomocą narzędzia do zamykania.</li>
		<li>Umieść probówki zbiorcze w automatycznym bloku grzewczym, wybierając konkretny program dla L. monocytogenes. Alternatywnie, inkubować probówki zbiorcze w temperaturze 55 ± 2 °C przez 30 minut, a następnie inkubować w temperaturze 95 ± 3 °C przez 10 minut. Na koniec przenieś probówki klastrowe do bloków chłodzących (2 - 8 °C) przez 5 min. 
		UWAGA: Probówki zbiorcze zawierające lizat można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Nawilżające tabletki gotowe do PCR
<ol>
	<li>Wybierz schłodzony (4 °C) blok chłodzący PCR i umieść stojak na probówki do PCR na wkładce.</li>
	<li>Umieść odpowiednie probówki PCR zawierające tabletki gotowe do PCR (dołączone do każdego zestawu) dla docelowego patogenu przenoszonego przez żywność w uchwycie, zgodnie z plikiem na stojaku.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do zdejmowania ostrożnie zdejmij nakrętki z probówek PCR. Wyrzucić nakrętki i sprawdzić, czy każda probówka zawiera tabletkę.</li>
	<li>Przenieść 50 μl (w przypadku Salmonelli i Cronobacter) lub 30 μl (w przypadku L. monocytogenes) lizatu do określonych probówek PCR. Użyj nowych nasadek optycznych i mocno przymocuj do probówek PCR za pomocą narzędzia do zamykania. 
	UWAGA: Po dodaniu lizatu do tabletek gotowych do PCR, próbki muszą pozostać schłodzone w temperaturze 2 - 8 °C do momentu wprowadzenia do systemu wykrywania opartego na PCR. Probówki do PCR można odwirowywać przy 2,500 x g przez kilka sekund, aby upewnić się, że pełna objętość znajduje się na dnie probówki.</li>
	<li>Załaduj probówki do PCR do przyrządu do cyklera/systemu wykrywania PCR, otwierając szufladę instrumentu.</li>
	<li>Umieść stojak z probówkami do PCR w dołkach w szufladzie i sprawdź, czy probówki są prawidłowo osadzone.</li>
	<li>Zamknij szufladę i uruchom program zgodnie z opisem w protokole producenta. 
	UWAGA: Przyrząd oparty na PCR ma wstępnie ustawione parametry cykliczne dla każdego patogenu przenoszonego przez żywność.</li>
	<li>Sprawdź, czy na pasku stanu cyklicznego PCR jest wyświetlany niebieski pasek wskazujący, że uruchomiona jest część programu dotycząca amplifikacji. 
	UWAGA: W przypadku standardowych testów PCR czas przetwarzania pełnego programu (amplifikacja i detekcja) trwa około 3 - 3,5 godziny.</li>
</ol>
8. Przejrzyj wyniki
<ol>
	<li>Po zakończeniu przetwarzania postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie urządzenia systemowego opartego na PCR, aby usunąć próbki i przejrzeć wyniki.</li>
	<li>Jeżeli docelowy patogen przenoszony przez żywność jest obecny w próbce (na powierzchni lub w przewodzie pokarmowym muchy), studzienka jest oznaczona kolorem czerwonym ze znakiem "plus" (dodatni). Jeśli patogen jest nieobecny, studzienka jest zielona ze znakiem "minus" (ujemnym).</li>
	<li>Jeśli studzienka jest żółta z czerwonym paskiem pośrodku, oznacza to błąd sygnału.</li>
</ol>
9. Izolacja patogenów bakteryjnych na podstawie wyników dodatnich metodą PCR
<ol>
	<li>Należy wybrać probówki z pierwotnego (dla L. monocytogenes) lub wtórnego (dla Salmonelli i Cronobacter) wzbogacenia tych próbek, które były dodatnie pod względem PCR. Ponadto losowo wybierz 3-5% próbek, które były ujemne pod względem PCR i postępuj w następujący sposób:</li>
	<li>W przypadku Salmonelli:
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl wtórnego środka wzbogacającego do 10 ml pożywki Rappaport-Vassiliadis (RV) i do 1 ml bulionianu tetrationianu (TT). Probówki inkubować w temperaturze 42,5 °C w obiegowej łaźni wodnej przez 22 - 24 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji narysuj 3 mm pętlę (10 μl) z każdego, RV i TT na agarze z siarczynu bizmutu (BS), agarze z deoksycholanem lizozy ksylozy (XLD) i agarze dojelitowym Hektoen (HE). Inkubować płytki w temperaturze 35 ± 1 °C przez 22-24 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji zbadaj płytki pod kątem obecności typowych kolonii Salmonelli na każdej pożywce. Jeśli po kilku etapach hodowli nie można uzyskać izolowanych kolonii, należy uznać próbkę za ujemną i zgłosić ją jako fałszywie dodatnią dla systemu opartego na PCR. 
		UWAGA: Typowe kolonie Salmonelli na określonych pożywkach znajdują się w 22. Wybierz pięć przypuszczalnych typowych kolonii Salmonelli i hoduj je na subkulturze BS, XLD lub HE, aż do uzyskania czystych kultur izolowanych/pojedynczych kolonii.</li>
		<li>Wybierz jedną czystą kolonię i zidentyfikuj przypuszczalną Salmonellę za pomocą komercyjnych testów biochemicznych, takich jak karta identyfikacyjna VITEK 2 lub system identyfikacji biochemicznej API, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla Cronobacter:
	<ol>
		<li>Na dwóch płytkach chromogennych pożywek hodowlanych, takich jak pożywka do chromogenicznego powlekania R&F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) i/lub ChromID Sakazakii Agar, nanieść 3 mm pętelkową (10 μl) pożywki wzbogacającej. Inkubować płytki w temperaturze 35 °C przez 22-24 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji zbadaj płytki pod kątem obecności typowych kolonii Cronobacter (niebiesko-czarne do niebiesko-szarych). Wybierz 5 przypuszczalnych kolonii Cronobacter i zahoduj je na pożywce chromogenicznej R&F Enterobacter sakazakii (Cronobacter), ChromID Sakazakii Agar lub TSA, aż do uzyskania czystych kultur izolowanych/pojedynczych kolonii. 
		UWAGA: Jeśli po kilku etapach hodowli cząstkowej nie można uzyskać izolowanych kolonii, należy uznać próbkę za ujemną i zgłosić ją jako fałszywie dodatnią dla systemu wykrywania opartego na PCR.</li>
		<li>Wybierz jedną czystą kolonię i zidentyfikuj przypuszczalną Cronobacter za pomocą komercyjnych testów biochemicznych, takich jak karta identyfikacyjna VITEK 2 lub system identyfikacji biochemicznej API 20E, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla L. monocytogenes:
	<ol>
		<li>Na dwóch płytkach agaru Brilliance Listeria (BLA) nanieść 3 mm pętelkę (10 μl) pierwotnej pożywki wzbogacającej. Inkubować płytki w temperaturze 36 ± 1 °C przez 22-26 godzin.</li>
		<li>Po inkubacji zbadać płytki pod kątem obecności przypuszczalnych kolonii L. monocytogenes (niebiesko-zielonych). Wybierz 5 przypuszczalnych kolonii L. monocytogenes i zahoduj je w subkulturze BLA, aż do uzyskania czystych kultur izolowanych/pojedynczych kolonii. Ponownie inkubować płytki ujemne w temperaturze 36 ± 1 °C przez dodatkowe 22 - 26 godzin.</li>
		<li>Wybierz jedną czystą kolonię i zidentyfikuj przypuszczalną L. monocytogenes za pomocą komercyjnych testów biochemicznych, takich jak karta identyfikacyjna VITEK 2 lub system identyfikacji biochemicznej API Listeria, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przypuszczalne patogeny przenoszone przez żywność wyizolowane z owadów powinny zostać następnie potwierdzone i poddane serotypowaniu w laboratorium referencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Voeller, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZurek%2C+L+%22Wiley+Handbook+of+Science+and+Technology+for+Homeland+Security%22">Wiley Handbook of Science and Technology for Homeland Security</a>. , Wiley Inc. 1-16 (2008).</li>
<li>Olsen, A. R., Gecan, J. S., Ziobro, G. C., Bryce, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+action+criteria+for+filth+and+other+extraneous+materials+V.+Strategy+for+evaluating+hazardous+and+nonhazardous+filth%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory action criteria for filth and other extraneous materials V. Strategy for evaluating hazardous and nonhazardous filth.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 33 (3), 363-392 (2001).</li>
<li>Hald, B., Skovgård, H., Pedersen, K., Bunkenborg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influxed+insects+as+vectors+for+Campylobacter+jejuni+and+Campylobacter+coli+in+Danish+broiler+houses%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Influxed insects as vectors for Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in Danish broiler houses.</a> Poultry Science. 87 (7), 1428-1434 (2008).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Houseflies%3A+Not+simple+mechanical+vectors+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Houseflies: Not simple mechanical vectors of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 61 (4), 625-629 (1999).</li>
<li>Pava-Ripoll, M., Pearson, R. E. G., Miller, A. K., Ziobro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+relative+risk+of+Cronobacter+spp.%2C+Salmonella+spp.%2C+and+Listeria+monocytogenes+associated+with+the+body+surfaces+and+guts+of+individual+filth+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and relative risk of Cronobacter spp., Salmonella spp., and Listeria monocytogenes associated with the body surfaces and guts of individual filth flies.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (22), 7891-7902 (2012).</li>
