Zabieg chirurgiczny resekcji żebra myszy: model do naprawy kości długich na dużą skalę

Celem niniejszej procedury jest wykonanie rozległej resekcji w kostnej części żebra jako modelu do naprawy szkieletu. Jest to realizowane poprzez wykonanie i otwarcie nacięcia skóry po stronie bocznej zwierzęcia. Drugim krokiem jest odsłonięcie kości żebra, która ma zostać usunięta.

Następnie usuwa się fragment kości żebra wraz z otaczającą go osłonką tkanki łącznej lub okostną, bądź pozostawiając okostną na miejscu. Ostatnim krokiem jest zamknięcie nacięć i umożliwienie zwierzęciu rekonwalescencji. W rezultacie ten model naprawy kości może być wykorzystany do wykazania zdarzeń komórkowych i molekularnych, które zachodzą podczas zakrojonej na szeroką skalę regeneracji szkieletu.

W przypadku ssaka wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ posługiwanie się narzędziami chirurgicznymi wymaga precyzji, a powodzenie zabiegu zależy od znajomości rozmieszczenia poszczególnych tkanek. Procedurę zaprezentują Marissa Roar i Nikita Tripper, oboje doktoranci w moim laboratorium. Po przygotowaniu pola operacyjnego oraz niezbędnych sterylnych narzędzi i materiałów, należy wprowadzić zwierzę w stan narkozy, umieszczając mysz w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem.

Po znieczuleniu myszy należy nałożyć maść do oczu i potwierdzić głębokość znieczulenia. Po uciśnięciu palca u stopy nie powinna wystąpić żadna reakcja. Umieść mysz na podkładce grzewczej lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie na stole mikroskopu dissectingowego, kierując stożektęwii węża do podtrzymywania znieczulenia na nos myszy.

Upewnij się, że mysz znajduje się w pozycji bocznej. Dostosuj stężenie izofluranu do poziomu od 2 do 3% w celu podtrzymania narkozy i monitoruj częstotliwość oddechów. Następnie wstrzyknij buprenorfinę podskórnie za pomocą igły o rozmiarze 25 G.

W przypadku zapobiegawczego uśmierzania bólu pooperacyjnego może wystąpić drżenie nogi, co jest normalną reakcją. Najpierw należy wybrać odpowiednie żebro, badając palcem od najbardziej rostralnego żebra, które liczone jest jako numer jeden. W tym filmie zostanie usunięta część żebra nr 10.

Ogolić obszar nad żebrem, a następnie oczyścić go jodopowidonem, a następnie trzykrotnie izopropanolem. Po wykonaniu dwucentymetrowego nacięcia przez skórę, mięśnie i warstwy tłuszczu nad żebrem przeznaczonym do wycięcia, wprowadzić wszystkie trzy warstwy do rozwieraka, aby odsłonić pole operacyjne przy jednoczesnym zminimalizowaniu wielkości nacięcia. Następnie użyć skalpela pięciomilimetrowego, aby przeciąć mięśnie międzyżebrowe nad żebrem w miejscu oddalonym o 5 mm proksymalnie od stawu żeberno-mostkowego, gdzie żebro nie jest tak mocno zakrzywione. Następnie ostrożnie oddzielić mięsień od kości za pomocą pęsety z cienkim końcem.

Aby w następnym kroku wykonać resekcję przy jednoczesnym zachowaniu okostnej u zwierzęcia, należy naciąć okostną wzdłuż długości żebra. Następnie, używając pęsety z cienkimi końcówkami, bardzo ostrożnie oddzielić delikatną okostną bocznie od leżącej pod nią kości. W razie potrzeby zmierzyć obszar resekcji przy użyciu okularnika mikroskopu lub przymiaru.

Następnie za pomocą precyzyjnych mikronożyczek wykonaj przekrój poprzeczny przez kość. Na jednym końcu ostrożnie oddziel kość od okostnej, a następnie niezwłocznie odetnij drugi koniec. Usunięte żebro umieść w 4%paraldehydzie do późniejszej analizy.

