Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka
2 lutego 2015
Prezentujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do oka szczura, w celu modelowania jaskry. Prowadzi to do silnego wzrostu ciśnienia i rozległej śmierci neuronów. Protokół ten jest łatwy do wykonania, nie wymaga wielokrotnych wstrzyknięć i zapewnia stabilny, długotrwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Celem tej procedury jest wywołanie podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego u szczura za pomocą wstrzyknięcia mikrosfer paramagnetycznych do przedniej komory oka. Najpierw umieść pierścień magnetyczny wokół oka znieczulonego zwierzęcia, umyj mikrosfery magnetyczne, zamieszaj je ponownie w roztworze, a następnie załaduj je do strzykawki. Następnie wstrzyknij mikrosfery magnetyczne do przedniej komory oka.
Zdejmij pierścień magnetyczny podczas odzyskiwania. Dane procesowe uzyskane z analiz histologicznych, takich jak barwienie tunelowe lub barwienie nerwu wzrokowego, mogą mierzyć śmierć komórek zwojowych siatkówki, która wynika ze zwiększonego ciśnienia wewnątrzgałkowego. Umyj wysterylizowane kulki mikrosfery magnetycznej o grubości ośmiu mikronów trzykrotnie w jednym mililitrze buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka za pomocą reus, zawieszając i odwirowując w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut.
Następnie ponownie zawiesić w 0,5 mililitra HBSS na 30 miligramów na mililitr roztworu. Teraz, używając sonometru odbicia skalibrowanego do użytku w oku szczura, wykonaj pięć podstawowych pomiarów IOP u obudzonych zwierząt. Po znieczuleniu szczury nakładają maść oczną na nieocenione oko przeciwległe, aby utrzymać je wilgotne.
Podczas znieczulenia należy zastosować 0,5% chlorowodorek propanu, środek znieczulający miejscowo do operowanego oka. Następnie przemyj to oko 5% jodowidonem w wodzie. Po pięciu minutach odetnij jod powidonu i przemyj oko 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
Utrzymuj oko wilgotne podczas znieczulenia dzięki regularnemu stosowaniu sterylnej soli fizjologicznej. Teraz umieść magnes steroidowy wokół oka, aby zminimalizować ryzyko urazu tęczówki i zminimalizować utratę koralików. Ustawić igłę stycznie do powierzchni rogówki jak najbardziej równolegle do tęczówki.
Kontynuuj wstrzykiwanie 25 mikrolitrów po 30 miligramów na mililitr, napromieniowane promieniami gamma mikrosfery magnetyczne do przedniej komory. Pozostawić igłę na miejscu przez jedną minutę po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że koraliki osiądą w kącie rogówki IOC, aby utrudnić wodny drenaż z siatki beleczkowej. Lekko ustaw igłę pod kątem kilka sekund po tym, jak kulki początkowo osiadyszą, aby umożliwić pewien wyciek wody wodnej i zminimalizować przejściowy wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Aby zapewnić dalsze stosowanie igły w oddzielnych procedurach, należy przepłukać igłę PBS. Następnie 70% etanol, a następnie na tym etapie woda destylowana. W razie potrzeby wyjmij magnes i użyj go do wciągnięcia koralików w obszary o niepełnym pokryciu.
Pozostawić magnes w okolicy oka na kolejne 10 minut po wstrzyknięciu. Aby upewnić się, że koraliki dobrze osadzają się w tęczowym kącie rogówki. Znieczulenie odwrotne przy użyciu 0,25 miligrama na kilogram chlorowodorku ESOL.
Podawać miejscowo 0,5 chlorowodorku propanu w celu znieczulenia i maści chloramfenikolowej, aby zapobiec infekcji. Pozostaw zwierzęta do regeneracji na macie grzewczej, dopóki nie odzyskają ruchu. Następnie przenieś do ciepłego pudełka.