<li>Hewitt, C. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHewitt%2C+CG+%22Houseflies+and+how+they+spread+disease%22">Houseflies and how they spread disease</a>. , Cambridge University Press. (1912).</li>
<li>Rochon, K., Lysyk, T. J., Selinger, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+Escherichia+coli+by+house+fly+and+stable+fly+%28Diptera%3AMuscidae%29+during+pupal+metamorphosis+and+eclosion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Retention of Escherichia coli by house fly and stable fly (Diptera:Muscidae) during pupal metamorphosis and eclosion.</a> Journal of Medical Entomology. 42 (3), 397-403 (2005).</li>
<li>Greenberg, B., Kowalski, J. A., Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+transmission+of+Salmonella+by+flies%3A+natural+resistance+to+colonization+and+bacterial+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the transmission of Salmonella by flies: natural resistance to colonization and bacterial interference.</a> Infection and Immunity. 2 (6), 800-809 (1970).</li>
<li>Mramba, F., Broce, A. B., Zurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+stable+flies%2C+Stomoxys+calcitrans+L.+%28Diptera%3AMuscidae%29%2C+for+Enterobacter+sakazakii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera:Muscidae), for Enterobacter sakazakii.</a> Journal of Vector Ecology. 32 (1), 134-139 (2007).</li>
<li>Ekdahl, K., Normann, B., Andersson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+flies+explain+the+elusive+epidemiology+of+campylobacteriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Could flies explain the elusive epidemiology of campylobacteriosis.</a> Bmc Infectious Diseases. 5 (11), 11(2005).</li>
<li>Nayduch, D., Noblet, G. P., Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+potential+of+houseflies+for+the+bacterium+Aeromonas+caviae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector potential of houseflies for the bacterium Aeromonas caviae.</a> Medical and Veterinary Entomology. 16 (2), 193-198 (2002).</li>
<li>Multistate and Nationwide Foodborne Outbreak Investigations: A Step-by-Step Guide. , CDC. Atlanta, GA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/foodsafety/outbreaks/investigating-outbreaks/investigations/index.html">http://www.cdc.gov/foodsafety/outbreaks/investigating-outbreaks/investigations/index.html</a> (2013).</li>
<li>Sievert, K., Messler, S., Klimpel, S., Feffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+study+on+the+occurrence+and+distribution+of+pathogenic+microorganisms+carried+by+synanthropic+flies+caught+at+different+rural+locations+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive study on the occurrence and distribution of pathogenic microorganisms carried by synanthropic flies caught at different rural locations in Germany.</a> Journal of Medical Entomology. 46 (5), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hernández-Escareño, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Enterobacteriaceae%2C+Listeria+spp.%2C+Vibrio+spp.+and+Staphylococcus+spp.+in+house+fly+%28Musca+domestica+L.%29%2C+collected+and+macerated+from+different+sites+in+contact+with+a+few+animals+species%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Cientifica-Facultad+De+Ciencias+Veterinarias%22%5BJournal%5D)">Presence of Enterobacteriaceae, Listeria spp., Vibrio spp. and Staphylococcus spp. in house fly (Musca domestica L.), collected and macerated from different sites in contact with a few animals species.</a> Revista Cientifica-Facultad De Ciencias Veterinarias. 22 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Mian, L. S., Maag, H., Tacal, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+from+muscoid+flies+at+commercial+animal+establishments+in+San+Bernardino+county%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella from muscoid flies at commercial animal establishments in San Bernardino county, California.</a> Journal of Vector Ecology. 27 (1), 82-85 (2002).</li>
<li>Olsen, A. R., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+spp.+from+the+housefly%2C+Musca+domestica+L.%2C+and+the+dump+fly%2C+Hydrotaea+aenescens+%28Wiedemann%29+%28Diptera%3AMuscidae%29%2C+at+caged-layer+houses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella spp. from the housefly, Musca domestica L., and the dump fly, Hydrotaea aenescens (Wiedemann) (Diptera:Muscidae), at caged-layer houses.</a> Journal of Food Protection. 63 (7), 958-960 (2000).</li>
<li>Holt, P. S., Geden, C. J., Moore, R. W., Gast, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis+from+houseflies+%28Musca+domestica%29+found+in+rooms+containing+Salmonella+serovar+Enteritidis-challenged+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella enterica serovar Enteritidis from houseflies (Musca domestica) found in rooms containing Salmonella serovar Enteritidis-challenged hens.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6030-6035 (2007).</li>
<li>Mramba, F., Broce, A., Zurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Enterobacter+sakazakii+from+stable+flies%2C+Stomoxys+calcitrans+L.+%28Diptera%3AMuscidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Enterobacter sakazakii from stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera:Muscidae).</a> Journal of Food Protection. 69 (3), 671-673 (2006).</li>
<li>Koyuncu, S., Andersson, M. G., Haggblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+Sensitivity+of+Commercial+PCR-Based+Methods+for+Detection+of+Salmonella+enterica+in+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and Sensitivity of Commercial PCR-Based Methods for Detection of Salmonella enterica in Feed.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (9), 2815-2822 (2010).</li>
<li>Gagné, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+and+mite+pests+in+food%2C+an+illustrated%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Insect and mite pests in food, an illustrated.</a> 1, U.S. Department of Agriculture and U.S. Department of Health and Human Service. 269-296 (1991).</li>
<li>Greenberg, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenberg%2C+B+%22Flies+and+disease%2C+Vol+I.+Ecology%2C+classification+and+biotic+associations%22">Flies and disease, Vol I. Ecology, classification and biotic associations</a>. , Princeton University Press. (1971).</li>
<li>Wallace, H. A., Jacobson, A., Hammack, T. S. Chapter 5 Salmonella. Bacteriological Analytical Manual. , 
 Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodScienceResearch/UCM244774.pdf">http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodScienceResearch/UCM244774.pdf</a> (2007).</li>
<li>Barro, N., Aly, S., Tidiane, O. C. A., Sababenedjo, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+bacteria+by+proboscises%2C+legs%2C+and+feces+of+two+species+of+flies+in+street+food+vending+sites+in+Ouagadougou%2C+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Carriage of bacteria by proboscises, legs, and feces of two species of flies in street food vending sites in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> Journal of Food Protection. 69 (8), 2007-2010 (2006).</li>
<li>Ugbogu, O. C., Nwachukwu, N. C., Ogbuagu, U. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+and+Shigella+species+from+house+flies+%28Musca+domestica+L.%29+in+Uturu%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella and Shigella species from house flies (Musca domestica L.) in Uturu, Nigeria.</a> African Journal of Biotechnology. 5 (11), 1090-1091 (2006).</li>
<li>Brownlie, J. C., Johnson, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont-mediated+protection+in+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Symbiont-mediated protection in insect hosts.</a> Trends in Microbiology. 17 (8), 348-354 (2009).</li>
<li>Feldhaar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+as+mediators+of+ecologically+important+traits+of+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts as mediators of ecologically important traits of insect hosts.</a> Ecological Entomology. 36 (5), 533-543 (2011).</li>
<li>Foodborne disease outbreaks: Guidelines for investigation and control. , World Health Organization. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/foodborne_disease/outbreak_guidelines.pdf">http://www.who.int/foodsafety/publications/foodborne_disease/outbreak_guidelines.pdf</a> (2008).</li>
<li>Wright, A. P., Gould, L. H., Mahon, B., Sotir, M. J., Tauxe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Impact+of+Epidemic-Assistance+Investigations+of+Foodborne+and+Other+Enteric+Disease+Outbreaks%2C+1946-2005%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Impact of Epidemic-Assistance Investigations of Foodborne and Other Enteric Disease Outbreaks, 1946-2005.</a> American Journal of Epidemiology. 174, S23-S35 (2011).</li>
</ol>

