Name: Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę indukowania jaskry u szczurów przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Technika ta umożliwia trwałe podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego i badanie śmierci komórek zwojowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować doktorowi Peterowi Munro za pomoc przy cięciu nerwu wzrokowego. Badanie to było wspierane przez Radę Badań Medycznych (G0901303), a częściowo przez Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight i Moorfields Special Trustess.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zostały zatwierdzone zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (<a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a>, ostatni dostęp 10czerwca 2014) oraz Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych (<a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a>, ostatni dostęp 10 czerwca 2014r.).
1. Indukcja nadciśnienia ocznego
<ol>
	<li>Wywołanie eksperymentalnej jaskry poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) poprzez jednostronne wstrzyknięcie mikrosfer paramagnetycznych do przedniej komory szczurów rasy Brown Norway, w oparciu o metodę Samsela i wsp.3 Inne pigmentowane szczury mogą być odpowiednie, chociaż musiałyby one najpierw zostać zatwierdzone przez użytkownika.</li>
	<li>Trzymaj 250-300 g samic szczurów rasy Brown Norway w stałym środowisku o słabym oświetleniu (40-60 luksów), aby zminimalizować dobowe wahania IOP7, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum.</li>
	<li>Wykonaj podstawowe pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego u obudzonych zwierząt8 przed znieczuleniem i wstrzyknięciem kulek, używając tonometru odbicia skalibrowanego do stosowania w oku szczura9. IOP przyjmuje się jako średnią z pięciu odczytów.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów za pomocą 37,5 mg/kg ketaminy i 0,25 mg/kg chlorowodorku medetomidyny podawanego dootrzewnowo. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruchy tylnej stopy zwierzęcia, przed zastosowaniem jodu powidonu (patrz krok 1.5) i wstrzyknięciem kulek (patrz krok 1.8). Podawać 0,5% chlorowodorek proparakainy na działanie przeciwbólowe. 
	UWAGA: Nie rozszerzaj źrenicy na żadnym etapie. Pomoże to koralikom lepiej osadzić się w kącie tęczówki i zapobiegnie wiązaniu się z soczewką. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki na nieoperowanym oku przeciwległym.</li>
	<li>Przemyć oko operacyjne 5% jodowidonem w wodzie na10-5 minut przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Po 5 minutach odsączyć jod powidonu za pomocą sterylnej gazy i przemyć oko 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj oko wilgotne podczas znieczulenia dzięki regularnemu stosowaniu sterylnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Umieść magnes toroidalny wokół oka.</li>
	<li>Wstrzyknąć 25 μl roztworu zawierającego 30 mg/ml wysterylizowanych promieniowaniem gamma mikrosfer magnetycznych o wielkości 8 μm w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do komory przedniej, używając igły ze skosem 33 G.
	<ol>
		<li>Aby przygotować kulki, przemyć przez ponowne zawiesinie, a następnie odwirować 3 razy przy 10 000 x g przez 5 minut z 1 ml HBSS, przed przygotowaniem końcowego roztworu 30 mg/ml. Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas.</li>