Użyj przeciwległego oka jako nieocenionej kontroli. Powtarzaj pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego co dwa do trzech dni po podaniu kulek, a następnie co dwa do trzech dni, określ kryteria włączania oczu do badań, w tym ciśnienie wewnątrzgałkowe jest podwyższone powyżej przeciwległego ciśnienia kontrolnego o pięć milimetrów słupa rtęci, a ciśnienie wewnątrzgałkowe nie przekracza 60 milimetrów słupa rtęci, w których ciśnienie powraca do wartości wyjściowej po upływie tygodnia od wstrzyknięcia, nie powinny być uwzględniane w badaniach. Możliwe jest jednak ponowne wstrzyknięcie kulek do oczu, które w razie potrzeby nie rozwijają wysokiego ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Napraw wypreparowane oczy i nerw wzrokowy w 4% paraldehydzie, oceniając uszkodzenie neuronu siatkówki przez barwienie tunelu i uszkodzenie nerwu wzrokowego przez niebieski toine. Barwienia. W tym eksperymencie wstrzyknięcie kulek magnetycznych w tęczówkę rogówki konsekwentnie powodowało długotrwały i silny wzrost ciśnienia. Co więcej, wzrost ciśnienia utrzymywał się przez cały czas trwania eksperymentu.
Średnie ciśnienie wewnątrzgałkowe uśrednione na całej długości eksperymentu dla oczu kontrolnych bez wstrzykiwania kulek wynosiło 19,7 plus minus 0,3 milimetra rtęci i 40,5 plus minus 2,8 milimetra rtęci dla oczu z wstrzykiwanymi kulkami. Dodatkowo szczytowe ciśnienie wewnątrzgałkowe wzrosło z 22,8 plus minus 0,3 milimetra rtęci do 49,9 plus minus 2,3 milimetra słupa rtęci, aby określić, czy wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego prowadzi do śmierci komórek zwojowych siatkówki. Barwienie tunelowe wykonywano na siatkówkach, a histologię na poprzecznych odcinkach nerwu wzrokowego w siatkówce.
Zaobserwowaliśmy wzrost barwienia tunelowego w oczach z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym, w które wstrzyknięto krople. Liczba jąder apoptotycznych wzrosła około 15-krotnie od przeciwległych siatkówk nadciśnieniowych kontrolnych, zgodnie z oczekiwaniami w oczach, w które wstrzykiwano kulki magnetyczne bez ciśnienia, liczba komórek tunelowo-dodatnich nie różniła się znacząco od tych z kontrolnych, którym wstrzyknięto unin. Dalsze badania patologii nerwu wzrokowego w modelu jaskry wykazały nagromadzenie błękitu odynowego w wielu aksonach, co wskazuje na degenerację tych procesów komórkowych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę indukowania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) u szczurów poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka, co służy jako model jaskry. Procedura ta prowadzi do znacznego wzrostu ciśnienia oraz obumarcia neuronów, zapewniając stabilny i długotrwały wzrost IOP bez konieczności powtarzania iniekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Oftalmologia
- Badania nad jaskrą
Wstęp
- Podwyższone IOP jest głównym czynnikiem ryzyka jaskry.
- Obecne modele często wymagają wielu interwencji.
- Magnetyczne mikrosfery oferują nowatorskie podejście do indukowania IOP.
- Zrozumienie śmierci neuronów w jaskrze jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
Cel badania
- Utworzenie wiarygodnego modelu do badania jaskry u szczurów.
- Ocena wpływu podwyższonego IOP na śmierć komórek zwojowych siatkówki.
- Ocena długoterminowych efektów wstrzyknięć mikrosfer magnetycznych na IOP.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie mikrosfer paramagnetycznych do oka szczura.
- Pomiar IOP za pomocą tonometru rebound.
- Analiza histologiczna uszkodzeń siatkówki i nerwu wzrokowego.
- Ocena apoptycznej śmierci komórek za pomocą barwienia TUNEL.
Główne wyniki
- Znaczący i utrzymujący się wzrost IOP w oczach po wstrzyknięciu kulek.