Użycie określonego oprzyrządowania nie jest równoznaczne z aprobatą Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków. Autorzy zaświadczają, że nie ma konfliktu interesów z żadną organizacją finansową w odniesieniu do materiału omawianego w tym artykule.

Poprzednie badania, w których wykryto patogeny przenoszone przez żywność przez dzikie owady, wykorzystywały wiele różnych protokołów, które mogą nie zawierać niezbędnych informacji do dokładnej oceny ryzyka związanego z żywnością obecności pojedynczej muchy w żywności lub środowiskach związanych z żywnością13,15,23,24. Tutaj wykazaliśmy, że przy użyciu tego znormalizowanego protokołu możliwe jest wykrycie i wyizolowanie Cronobacter spp., S. enterica i L. monocytogenes z powierzchni ciała i przewodu pokarmowego pojedynczych much złapanych na wolności. Ponieważ owady mogą przenosić niewielką liczbę docelowego patogenu przenoszonego przez żywność i dużą liczbę innej rodzimej mikroflory25,26, protokół ten wymaga pierwotnego (a czasem wtórnego) wzbogacenia próbek w określone pożywki hodowlane w celu zwiększenia czułości wykrywania docelowego patogenu przenoszonego przez żywność. Wyniki systemu detekcji opartego na PCR uzyskano w ciągu około 30 godzin (w przypadku wykrycia Cronobacter spp. i S. enterica) i 48 godzin (w przypadku wykrycia L. monocytogenes) po wstępnym przetworzeniu próbek. Dzięki temu protokół ten jest niezawodny, a także szybki i wystarczająco czuły, aby przebadać pojedynczą muchę pod kątem obecności patogenów przenoszonych przez żywność.
Potwierdzenie dodatnich wyników PCR i izolacja żywych bakterii jest częścią standardowej procedury operacyjnej wielu laboratoriów. Ponadto, do celów epidemiologicznych, wymagane są czyste kultury bakteryjne z próbek dodatnich metodą PCR, aby dalej potwierdzić i serotypować patogen przenoszony przez żywność przy użyciu metod biochemicznych, immunologicznych lub genetycznych. Chociaż nie zaobserwowano żadnych wyników fałszywie dodatnich podczas wykrywania S. enterica i L. monocytogenes z części ciała pojedynczych dziko żyjących much, stosując ten protokół, znaleźliśmy do 50% odsetek wyników fałszywie dodatnich dla Cronobacter spp. Sugeruje to, że system wykrywania rodzaju Cronobacter oparty na PCR może reagować krzyżowo z innymi Enterobacteriaceae obecnymi wśród wysoce złożonej mikroflory przenoszonej przez muchy. W związku z tym izolacja i oczyszczanie czystych kolonii z rodzaju Cronobacter z próbek dodatnich metodą PCR wymaga bardziej selektywnego posiewu niż w przypadku innych ocenianych patogenów.
Protokół ten został przede wszystkim ustandaryzowany do badania przesiewowego poszczególnych dziko żyjących much pod kątem obecności Cronobacter spp., S. enterica i L. monocytogenes przy użyciu komercyjnego systemu wykrywania opartego na PCR. Protokół ten można jednak łatwo dostosować do badań przesiewowych części ciała pojedynczych much pod kątem obecności innych patogenów przenoszonych przez żywność, takich jak enterokrwotoczna E. coli O157:H7 (przy użyciu standardowego zestawu testowego E. coli O157:H7 MP lub zestawu do testów w czasie rzeczywistym E. coli O157:H7) oraz toksyczna dla shigi E. coli (STEC) (przy użyciu pakietu STEC w czasie rzeczywistym), uzyskując czułość >80% (dane niepublikowane). Ponadto protokół ten może być potencjalnie dostosowany do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od innych owadów, które są znanymi wektorami chorób (karaluchy i mrówki), ale potrzebne są dalsze badania w tej dziedzinie.
Badania w sprawie wybuchu epidemii chorób przenoszonych drogą pokarmową są bardzo dynamiczne i obejmują wieloetapowy proces, który może się różnić w zależności od konkretnej sytuacji i badanego środowiska lokalnego12,27. Badania te są ważne, ponieważ zapewniają natychmiastową ochronę zdrowia publicznego poprzez zapobieganie chorobom w przyszłości. Ponadto badania te mogą wyjaśnić nowe mechanizmy rozprzestrzeniania się mikroorganizmów przenoszonych przez żywność i postawić ważne pytania, które prowadzą do nowych obszarów badań28. Techniki śledcze, a także ustandaryzowane, szybkie i czułe protokoły są niezbędne do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od poszczególnych owadów. Ten ustandaryzowany protokół otwiera możliwość aseptycznego zbierania owadów, takich jak muchy, które mogą przenosić patogen bakteryjny przenoszony przez żywność, w ramach programu pobierania próbek środowiskowych. Informacje epidemiologiczne, które można dzięki temu uzyskać, byłyby przydatne w konstruowaniu dokładnego obrazu mechanizmów przenoszenia patogenów przenoszonych przez żywność przez owady (tj. długość czasu ekspozycji: mucha przez lądowanie kontra muchy lądujące, wypróżniające się i zwracane).
Wreszcie, mimo że opisany tutaj komercyjny system wykrywania oparty na PCR jest praktyczny w użyciu i upraszcza amplifikację PCR oraz wizualizację amplikonu na poziomie rodzaju, w żadnym wypadku nie jest to jedyny odpowiedni system. Lizat ze wzbogaconych próbek można alternatywnie wykorzystać do badań przesiewowych na obecność patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu publicznie dostępnych par starterów specyficznych dla danego gatunku. Jednak przed ich użyciem należy wykazać czułość wykrywania.