		<li>W przypadku wstrzykiwania należy uważać, aby nie wkładać igły do tęczówki, aby zminimalizować ryzyko urazu tęczówki. Można temu zapobiec, ustawiając igłę stycznie do powierzchni rogówki, jak najbardziej równolegle do tęczówki. Pomoże to również zminimalizować utratę ściegu w miejscu wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Wstrzykiwaj koraliki w szybkim tempie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wokół kąta tęczówki i rogówki, co ma kluczowe znaczenie dla podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego. Dodatkowo koraliki, igły i pierścienie magnetyczne należy przechowywać oddzielnie, aby kulki nie tworzyły skupisk, co utrudniało ich załadowanie do strzykawki i wstrzyknięcie, a igła nie uległa namagnesowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić igłę na miejscu przez 1 minutę po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki osiądą w kącie tęczówki i rogówki, aby utrudnić wodny drenaż z siatki beleczkowej. Lekko pochyl igłę po początkowym osiadaniu koralików, aby umożliwić pewien wyciek wody wodnej, aby zminimalizować przejściowy wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego. Pod koniec operacji należy przepłukać igłę najpierw solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), następnie 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną, aby zapewnić dalsze użycie igły w oddzielnych procedurach. Alternatywnie można użyć jednorazowych igieł, jeśli dostępna jest odpowiednia kombinacja manometru i strzykawki. Opcjonalnie: igły mogą być ostrzone za pomocą ukosowarki, aby przedłużyć ich użytkowanie.</li>
	<li>Na tym etapie, jeśli to konieczne, usuń magnes i użyj go do narysowania koralików w obszarach o niepełnym pokryciu.</li>
	<li>Pozostaw magnes na miejscu wokół oka przez kolejne 10 minut po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki dobrze przylegają do kąta tęczówkowo-rogówkowego.</li>
	<li>Znieczulenie odwrotne przy użyciu 0,25 mg/kg chlorowodorku atypemezolu.</li>
	<li>Podawać chloramfenikol lub inną maść z antybiotykiem, na przykład gentamycynę lub terramycynę miejscowo, aby zapobiec infekcji, oraz 0,5% chlorowodorek proparakainy do znieczulenia. Pozostaw zwierzęta do regeneracji na macie grzewczej, aż odzyskają ruch, a następnie przenieś do ciepłego pudełka i zaopatrz je w dodatkowe składniki odżywcze, takie jak suplement diety lub nawilżona regularna dieta, aż do całkowitego powrotu do zdrowia. Zwierzętom wykazującym objawy bólu należy podać anieból ogólnoustrojowy lub miejscowy po 24 godzinach od zabiegu. Jeśli objawy te utrzymują się pomimo leczenia, zwierzęta powinny zostać poddane humanitarnemu ubojowi.</li>
	<li>Użyj przeciwległego oka jako nieobsługiwanego elementu sterującego.</li>
	<li>Wykonuj pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego co 2-3 dni po podaniu kulek, a następnie co 2-3 dni za pomocą tonometru odbicia skalibrowanego do użytku w oku szczura9.</li>
	<li>Kryteriami włączenia oczu do badań mogą być: jeśli 1) ciśnienie wewnątrzgałkowe jest podwyższone powyżej przeciwległego ciśnienia kontrolnego o 5 mmHg i 2) nie przekracza 60 mmHg.</li>
	<li>Oczy, w których ciśnienie powraca do wartości wyjściowej (zwykle w ciągu 1 tygodnia po wstrzyknięciu) nie powinny być uwzględniane w badaniach, jednak w razie potrzeby możliwe jest ponowne wstrzyknięcie kulek do oczu, u których nie rozwija się wysoka liczba soczewek wewnątrzgałkowych.</li>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO2 na koniec eksperymentu.</li>
	<li>Przeprowadź sekcję oczu i nerwów wzrokowych i utrwal 4% paraformaldehydu (PFA) na noc w celu dalszej analizy histologicznej.</li>
</ol>
2. Ocena uszkodzeń neuronów siatkówki za pomocą barwienia TUNEL
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo komórki apoptotyczne w całej siatkówce, należy użyć końcowego testu znakowania dUTP za pośrednictwem deoksynukleotydylotransferazy (TUNEL), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyciąć siatkówkę z muszli ocznej, przemyć przez 3 x 5 minut 0,3% Triton X-100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (T-PBS).</li>
	<li>Przepuszczalność tkanki w 3% T-PBS przez 2 godziny.</li>
	<li>Wstępnie zrównoważyć siatkówki w buforze równowagi przez 10 minut, przed inkubacją w roztworze reakcyjnym TUNEL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Myć chusteczkę przez 3 x 5 minut w 0,3% T-PBS, spłukać w 0,3% T-PBS zawierającym 5 μM DAPI i zamontować płasko w podłożu montażowym.</li>