- Zwiększona śmierć komórek zwojowych siatkówki skorelowana z podwyższonym IOP.
- Histologiczne dowody na degenerację nerwu wzrokowego.
- Oczy kontrolne utrzymywały prawidłowe poziomy IOP przez cały okres badania.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie modeluje jaskrę u szczurów.
- Podwyższone IOP prowadzi do znacznego uszkodzenia neuronów.
- Model ten może być wykorzystywany w przyszłych badaniach nad jaskrą oraz w testowaniu terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda dostarcza niezawodnego i powtarzalnego modelu indukcji trwałego podwyższenia ciśnienia wewnątrzgałkowego u szczurów, umożliwiając badania mechanistyczne patofizjologii jaskry. Wspiera ona walidację celów poprzez powiązanie wzrostu ciśnienia ze śmiercią komórek zwojowych siatkówki oraz degeneracją nerwu wzrokowego, co daje wartość prognostyczną w przesiewowych badaniach nad terapiami neuroprotekcyjnymi. Prostota modelu i długotrwały efekt ograniczają zmienność eksperymentalną, co ułatwia interdyscyplinarną współpracę w procesach odkrywania nowych leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie związku przyczynowo-skutkowego między ciśnieniem wewnątrzgałkowym (IOP) a jaskrą poprzez indukcję trwałego podwyższenia ciśnienia.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójny fenotyp do oceny oddziaływania na cele w szlakach patogennych.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celów zaanganowanych w regulację sieci śródbłonowej kąta defraudacyjnego oraz dynamikę cieczy wodnistej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wyniki IOP i odczyty histopatologiczne w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne pomiary bazowego i podwyższonego IOP dla kampanii przesiewowych związków.
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę zależności dawka-odpowiedź środków obniżających IOP poprzez podłużny monitoring ciśnienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla kluczowe patologie jaskry, w tym apoptozę komórek zwojowych siatkówki oraz degenerację aksonów nerwu wzrokowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przedkliniczną ocenę związków neuroprotekcyjnych i modulujących IOP w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez analizę korelacyjną poziomów IOP i wskaźników śmierci neuronalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkrywania leków w jaskrze, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, co jest możliwe dzięki jego zdolności do indukowania mierzalnego wzrostu IOP oraz wtórnej neurodegeneracji.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów zależnych od IOP w patologii siatkówki i nerwu wzrokowego.
- Przesiewanie: Wykorzystuje IOP jako biomarker farmakodynamiczny do oceny wpływu związków na odpływ cieczy wodnej.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów IOP oraz punktów końcowych histopatologicznych do analizy porównawczej stanów.
- Badania translacyjne: Łączy podwyższenie IOP z neurodegeneracją istotną dla ludzi, wspierając ciągłość translacyjną.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę indukcji IOP, którą można dostosować do różnych modeli gryzoni w badaniach podłużnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w kwestii związku przyczynowo-skutkowego między IOP a jaskrą poprzez trwałe podwyższenie ciśnienia i neurodegenerację.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje powtarzalność dzięki standaryzowanym technikom wstrzykiwania mikrosfer oraz pozycjonowania magnetycznego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję zmienności biologicznej w badaniach skuteczności opartych na IOP.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii jaskry z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile obniżania IOP oraz neuroprotekcji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu operacji okulistycznych u gryzoni oraz pomiaru IOP za pomocą tonometrii reboundowej.
- Zależne od dostępu do sterylnych mikrosfer magnetycznych, sprzętu do sterylizacji oraz odczynników do barwienia histologicznego.
- Wymaga standaryzacji kryteriów podwyższenia IOP oraz protokołów oceny histologicznej pomiędzy zespołami.
- Uwzględnia konieczność dostosowania metody do anatomii oka myszy i mniejszej objętości komory przedniej.
- Ograniczone koniecznością monitorowania pooperacyjnego w celu wykluczenia osobników z przejściową reakcją ciśnienia i zapewnienia spójności modelu.