Owady odgrywają ważną rolę w przenoszeniu chorób związanych z żywnością, ponieważ mogą przenosić patogeny na żywność lub powierzchnie i naczynia mające kontakt z żywnością1. Wśród owadów muchy, karaluchy i mrówki wykazują zachowania sprzyjające rozprzestrzenianiu się patogenów przenoszonych przez żywność. Zachowania te obejmują związek z rozkładającą się materią, odpadkami i kałem, endofilię (wchodzenie do budynków) i synantropię (współżycie z ludźmi)2. Patogeny przenoszone przez żywność, takie jak Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., Escherichia coli O157:H7 i członkowie rodzaju Cronobacter (dawniej Enterobacter sakazakii) są przenoszone przez owady3-5. Synantropijne muchy brudu mechanicznie rozprzestrzeniają bakterie przenoszone przez żywność, przenosząc patogeny z ich skażonej powierzchni ciała. Jednak obecność patogenów przenoszonych przez żywność w przewodzie pokarmowym much może być do trzech razy większa niż obserwowana na powierzchni ich ciała (tułów, głowy, nóg i skrzydeł)5. Patogeny przenoszone przez żywność mogą również pozostawać w przewodzie pokarmowym muchy przez dłuższy czas niż na powierzchni ciała6,7, a w niektórych przypadkach są w stanie się namnażać, kolonizując przewód pokarmowy muchy4,8,9. Zwiększa to potencjał wektorowy much, ponieważ mogą one dalej rozprzestrzeniać patogeny przenoszone przez żywność poprzez defekację i niedomykalność10,11.
Obecnie istnieją ulepszone systemy nadzoru, które są w stanie szybciej wykrywać epidemie chorób przenoszonych drogą pokarmową. Przeprowadzając dochodzenia w sprawie epidemii przenoszonych przez żywność, urzędnicy ds. zdrowia publicznego szukają żywności, która może być źródłem (źródłem) lub nośnikiem (nośnikami) infekcji. Śledczy mogą również przeprowadzić ocenę oddziaływania na środowisko zakładu (lub obiektów), którego dotyczy sprawa, aby dowiedzieć się, w jaki sposób doszło do zanieczyszczenia żywności, i mogą pobrać próbki w ramach dochodzenia12. Pomimo ogromnej ilości literatury naukowej dotyczącej owadów jako nosicieli patogenów przenoszonych przez żywność, powiązanie owadów jako wektorów patogenu powodującego konkretną epidemię chorób przenoszonych drogą pokarmową było wyzwaniem. Dzieje się tak głównie dlatego, że owady nie są zbierane w sposób aseptyczny w ramach programów pobierania próbek środowiskowych podczas dochodzeń w sprawie epidemii przenoszonych przez żywność. Aby włączyć owady, szczególnie te, które wykazują zachowania sprzyjające rozprzestrzenianiu się patogenów przenoszonych przez żywność, jako część procedury pobierania próbek środowiskowych, musi istnieć znormalizowany, szybki, czuły i niezawodny protokół wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od pojedynczego owada.
Tradycyjne techniki powlekania do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od owadów są pracochłonne i polegają na konkurencyjnym wzroście docelowych bakterii w różnych podłożach hodowlanych, aby przezwyciężyć szybki wzrost wrodzonej mikroflory komensalnej owada. Większość badań, w których powiązano owady z patogenami bakteryjnymi, zwiększyła czułość metody poprzez łączenie kilku owadów, a nie identyfikowanie obecności patogenów dla każdego osobnika. W związku z tym badania te nie różnicowały części ciała owada, w której stwierdzono patogeny13-18. Zdolność do określenia, czy patogeny przenoszone przez żywność znajdują się na powierzchni ciała, czy w przewodzie pokarmowym pojedynczego owada, jest ważna, ponieważ może to mieć implikacje epidemiologiczne i może prowadzić do różnych strategii łagodzących. Jako wektory mechaniczne, muchy, które lądują na pożywieniu przez krótki czas, mogą przenosić tylko niewielkie poziomy bakterii z powierzchni ciała, podczas gdy muchy, które zwracają i wypróżniają się na pokarm, zwiększają prawdopodobieństwo przeniesienia patogenów na potencjalnie wyższych poziomach infekcji. W związku z tym ważne jest, aby oszacować częstość występowania patogenu przenoszonego przez żywność u pojedynczego owada i zróżnicować część ciała tego owada, w której znajduje się patogen bakteryjny.
Mimo że coraz częściej wdrażane są metody wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność, nie były one komercyjnie wykorzystywane do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od pojedynczego owada. Obecnie istnieją zwalidowane protokoły molekularne, które są dostępne na rynku do szybkiego wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność w żywności, które są używane przez przemysł i agencje regulacyjne. Metody te obejmują systemy oparte na DNA do wykrywania patogenów w różnych próbkach żywności. Chociaż protokoły molekularne są szybsze niż tradycyjne metody posiewu, nadal wymagane jest wzbogacenie próbki w celu uzyskania poziomu czułości 102 jednostek tworzących kolonie (CFU) patogenu bakteryjnego potrzebnego w metodach opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)19. Dodatkowo konieczna jest izolacja czystych kolonii bakteryjnych z próbek dodatnich PCR, aby potwierdzić patogen przy użyciu odpowiednich metod.
Celem tego protokołu jest standaryzacja dostępnego na rynku systemu opartego na PCR, używanego do wykrywania patogenów z próbek żywności i środowiska do wykrywania bakterii przenoszonych przez żywność z powierzchni ciała i przewodu pokarmowego pojedynczej muchy oraz do dalszego izolowania tych patogenów od próbek. Czułość opisanego tutaj protokołu została po raz pierwszy skalibrowana na hodowanych w laboratorium dorosłych muszkach domowych (Musca domestica), które były eksperymentalnie karmione seryjnymi rozcieńczeniami każdego patogenu bakteryjnego. Ustandaryzowany protokół został następnie wykorzystany do zbadania 100 dziko żyjących much pod kątem obecności patogenów przenoszonych przez żywność z powierzchni ich ciała i/lub przewodów pokarmowych. Ten ustandaryzowany protokół pozwoli laboratoriom zdrowia publicznego na wykrywanie zagrożeń dla zdrowia stwarzanych przez owady, co pozwoli na ich gromadzenie w ramach programu pobierania próbek środowiskowych podczas przeprowadzania dochodzeń w sprawie epidemii przenoszonych przez żywność.