	<li>Aby określić ilościowo jądra dodatnie TUNEL, użyj mikroskopu konfokalnego, aby pobrać 10 μm z-stacków przez warstwę komórek zwojowych w 20-krotnym powiększeniu. Wykonaj 3 zdjęcia na każdym z 4 płatków, w miejscach blisko nerwu wzrokowego, na środkowym obrzeżu i na dalekim obrzeżu siatkówki, co daje w sumie 12 obrazów na całe mocowanie, pobierając próbki około 7000 komórek. Kryteria morfologiczne odróżniały komórki nieneuronalne (śródbłonek i glej) od komórek neuronalnych.</li>
	<li>Wybierz obszary do obrazowania przy użyciu tylko kanału DAPI i zamaskuj badaczy w grupach terapeutycznych.</li>
</ol>
3. Ocena uszkodzenia nerwu wzrokowego za pomocą barwienia błękitem toluidynowym
<ol>
	<li>Nerwy wzrokowe naprawić przez noc w roztworze Karnovsky'ego w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Traktuj próbki przez 2 godziny w 1% (w/v) tetratlenku osmu, a następnie odwodnij w 100% etanolu.</li>
	<li>Inkubuj nerwy wzrokowe w tlenku propylenu przez 30 minut i umieść na noc w mieszaninie tlenku propylenu i araldytu w proporcji 50:50.</li>
	<li>Zmienić ten roztwór na 100% araldyt, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Wyciąć półcienkie odcinki (o grubości 0,75 mm) i wybarwić 1% błękitem toluidynowym/boraksem (TB) w 50% etanolu przed badaniem pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeprowadzaj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania statystycznego. Dwukierunkowa ANOVA z testem post-hoc Newmana-Keula może być wykorzystana do obliczenia istotności statystycznej dla zmian IOP w czasie.</li>
	<li>Wartość p mniejsza niż 0,05 może być uznana za znaczącą.</li>
</ol>

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%3A+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li>
<li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li>
<li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li>
<li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li>
<li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li>
<li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+application+of+povidone-iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li>
<li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li>
</ol>

David T. Shima jest pracownikiem firmy Hofmann-La Roche w Szwajcarii. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego u szczura poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Ta metoda jest prosta do przeprowadzenia i wymaga niewielkiej wiedzy chirurgicznej lub godzin praktyki i udoskonalenia. Ponadto procedura jest skuteczna; rzadko wymaga więcej niż jednego wstrzyknięcia kulek w celu wywołania silnego, solidnego wzrostu ciśnienia (około 10% częstości ponownego wstrzykiwania). Może to zapewnić przewagę nad istniejącymi indukowalnymi metodami, takimi jak technicznie trudny model stwardnienia żył biskupich11 lub protokół fotokoagulacji laserowej6, który może wymagać wielu procedur w celu utrzymania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Aby jednak metoda odniosła sukces, należy podjąć kilka małych krytycznych kroków. Po pierwsze, przydatne jest użycie magnesu w kształcie toroidalnym do przyciągania koralików do kąta tęczówkowo-rogówkowego. Ten krok jest modyfikacją oryginalnego protokołu, w którym koraliki zostały wstrzyknięte do przedniej komory, a następnie przesuwane odręcznie wokół oka3. Zastosowanie magnesu toroidalnego oznacza, że mikrosfery powinny osiadać równomiernie wokół kąta, wymagając minimalnej ręcznej redystrybucji. Po drugie, szybkość wtrysku powinna być szybka – zbyt wolna, a kulki będą gromadzić się głównie po jednej stronie kąta, co prowadzi do niepełnego pokrycia i potencjalnie braku wzrostu ciśnienia. Ogólnie rzecz biorąc, metoda jest na tyle prosta, że użytkownik może łatwo wprowadzić modyfikacje do protokołu, takie jak zmiana rozmiaru lub objętości cząstek mikrosfery, być może w celu zmiany stopnia podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego.