Jeśli w wyniku przecięcia kości wystąpi krwawienie, należy uciskać przecięty koniec za pomocą patyczka z watką przez cztery do pięciu sekund, aby zatamować krwawienie. Aby zamknąć nacięcie, należy zaszyć mięśnie międzyżebrowe nad pozostałą pochewką okostnej, stosując trzy lub 4 szwy przerywane 9 0. Szwy należy umieścić bezpośrednio nad przeciętymi końcami żebra, aby służyły jako markery miejsca operacji.

Usuń retraktor, a następnie zaszyj znajdujące się powyżej mięśnie i tkankę tłuszczową za pomocą przerywanych szwów 9-0. Szyj każdą warstwę oddzielnie u myszy z szczególnie grubymi warstwami mięśni lub tłuszczu. Zamknij skórę za pomocą 4 do 5 szwów 7-0, a następnie zabezpiecz nacięcie klejem tkankowym.

Ściśnięcie krawędzi za pomocą dużych pęsety. Powoli odstawiamy mysz od izofluranu, dostosowując jego stężenie do 1% przez kilka minut, a następnie wyłączamy dopływ izofluranu. Umieść mysz pod lampą grzewczą i pozostaw do czasu odzyskania przytomności.

Po odzyskaniu przytomności oraz przez cały okres gojenia mysz powinna poruszać się i chodzić normalnie, nie wykazując oznak stresu. Gdy miejsce nacięcia wyschnie, umieść mysz w czystej klatce z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Samice mogą być przetrzymywane razem, natomiast samce muszą być trzymane osobno, aby zapobiec walkom; zapewnij pooperacyjną kontrolę bólu, w tym podawanie buprenorfiny w formie żelowej doustnie w dawce 0,5 mg/kg co 12 godzin przez 48 godzin.

Podawanie doustne nie wymaga unieruchamiania zwierzęcia, co mogłoby spowodować ból w obrębie klatki piersiowej. Na obrazie przedstawiono resekcję żebra o długości 4,5 milimetra, pobraną bezpośrednio po operacji. Nie pozostawiono żadnych fragmentów kostnych.

Próbkę barwiono czerwoną zaryną i przejrzystowano w 80% glicerolu. Grot strzałki wskazuje miejsce uciętych końców. Jest to usunięty fragment żebra z klatki piersiowej przedstawionej na poprzednim obrazie, bez przytwierdzonego okostnej.

Przedstawiony tutaj przekrój histologiczny barwiony hematoksyliną i eozyną obrazuje, że do kości przylega minimalna ilość okostnej, co wskazuje żółty grot strzałki po lewej stronie, natomiast po prawej stronie okostna jest nieobecna. Żółta gwiazdka oznacza jamę szpiku kostnego. Na tym obrazie widoczny jest usunięty fragment żebra z wciąż przylegającą okostną, a ten przekrój histologiczny pokazuje nienaruszoną okostną pokrywającą kość, co zaznaczono żółtym nawiasem.

Żółta gwiazdka ponownie wskazuje jamę szpiku kostnego. Ten obraz przedstawia preparat szkieletowy po dwóch miesiącach gojenia po resekcji z zachowanym okostną wewnątrz myszy, gdzie można zaobserwować całkowitą regenerację obszaru. Ten przekrój histologiczny wspomnianego preparatu szkieletowego wykazuje odtworzenie blaszkowych ścian kostnych oraz jamy szpiku kostnego.

Na tym obrazie przedstawiono preparat szkieletowy po trzech miesiącach gojenia. Po usunięciu fragmentu żebra oraz otaczającego go okostnej, w miejscu cięcia widocznym po lewej stronie panelu, zaobserwowano jedynie minimalną regenerację. Żółta grota strzałki wskazuje staw chocos.

Ten przekrój histologiczny wcześniej pokazanego preparatu szkieletowego przedstawia ziarninowanie, tkankę tłuszczową oraz komórki mięśniowe wypełniające miejsce resekcji. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie poniżej jednej godziny, pod warunkiem prawidłowego przestrzegania niniejszej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób przebiegu wielkoskalowej regeneracji chrząstki, można zastosować inne metody, np. wykonanie resekcji w części chrzęstnej żebra.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać resekcję w kostnej części żebra w celu badania regeneracji układu szkieletowego.