<table><tbody><tr><td>Agar z siarczynem bizmutu (BS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R452402</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Rosół z naparu z serca mózgu (BHI)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>299070</td> <td>* Wstępnie podgrzany do 37 stopni C. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Brilliance Listeria agar (BLA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1080B</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Buforowana woda peptonowa (BPW)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>212367</td><td>*Wstępnie podgrzana do 37&deg; C lub 42&deg;C. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Agar Brilliance Cronobacter (preparat Druggan-Forsythe-Iversen/DFI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1055B</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>chromID Sakazakii Agar</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>43741</td><td>*Zadzwoń po informacje: 800.682.2666</td></tr><tr><td>R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Pożywka do powlekania chromogenicznego</td><td>R & F Laboratories</td><td>Różne</td><td>*Zadzwoń po informacje: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>R & F Enterobacter sakazakiii Bulion wzbogacający i suplement</td><td>R & F Laboratories</td><td>Różne</td><td>*Zadzwoń po informacje: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>Hektoen enteric (HE) agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXCM0419B</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>24 Rosół wzbogacający Listeria (24LEB)</td><td>Oxoid</td><td>CM1107</td><td>*Świeżo przygotowany w temperaturze pokojowej. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Suplement do selektywnego wzbogacania Listeria</td><td>Oxoid</td><td>SR0243</td> <td>* Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Novobiocin</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXSR0181E</td><td>*Wielu dostawców. Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C</td></tr><tr><td>Hydrat chlorowodorku wankomycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861987</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C</td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej cefsulodyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8145</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C</td></tr><tr><td>Rappaport-Vassiliadis (RV) medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM0669B</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Bulion tetrationianu (TT)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>249120</td> <td>* Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Agar sojowy Trypticase (TSA)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>236930</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Desoksycholan lizyny ksylozy (XLD) agar</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>221284</td><td>*Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>API System identyfikacji biochemicznej</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>Różne</td><td>*Zadzwoń po informacje: +1.800.682.2666</td></tr><tr><td>VITEK 2: Bezpieczeństwo produktu</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>Różne</td><td>*Zadzwoń po informacje: +1.800.682.2667</td></tr><tr><td>BAX System Q7</td><td>DuPont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAX E. sakazakii Standardowy zestaw testowy</td><td>DuPont</td><td>D11801836</td> BAX L. monocytogenes 24E DuPont D13608125 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAX Salmonella 2 Standardowy zestaw testowy</td><td>DuPont</td><td>D14368501</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do zamykania</td><td>DuPont</td><td></td><td></td>D11677028</tr><tr><td>Narzędzie do usuwania patówek</td><td>DuPont</td><td>D11134095</td><td></td></tr><tr><td>stojak/uchwyt na probówki do PCR</td><td>DuPont</td><td>D12701663</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do wagi piórkowej, szeroka końcówka</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>Sterylizuj przed użyciem. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Kleszczyki z cienką końcówką z prostą końcówką</td><td>BioQuip</td><td>4731</td><td>Sterylizuj przed użyciem. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe, 0,5 mm</td><td>Bio Spec Products, Inc.</td><td>11079105z</td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego - 60X15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle inokulacyjne, 10 i mikro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Rozsiewacze komórek w kształcie litery L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-230</td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>Various</td><td>Sterylizuj przed użyciem w razie potrzeby. Preferowana jest bezpieczna pokrywa. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Rurki klastrowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-13</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki tubek zbiorczych</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-23</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu (wybielacz chloru w płynie)</td><td></td><td></td><td>*Rozcieńczyć do 0,05% wodą. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td></td> dejonizowana <td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 190 proof</td><td></td><td></td><td>*W razie potrzeby rozcieńczyć do 70% wodą. Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Zakłócacz komórek Genie, 120 V - do mikroprobówek 1,5 ml i 2,0 ml</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-D238</td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> grzewczy <td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td><td>chłodzący Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Recyrkulacyjna łaźnia</td><td></td><td></td> wodna <td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>Wielu dostawców.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność przez pojedyncze muchy brudne

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Istnieje jednomyślna zgoda co do tego, że owady są ważnymi wektorami patogenów przenoszonych przez żywność. Jednak powiązanie owadów jako wektorów patogenu powodującego konkretną epidemię chorób przenoszonych drogą pokarmową było wyzwaniem. Dzieje się tak dlatego, że owady nie są zbierane w sposób aseptyczny w ramach programu pobierania próbek środowiskowych podczas dochodzeń w sprawie epidemii przenoszonych przez żywność oraz dlatego, że nie ma znormalizowanej metody wykrywania bakterii przenoszonych przez żywność od poszczególnych owadów. Aby zrobić krok w kierunku rozwiązania tego problemu, dostosowaliśmy protokół z dostępnego na rynku systemu opartego na PCR, który wykrywa patogeny przenoszone przez żywność w próbkach żywności i środowiska, w celu wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność od pojedynczych much. Korzystając z tego ustandaryzowanego protokołu, przebadaliśmy 100 dziko żyjących much pod kątem obecności Cronobacter spp., Salmonella enterica i Listeria monocytogenes i wykazaliśmy, że możliwe jest wykrycie i dalsze wyizolowanie tych patogenów z powierzchni ciała i przewodu pokarmowego pojedynczej muchy. Dwadzieścia dwa procent przewodów pokarmowych i 8% powierzchni ciała pobranych dzikich much było dodatnich na obecność co najmniej jednego z trzech patogenów przenoszonych przez żywność. Częstość występowania Cronobacter spp. na którejkolwiek części ciała much była statystycznie wyższa (19%) niż częstość występowania S. enterica (7%) i L. monocytogenes (4%). Nie zaobserwowano żadnych wyników fałszywie dodatnich podczas wykrywania S. enterica i L. monocytogenes przy użyciu tego systemu opartego na PCR, ponieważ ze wszystkich wyników dodatnich PCR uzyskano czyste kultury bakterii. Jednak czyste kolonie Cronobacter nie uzyskano z około 50% próbek dodatnich PCR, co sugeruje, że system wykrywania tego patogenu oparty na PCR reaguje krzyżowo z innymi Enterobacteriaceae obecnymi wśród wysoce złożonej mikroflory przenoszonej przez dzikie muchy. Przedstawiony tutaj ustandaryzowany protokół pozwoli laboratoriom wykrywać bakteryjne patogeny przenoszone przez żywność z asepcie zebranych owadów, dając w ten sposób urzędnikom ds. zdrowia publicznego kolejną linię dowodów, aby dowiedzieć się, w jaki sposób żywność została skażona podczas przeprowadzania dochodzeń w sprawie epidemii przenoszonych przez żywność.