Jednak jedną z potencjalnych wad tej metody jest to, że ma się niewielką kontrolę nad rozległością nadciśnienia, które w około 5-10% obserwowanych przez nas przypadków wzrosło powyżej 60 mmHg. Nadmierny wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego może być bardzo destrukcyjny dla tkanki siatkówki i może utrudnić badanie mechanizmów i biologii śmierci komórki. Jednak metoda ta prowadzi do spójnej patologii neuronalnej, zarówno w siatkówce, jak i nerwie wzrokowym, którą można manipulować farmakologicznie12. To może sprawić, że model ten będzie atrakcyjny dla opracowywania nowych terapii w leczeniu jaskry. Dodatkowo, ponieważ koraliki są skierowane do kąta tęczówkowo-rogówkowego, pozostawia to oś widzenia wolną do obrazowania siatkówki lub tarczy nerwu wzrokowego na żywo. Przewidujemy, że model ten zostanie zaadaptowany i wykorzystany do przyszłych zastosowań u innych gatunków, w tym u myszy.

Jaskra pierwotna to wyniszczająca choroba oczu, która dotyka około 60,5 miliona ludzi na całym świecie1, co może prowadzić do utraty wzroku i ślepoty zmieniającejżycie2. Badania nad mechanizmami chorobowymi i opracowywanie nowych metod leczenia jaskry są uzależnione od dobrych modeli choroby, które podsumowują niektóre cechy charakterystyczne patologii.
Prezentujemy tutaj model jaskry szczura oparty na metodzie Samsela i wsp.3 Ogólnym celem tej techniki jest zwiększenie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w oku poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory i skierowanie ich za pomocą pierścienia magnetycznego do kąta tęczówkowo-rogówkowego. Utrudnia to odpływ wody wodnistej, co zwiększa ciśnienie wewnątrzgałkowe, prowadząc do uszkodzenia neuronów i utraty komórek. Protokół został opracowany w celu zapewnienia prostszego, indukowalnego modelu jaskry.
Ten protokół może mieć pewne zalety w stosunku do istniejących technik. Dostępne są genetyczne modele myszy, takie jak DBA/2J, które nie wymagają procedur do zainicjowania; Mogą one jednak mieć nieprzewidywalny początek progresji choroby4. W przeciwieństwie do tego, modele indukowalne, z których większość opiera się na chirurgicznym podnoszeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u gryzoni, mają tę zaletę, że inicjacja może być kontrolowana przez użytkownika. Niektóre z tych metod mogą mieć swoje wady, w tym są trudne technicznie5 i mogą wymagać wielu procedur w celu utrzymania podwyższonego IOP6.
Dla kontrastu, metoda indukowalna opisana w tym manuskrypcie jest prostą, skuteczną i powtarzalną techniką, która powoduje stabilny, solidny wzrost ciśnienia, przy minimalnej potrzebie ponownego wstrzykiwania. Dodatkowo nie wymaga drogiego sprzętu, a do wykonania wymaga jedynie podstawowych umiejętności chirurgicznych. Protokół ten może być odpowiedni dla czytelników, którzy chcą stworzyć mniej wymagający technicznie model indukowalnej jaskry w swoim laboratorium.

<table><tbody><tr><td>250 - 300g samica brązowego Norwegii byłego szczura hodowlanego</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamina)</td><td>Fort Dodge Zdrowie zwierząt</td><td>BN1000118</td><td>37,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (chlorowodorek medetomidyny)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0,25 mg/kg</td></tr><tr><td>Jod powidonu</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% w H2O</td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej Minima</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Magnes toroidalny</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery magnetyczne</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G igła skośna</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Niestandardowa</td></tr><tr><td>strzykawka z końcówką Luer</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (chlorowodorek atypemozolu</td>) <td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0,25 mg/kg</td></tr><tr><td>Maść chloramfenikolowa</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Postęp w zrozumieniu patofizjologii i dostarczaniu nowych metod leczenia jaskry zależy od dobrych modeli zwierzęcych choroby. Przedstawiamy tutaj protokół podnoszenia ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) u szczura, poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Zastosowanie cząstek magnetycznych pozwala użytkownikowi na manipulowanie kulkami pod kątem tęczówki i rogówki, zapewniając w ten sposób bardzo skuteczną blokadę odpływu płynu z siatki beleczkowej. Prowadzi to do długotrwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, a ostatecznie do śmierci neuronów w warstwie komórek zwojowych (GCL), a także patologii nerwu wzrokowego, co obserwuje się u pacjentów z tą chorobą. Ta metoda jest prosta do wykonania, ponieważ nie wymaga maszyn, specjalistycznych umiejętności chirurgicznych ani wielu godzin ćwiczeń do doskonalenia. Co więcej, wzrosty ciśnienia są bardzo duże, a ponowne wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych nie jest zwykle wymagane, w przeciwieństwie do niektórych innych modeli wykorzystujących plastikowe kulki. Dodatkowo uważamy, że ta metoda jest odpowiednia do adaptacji do oka myszy.