Protokół ten został po raz pierwszy skalibrowany na zestawie hodowanych laboratoryjnie muszek domowych, które poddano 24-godzinnemu eksperymentalnemu karmieniu płynną pożywką dla much (2% mleka w proszku) zawierającą rozcieńczenia szeregowe (102 – 108 CFU/ml) C. sakazakii, S. enterica, L. monocytogenes lub C. jejuni (n = 21 dla każdego patogenu bakteryjnego). Pożywki wzbogacające, a także czasy i temperatury inkubacji zostały dostosowane dla każdego patogenu przenoszonego przez żywność, aż do momentu, gdy system oparty na PCR był w stanie wykryć najniższe poziomy bakterii (102 CFU/ml) z powierzchni ciała i kanału pokarmowego pojedynczej muchy karmionej eksperymentalnie. Przy zastosowaniu pożywek wzbogacających i warunków opisanych w sekcji protokołu, system oparty na PCR wykrył C. sakazakii, S. enterica oraz L. monocytogenes z powierzchni ciała 100% much karmionych inokulatem bakteryjnym &gt;103 CFU/ml (Rysunek 1A). W przypadku karmienia much dawką 102 CFU/ml, odsetek wykrywalności C. sakazakii, S. enterica oraz L. monocytogenes z powierzchni ich ciała wyniósł odpowiednio 100%, 66% i 33% (Rysunek 1A). System oparty na PCR wykrył również te trzy patogeny przenoszone przez żywność z kanału pokarmowego much karmionych wszystkimi stężeniami bakterii z odsetkiem ≥33% (Rysunek 1B). Jednakże wykrycie C. jejuni osiągnięto tylko wtedy, gdy muchy hodowane laboratoryjnie były eksperymentalnie karmione płynnym pokarmem zawierającym najwyższy inokulum bakteryjny (108 CFU/ml). W związku z tym C. jejuni została wykluczona z grupy patogenów przenoszonych przez żywność, które można testować z pojedynczych synantropijnych much brudnych przy użyciu tego systemu detekcji opartego na PCR.
Dzięki temu ustandaryzowanemu protokołowi byliśmy w stanie określić częstość występowania Cronobacter spp., S. enterica oraz L. monocytogenes na powierzchni ciała i/lub w kanale pokarmowym 100 dzikich much, które zostały indywidualnie i aseptycznie odłowione z obszaru kontenerów na odpady w dziesięciu miejskich restauracjach znajdujących się w obszarze metropolitalnym Waszyngton, D.C.5 Zebrane muchy domowe były reprezentatywne dla co najmniej sześciu gatunków, w tym M. domestica (47%), Lucilia cuprina (33%), L. sericata (14%), Cochliomyia macellaria (2%), Sarcophaga haemorrhoidalis (2%) oraz Ophyra leucostoma (1%). Jedna mucha została zidentyfikowana jedynie na poziomie rodziny (Anthomyiidae; 1%). Protokół dezynfekcji powierzchniowej był skuteczny w zapobieganiu kontaminacji krzyżowej między częściami ciała muchy, ponieważ na płytkach TSA nie zaobserwowano wzrostu bakterii w wodzie z ostatniego płukania dezynfekcyjnego każdej poszczególnej muchy. W ten sposób można było odróżnić bakterie przenoszone przez żywność obecne na częściach ciała każdej muchy.
Nie wykryto wyników fałszywie dodatnich w próbkach pobranych z powierzchni ciała oraz przewodu pokarmowego poszczególnych much podczas zastosowania tego komercyjnego systemu opartego na metodzie PCR do wykrywania *S. enterica* i *L. monocytogenes*, a potwierdzenie obecności żywych patogenów na płytkach agarowych było zgodne z wynikami dodatnimi w badaniu PCR. Niemniej jednak nie udało się wyizolować czystych kultur Cronobacter gatunki z wszystkich próbek pozytywnych w badaniu PCR. W związku z tym wykrywanie tego patogenu za pomocą metody PCR-based system wykazał wyniki fałszywie dodatnie z powierzchni ciała (50%; 9/18) oraz przewodu pokarmowego (48%; 16/33) pojedynczych much odłowionych w naturze. Losowo wybrane próbki ujemne w teście PCR, które wysiano na podłoża specyficzne, potwierdziły brak patogenów przenoszonych z żywnością. W związku z tym, przy zastosowaniu tego komercyjnego systemu PCR do detekcji, nie wykryto wyników fałszywie ujemnych w żadnej z próbek. Cronobacter spp., S. entericalub L. monocytogenes.
Za pozytywne i uwzględnione w analizie statystycznej uznano jedynie te próbki z wynikiem PCR-dodatnim, w których patogen został wyizolowany i potwierdzony. Ogólna obecność patogenów przenoszonych przez żywność w kanale pokarmowym dzikich much z rodzaju filth flies była znacząco wyższa niż na powierzchni ciała (χ2 = 6.8772, df = 1, p = 0.0087). 22% kanałów pokarmowych i 8% powierzchni ciał zebranych dzikich much były pozytywne pod kątem co najmniej jednego z trzech patogenów przenoszonych przez żywność (Rysunek 2). Ogólnie rzecz biorąc, rozpowszechnienie Cronobacter spp. na powierzchniach ciała lub w kanałach pokarmowych zebranych much było statystycznie wyższe (19%; dokładny test Fishera p = 0.0165) niż rozpowszechnienie S. enterica (7%) i L.monocytogenes (4%). Jednak nie zaobserwowano istotnych różnic statystycznych podczas przeprowadzania porównań parowych między częściami ciała much dla każdego patogenu bakteryjnego (Rysunek 3; dokładny test Fishera p = 0.1464, p = 0.1184 oraz p = 0.6212 odpowiednio dla Cronobacter spp., S. enterica i L.monocytogenes). Żadna z much nie była pozytywna pod kątem wszystkich trzech ocenianych patogenów. Niemniej jednak trzy z much (dwie L. cuprina i jedna L. sericata) przenosiły Salmonella spp. i L. monocytogenes na powierzchni ciała lub w kanale pokarmowym.
<img alt="Wykres porównawczy wzrostu bakterii pokazujący CFU/mL dla C. sakazakii, S. enterica, L. monocytogenes, C. jejuni." src="/files/ftp_upload/52372/52372fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Poziomy detekcji Cronobacter sakazakii, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, oraz Campylobacter jejuni z (A) powierzchni ciała oraz (B) kanału pokarmowego poszczególnych hodowanych w laboratorium much domowych karmionych pokarmem płynnym zawierającym różne inokulum bakteryjne (n = 21 dla każdego patogenu bakteryjnego, n = 3 dla każdego stężenia bakterii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52372/52372fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący procentowy rozkład w kanale pokarmowym i na powierzchni ciała; analiza statystyczna P=0.0087." src="/files/ftp_upload/52372/52372fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Procent powierzchni ciała i kanałów pokarmowych poszczególnych much z wynikiem dodatnim dla któregokolwiek z docelowych patogenów przenoszonych przez żywność.
<img alt="Wykres słupkowy rozkładu bakterii; kanał pokarmowy vs powierzchnia ciała, Cronobacter, S. enterica, L. monocytogenes." src="/files/ftp_upload/52372/52372fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Częstość występowania Cronobacter spp., Salmonella enterica oraz Listeria monocytogenes na powierzchni ciała i w kanale pokarmowym synantropijnych much dzikich. Przedstawione wartości p pochodzą z porównań parzystych pomiędzy powierzchnią ciała a kanałem pokarmowym dla każdego patogenu bakteryjnego (dokładny test Fishera, wartość p &lt; 0,05 oznacza istotność statystyczną). Copyright © American Society for Microbiology, Journal of Applied and Environmental Microbiology 78 (22):7891-902, 2012. doi: 10.1128/AEM.02195-12.

Protokół oparty na PCR został dostosowany do wykrywania Cronobacter spp., Salmonella enterica i Listeria monocytogenes z powierzchni ciała i kanałów pokarmowych pojedynczych dziko żyjących much. Celem tego protokołu jest wykrycie i wyizolowanie patogenów bakteryjnych od poszczególnych owadów zebranych w ramach programu pobierania próbek środowiskowych podczas badań epidemii przenoszonych przez żywność.

Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność przez pojedyncze muchy brudne

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Ogólnym celem tej procedury jest przesiewowe badanie w kierunku obecności bakteryjnych patogenów przenoszonych przez żywność z powierzchni ciała i kanału pokarmowego poszczególnych much, przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu detekcji opartego na metodzie PCR. Osiąga się to poprzez wstępne odłowienie dzikich much z obszarów gospodarki odpadami w restauracjach. Poszczególne muchy są zanurzane w pożywce płynnej w celu pobrania mikrobioty z powierzchni ciała.Następnie ekstrahuje się kanał podstawowy, umieszcza go w innej probówce zawierającej bulion odżywczy i poddaje fragmentacji w celu uwolnienia bakterii z tkanki. Kolejnym krokiem jest przeniesienie próbek do bulionu wzbogacającego specyficznego dla danego patogenu w celu namnożenia bakterii, co zwiększy ich stężenie powyżej granic wykrywalności testu. Następnie wzbogacone próbki poddaje się lizie i przenosi do probówek do PCR zawierających gotowe do użycia tabletki do detekcji docelowych patogenów metodą PCR.Ostatnim krokiem jest wyizolowanie czystych kolonii bakteryjnych z próbek, które w testach PCR dały wynik dodatni, poprzez wysianie bulionu wzbogacającego na podłoża selektywne i różnicujące. Ostatecznie połączenie detekcji opartej na PCR oraz izolacji czystych kolonii jest wykorzystywane do oceny rozpowszechnienia kob backer, salmonella oraz listeria monocytogenes w przewodach pokarmowych i na powierzchniach ciała poszczególnych much złapanych w naturze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne wysiewanie, jest jej szybkość i niezawodność, a także wystarczająca czułość, aby przesiewowo zbadać powierzchnię ciała i przewód pokarmowy pojedynczej muchy pod kątem obecności bakteryjnych patogenów footwear.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania podczas badania ognisk chorób przenoszonych przez żywność, takich jak mechanizmy przenoszenia przez owady oraz źródła patogenów. Zastosowanie tej techniki wykracza poza diagnostykę patogenów żywnościowych w próbkach żywności i środowiska, obejmując obecnie możliwość wykrywania tych bakterii chorobotwórczych u poszczególnych owadów, takich jak muchy. Aby rozpocząć, umieść aseptycznie zebrane muchy w zamrażarce o temperaturze -20 °C na pięć do siedmiu minut w celu ich unieruchomienia.Następnie umieść jedną muchę w sterylnym probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml uprzednio ogrzanej buforowanej wody peptonowej, znanej jako BPW. Używając sterylnej pęsety, delikatnie wymieszaj zawartość probówki poprzez odwracanie jej przez dwie minuty, aby zapewnić kontakt całego ciała muchy z medium. Pozwala to na przeniesienie mikrobioty z powierzchni muchy do BPW.Następnie za pomocą sterylnej pęsety przenieś muchę do nowej probówki o pojemności 2 ml. Zdezynfekuj muchę, zanurzając ją w 70% etanolu i delikatnie mieszając przez jedną minutę, a następnie usuń etanol. Przepłucz muchę sterylną wodą destylowaną, a po płukaniu dodaj do probówki świeżo przygotowany 0,05% roztwór wybielacza.Mieszaj delikatnie przez jedną minutę, a następnie usuń wybielacz. Przepłucz muchę trzykrotnie sterylną wodą destylowaną, aby potwierdzić sterylizację. Przenieś wodę z ostatniego płukania do sterylnej probówki o pojemności dwóch mililitrów i przeprowadź test na obecność bakterii kontaminujących zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie umieść muchę na ręczniku papierowym z autoklawu, aby usunąć nadmiar wody. Po osuszeniu przenieś muchę do sterylnej, jednorazowej szalki Petriego o średnicy 60 milimetrów i umieść szalkę pod mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie wyciągnij odbyt oraz cały kanał pokarmowy z muchy, używając sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami.Następnie, w warunkach aseptycznych, przenieść kanał korzeniowy do drugiej probówki o pojemności 2 mL zawierającej 1 mL podgrzanego BPW oraz kuleczki z tlenku cyrkonu i krzemionki o średnicy 0,5 mm. Próbkę z kanałem korzeniowym inkubować w homogenizatorze komórkowym (cell disruptor) przez 5 do 10 minut w celu uwolnienia bakterii z tkanki.Pozostałą część muchy umieścić w czystej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 95% ethanol w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C. Do pierwotnego namnażania bakterii, BPW zawierający mikrobiotę z powierzchni lub kanału pokarmowego rozdzielić do trzech probówek o pojemności 2 ml. Z zastosowaniem odpowiedniego podgrzanego medium inkubować probówki w temperaturze i przez czas wymagany dla każdego patogenu; w przypadku wtórnego namnażania Salmonella i kob backer. Przenieść 100 µL namnożonej kultury do sterylnych probówek typu cluster zawierających 400 µL podgrzanej pożywki brain heart infusion broth.Inkubować probówki w bloku grzejnym w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Aby przygotować mieszaninę do lizy komórek, dodać 150 µL dostarczonej w zestawie proteazy do jednej butelki o pojemności 12 mL z buforem do lizy i wymieszać. Przenieść 200 µL odczynnika do lizy do każdej z oznakowanych probówek z klastrami. Następnie, za pomocą długich końcówek do pipet, przenieść 20 µL wtórnie wzbogaconych próbek do odpowiadających im probówek z klastrami, stosując kontrole negatywne.Dodaj 20 µL sterylnego pożywki dla kontroli pozytywnych. Dodaj 20 µL z nocnych kultur bakteryjnych znanych szczepów salmonella lub kob backer. Po dodaniu wszystkich próbek zamknij nakrętki probówek w klastrze za pomocą narzędzia do nakręcania.Następnie należy poddać komórki lizie, umieszczając statyw z probówkami klastrowymi w automatycznym bloku grzewczym i uruchamiając odpowiedni program dla docelowego patogenu, aby rozpocząć detekcję opartą na PCR. Najpierw schłodzić statyw na probówki PCR na bloku chłodzącym. Następnie umieścić w uchwycie odpowiadające im probówki PCR zawierające tabletki przygotowane do reakcji PCR dla docelowego patogenu przenoszonego przez żywność.Ostrożnie zdejmij nakrętki z probówek PCR za pomocą narzędzia do zdejmowania nakrętek i wyrzuć je. Sprawdź, czy w każdej probówce znajduje się tabletka. Następnie przenieś 50 µL lizatu do odpowiednich probówek PCR.Za pomocą narzędzia do zamykania szczelnie zamocuj nowe nakrętki optyczne na probówkach do PCR. Po przygotowaniu reakcji umieść probówki do PCR w systemie detekcji cyklera PCR. Następnie uruchom program i przeanalizuj wyniki zgodnie z protokołem producenta.Aby wyizolować czyste kolonie bakteryjne, należy wybrać probówki z pierwotnym wzbogaceniem próbek, które uzyskały wynik dodatni w badaniu PCR. W przypadku salmonelli należy dodać 100 µL kultury wzbogaconej do 10 mL podłoża Rappaporta-Vassiliadis oraz do 1 mL bulionu tetrationatu. Probówki należy inkubować w temperaturze 42,5 °C przez 22 do 24 godzin, a po inkubacji wysiać pętlą o średnicy 3 mm pełną każdego z podłoży na agar siarczkowo-bizmutowy, agar XLD, agar Hektoen oraz agar dla enterobakterii.Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 35 °C. Po 22 do 24 godzinach wzrostu sprawdź płytki pod kątem obecności typowych kolonii salmonelli na każdym posiewie; z medium selektywnego wysej kolonię dodatnią i wyizoluj pojedyncze kolonie po inkubacji.Użyj jednej czystej kolonii, aby potwierdzić tożsamość domniemanej salmonelli, stosując komercyjny test biochemiczny, taki jak test API 20 E dla metody KOB backer streak. Pobierz pełną pętlę z probówki z pierwotnym namnażaniem i zaszczep na dwie płytki z chromogenicznym podłożem hodowlanym, takim jak RNF enterobacter Sakaki eye chromogenic plating medium. Inkubuj płytki w temperaturze 35°C przez 22 do 24 godzin, a następnie sprawdź obecność kolonii o kolorze niebieskim, czarnym lub niebiesko-szarym dla listeria monocytogenes streak.Przenieść pełną pętlę z probówki z pożywką wzbogacającą na dwie płytki z agarem Brilliance Listeria; inkubować płytki w temperaturze 35 °C przez 22 do 26 godzin, a następnie sprawdzić, czy pojawiły się niebiesko-zielone kolonie. Ten zestandaryzowany protokół przetestowano na 100 dzikich muchach odłowionych z obszarów kontenerów na odpady w 10 restauracjach miejskich.Przedstawiono tutaj odsetek muszek, u których potwierdzono obecność patogenów docelowych. 22% z kanałów elementarnych i 8% z powierzchni ciała dawały wynik dodatni dla co najmniej jednego z trzech ocenianych patogenów przenoszonych przez żywność.Ogólna obecność bakterii przenoszonych przez żywność w kanale pokarmowym much była znacznie wyższa niż na powierzchni ciała. Częstość występowania gatunków kob backer na powierzchni ciała i w kanałach pokarmowych much była statystycznie wyższa niż częstość występowania salmonella i tarica oraz listeria monocytogenes. Jednakże, nie zaobserwowano różnic statystycznych podczas przeprowadzania porównań parzystych między powierzchnią ciała a kanałami pokarmowymi much dla każdego patogenu bakteryjnego po jego rozwoju.Technika ta utorowała drogę innym specjalistom w dziedzinie badań nad ogniskami chorób przenoszonych drogą pokarmową do przesiewowego badania pojedynczych much pod kątem obecności patogenów bakteryjnych oraz do gromadzenia większej ilości informacji o mechanizmach rozprzestrzeniania się drobnoustrojów pokarmowych. Podczas wykonywania niniejszej procedury należy pamiętać, że potwierdzenie wyników dodatnich PCR jest częścią standardowej procedury operacyjnej wielu laboratoriów i w celach regulacyjnych zaleca się wyizolowanie kultury do potwierdzenia po zakończeniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie szczepu bakteryjnego patogenu pokarmowego przenoszonego przez muchę, można zastosować inne metody, takie jak yp, fingerprinting DNA lub sekwencjonowanie całego genomu.