Wstrzyknięcie kulek magnetycznych do kąta rogówkowo-tęczówkowego konsekwentnie wywoływało przedłużony i silny wzrost ciśnienia (Rysunek 1), który był wyraźnie obserwowalny w pierwszym punkcie czasowym, 3 dni po wstrzyknięciu. Ponadto wzrost ciśnienia utrzymywał się przez cały czas trwania eksperymentu, a choć nasz przebieg czasowy zakończył się w 18. dniu po wstrzyknięciu, inni autorzy zgłaszali, że podwyższone ciśnienie utrzymuje się długoterminowo3. Średnie IOP wyliczone dla całego okresu eksperymentu dla oczu kontrolnych, bez wstrzykniętych kulek, wynosiło 19,7 ± 0,3 mmHg, w porównaniu do 40,5 ± 2,8 mmHg dla oczu z wstrzykniętymi kulkami (P &lt;0,001). Dodatkowo szczytowe IOP wzrosło z 22,8 ± 0,3 mmHg do 49,9 ± 2,3 mmHg.
Aby ustalić, czy podwyższenie IOP prowadzi do śmierci komórek zwojowych siatkówki, przeprowadziliśmy barwienie TUNEL siatkówek oraz badanie histologiczne poprzecznych przekrojów nerwu wzrokowego (Rysunek 2). W siatkówce zaobserwowaliśmy wzrost barwienia TUNEL (Rysunek 2A) w oczach po wstrzyknięciu kulek z podwyższonym IOP. Liczba apoptotycznych jąder wzrosła około 15-krotnie: z 1,6 ± 0,5 komórki w przeciwległych kontrolach do 24,5 ± 0,5 komórki w siatkówkach nadciśnieniowych (Rysunek 2B; P &lt;0,05). Co więcej, w oczach, w których wstrzyknięto kulki magnetyczne, ale ciśnienie nie wzrosło (prawdopodobnie z powodu niepełnego zablokowania kąta przesieczno-rogówkowego), liczba komórek TUNEL-dodatnich nie różniła się istotnie od liczby w kontrolach niewstrzykniętych (P &gt;0,05). Sugeruje to, że śmierć komórek była związana ze wzrostem ciśnienia, a nie z bezpośrednią toksycznością mikrosfer magnetycznych. Na koniec zbadaliśmy patologię nerwu wzrokowego w modelu jaskry i zaobserwowaliśmy gromadzenie się błękitu toluidyny w wielu aksonach, co wskazywało na degenerację tych wypustek komórkowych (Rysunek 2C).
<img alt="Badanie ciśnienia wewnątrzgałkowego; wykres liniowy porównujący oko po wstrzyknięciu i oko kontrolne w ciągu 18 dni po wstrzyknięciu." src="/files/ftp_upload/52400/52400fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego przy użyciu mikrosfer magnetycznych. Wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do komory przedniej wywołało silny i znaczący wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w porównaniu z przeciwległymi kontrolnymi oczami, w których nie wykonano wstrzyknięcia. Jednostki na osi Y = milimetry słupa rtęci (mmHg). Dane = średnia ± SEM. * = P &lt;0.001; N = 12. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Foxton et al., Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390.