detection-of-foodborne-bacterial-pathogens-from-individual-filth-flies

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Wykrywanie chorobotwórczych patogenów przenoszonych z pożywieniem z pojedynczych much gnijących

Źródło: Dodge, R., et al. Szybkie liczenie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanej do mikrobiomu Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii związanych z jelitami u much Drosophila przy użyciu podejścia opartego na seryjnym rozcieńczaniu i posiewaniu. Homogenizowane próbki much zawierające bakterie jelitowe są seryjnie rozcieńczane, posiewane na agarze i inkubowane, aby umożliwić wzrost...

Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie bakterii związanych z jelitami u much Drosophila

Źródło: Siva-Jothy, J. A. i inni. Infekcja bakteryjna jamy ustnej i wypadanie u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje infekcję jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi. Obejmuje przygotowanie fiolek z infekcją oraz przenoszenie głodnych much w celu umożliwienia spożycia bakterii. Procedura obejmuje kolonizację jelit, następnie sterylizację powierzchniową i homogenizację much. Na koniec pokazuje ilościowe określenie wewnętrznego obciążenia bakteryjnego...

Zakażenie jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi

Źródło: Pava-Ripoll i in. Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność u pojedynczych much. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje metodę opartą na PCR, która wzmacnia docelowe DNA bakterii z wzbogaconych próbek much za pomocą tabletek specyficznych dla patogenów, umożliwiając wykrywanie fluorescencji w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia w celu potwierdzenia obecności patogenów przenoszonych przez żywność u poszczególnych owadów.

Wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność na podstawie wzbogaconych próbek much na PCR

Ten film demonstruje technikę infekowania Drosophila poprzez wprowadzenie bakterii chorobotwórczej bezpośrednio do ich jamy ciała. Metoda ta omija bariery nabłonkowe i inne pasywne mechanizmy obronne, pozwalając na indukcję infekcji ogólnoustrojowej. Po zakażeniu wynikającą z zakażenia odpowiedź immunologiczną ocenia się poprzez monitorowanie śmiertelności much i przeprowadzanie dalszych testów.

Technika septycznego nakłuwania szpilek w celu wprowadzenia ogólnoustrojowej infekcji bakteryjnej u much

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Ogólnym celem tego badania było pokazanie potencjalnego mechanizmu zanieczyszczenia krzyżowego patogenu Listeria monocytogenes przenoszonego przez żywność w sklepie delikatesowym. Metodologia ta może być stosowana w wielu różnych środowiskach do śledzenia zanieczyszczenia patogenami.

Śledzenie skażenia mikrobiologicznego w środowiskach handlu detalicznego za pomocą proszku fluorescencyjnego - przykład środowiska delikatesowego w handlu detalicznym

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Zwiększenie wykrywalności niedojrzałych muszek owocowych tefrytów na polu może w porę uruchomić działania mające na celu wyeliminowanie populacji tych niszczycielskich szkodników. Wykrywanie larw w późnym stadium rozwoju jest szybsze i dokładniejsze w przypadku rozdrabniania owoców żywiciela w torbie i przepuszczania miąższu przez szereg sit, niż podczas ręcznego cięcia i kontroli wzrokowej.

Przesiewanie miazgi owocowej w celu wykrycia niedojrzałych muszek owocowych Tephritid na polu

Poznaj metodę PCR do wykrywania patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność z pojedynczych much brudnych. Technika ta umożliwia szybkie izolowanie Cronobacter spp., Salmonella enterica i Listeria monocytogenes.

Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność przez pojedyncze muchy brudne

Przeglądaj więcej filmów