<img alt="Barwienie DAPI/TUNEL, detekcja apoptozy komórek siatkówki, wykres danych z jaskrą, analiza mikroskopowa." src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Podwyższenie IOP poprzez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do kąta rogówkowo-tęczówkowego wywołało śmierć neuronów w warstwie komórek zwojowych (GCL). (A) Reprezentatywne obrazy siatkówek z oczu kontrolnych (lewo) i z jaskrą (prawo), barwionych na jądra apoptotyczne metodą TUNEL (zielony; białe strzałki) i DAPI (niebieski), wskazujące na wzrost liczby jąder apoptotycznych wraz ze wzrostem IOP. (B) Ilościowe oznaczenie komórek TUNEL-dodatnich w GCL, pokazujące, że w oczach z podwyższonym IOP (środek) stwierdzono znacznie więcej komórek apoptotycznych w porównaniu z kontrolą (lewo). Z kolei w oczach po wstrzyknięciu kuleczek, w których ciśnienie nie wzrosło (prawo), nie zaobserwowano istotnego wzrostu barwienia TUNEL. Dane = średnia ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8. (C) Reprezentatywne obrazy barwienia nerwu wzrokowego, wykazujące wzrost akumulacji błękitu toluidyny (czarne strzałki) w uszkodzonych aksonach w jaskrze (prawo), czego nie zaobserwowano w oczach kontrolnych (lewo). Paski skali = 50 μm. Rycina została zmodyfikowana z Foxton et al., Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390.

Prezentujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do oka szczura, w celu modelowania jaskry. Prowadzi to do silnego wzrostu ciśnienia i rozległej śmierci neuronów. Protokół ten jest łatwy do wykonania, nie wymaga wielokrotnych wstrzyknięć i zapewnia stabilny, długotrwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Celem niniejszej procedury jest wywołanie podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego u szczura poprzez wstrzyknięcie paramagnetycznych mikrosfer do przedniej komory oka. W pierwszej kolejności należy umieścić pierścień magnetyczny wokół oka znieczulonego zwierzęcia, przemyć magnetyczne mikrosfery, ponownie zawiesić je w roztworze, a następnie pobrać do strzykawki. Następnie wstrzykuje się magnetyczne mikrosfery do przedniej komory oka.Zdejmij pierścień magnetyczny podczas procesu odzyskiwania. Dane procesowe uzyskane z analiz histologicznych, takich jak barwienie tunelowe lub barwienie nerwu wzrokowego, mogą służyć do pomiaru śmierci komórek zwojowych siatkówki wynikającej ze zwiększonego ciśnienia wewnątrzgałkowego. Umyj wysterylizowane magnetyczne mikrosfery o średnicy 8 µm trzykrotnie w 1 mL zbuforowanego roztworu soli Hanksa poprzez ponowne zawieszenie i wirowanie przy 10 000 ×g przez pięć minut.Następnie zawiesinę resuspensuj w 0,5 ml HBSS, aby uzyskać roztwór o stężeniu 30 mg/ml. Następnie, używając tonometru odbiciowego skalibrowanego do pomiarów w oku szczura, wykonaj pięć pomiarów bazowych IOP u zwierząt w stanie czuwania. Po znieczuleniu szczurów nanieś maść okulistyczną do przeciwległego oka niepoddanego badaniu, aby utrzymać jego wilgotność.Podczas znieczulenia należy zastosować 0,5% chlorowodorek prokainy, środek znieczulający miejscowo, do oka poddawanego operacji. Następnie oko należy przemyć 5% roztworem powidonu jodowego w wodzie. Po pięciu minutach należy usunąć powidon jodowy i przemyć oko 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej.Podczas znieczulenia należy utrzymywać oko w stanie wilgotnym, regularnie aplikując sterylną sól fizjologiczną. Następnie należy umieścić wokół oka magnes sterylowany, aby zminimalizować ryzyko urazu tęczówki oraz ograniczyć utratę kulek. Igłę należy ustawić stycznie do powierzchni rogówki, jak najbardziej równolegle do tęczówki.Następnie należy wstrzyknąć 25 µL mikro sfer magnetycznych o stężeniu 30 mg/mL, poddanych naświetlaniu gamma, do przedniej komory oka. Igłę należy pozostawić w miejscu przez jedną minutę po wstrzyknięciu, aby zapewnić osadzenie się kulek w kącie rogówkowym IOC, co zahamuje odpływ cieczy wodnistej z sieci haczykowatej. Kilka sekund po początkowym osadzeniu się kulek należy lekko przechylić igłę, aby dopuścić do niewielkiego wycieku cieczy wodnistej i zminimalizować przejściowe wzrosty ciśnienia wewnątrzgałkowego.Aby zapewnić możliwość dalszego wykorzystania igły w oddzielnych procedurach, przepłukać igłę roztworem PBS. Następnie przepłukać 70% etanolem, a na koniec wodą destylowaną. W razie potrzeby wyjąć magnes i użyć go do wciągnięcia kulek do obszarów o niepełnym pokryciu.Pozostaw magnes wokół oka na kolejne 10 minut po wstrzyknięciu, aby zapewnić odpowiednie osadzenie się kulek w kącieWherever przesączonym rogówkowej. Odwróć znieczulenie, podając 0,25 mg/kg ESOL hydrochloride.Podaj 0,5 propylaminy chlorowodorowej w celu zapewnienia analgezji oraz zastosuj miejscowo maść z chloramfenikolem, aby zapobiec infekcji. Pozostaw zwierzęta na macie grzewczej do czasu odzyskania sprawności ruchowej. Następnie przenieś je do ogrzewanego boksu.Przeciwległe oko należy wykorzystać jako nieocenioną kontrolę. Pomiary IOP należy powtarzać co dwa do trzech dni po podaniu kulek i co dwa do trzech dni w kolejnych dniach. Określono kryteria włączenia oczu do badań, w tym wzrost IOP powyżej ciśnienia w oku kontrolnym o 5 mmHg oraz IOP nieprzekraczające 60 mmHg; oczy, w których ciśnienie powróciło do wartości wyjściowej w ciągu jednego tygodnia po wstrzyknięciu, nie powinny być włączane do badań. Jeśli jednak jest to pożądane, możliwe jest ponowne wstrzyknięcie kulek do oczu, w których nie rozwinął się wysoki IOP.Utwalone wypreparowane gałki oczne i nerwy wzrokowe w 4%paraldehyde, oceniając uszkodzenia neuronów siatkówki za pomocą barwienia TUNEL oraz uszkodzenia nerwu wzrokowego za pomocą barwienia błękitem toluidynowym. W tym eksperymencie wstrzyknięcie kulek magnetycznych do kąta przesiekowego rogówki konsekwentnie wywołało przedłużony i silny wzrost ciśnienia. Co więcej, wzrost ciśnienia utrzymywał się przez cały czas trwania eksperymentu.Średnie IOP obliczone dla całego czasu trwania eksperymentu dla kontrolnych oczu bez wstrzykniętych kulek wynosiło 19,7 ± 0,3 mmHg, a dla oczu z wstrzykniętymi kulkami 40,5 ± 2,8 mmHg. Ponadto szczytowe IOP wzrosło z 22,8 ± 0,3 mmHg do 49,9 ± 2,3 mmHg, aby ustalić, czy podwyższenie IOP prowadzi do śmierci komórek zwojowych siatkówki. Przeprowadzono barwienie TUNEL na siatkówkach oraz badanie histologiczne na poprzecznych przekrojach nerwu wzrokowego w siatkówce.Zaobserwowaliśmy wzrost barwienia TUNEL w oczach z wstrzykniętymi kuleczkami i podwyższonym IOP. Liczba jąder apoptotycznych wzrosła około 15-krotnie w porównaniu z przeciwległymi kontrolnymi siatkówkami nadciśnieniowymi; jak oczekiwano w oczach, do których wstrzyknięto kuleczki magnetyczne bez zastosowania ciśnienia, liczba komórek dodatnich w testie TUNEL nie różniła się istotnie od wyników kontrolnych osób bez wstrzyknięć. Dalsze badanie patologii nerwu wzrokowego w modelu jaskry wykazało akumulację błękitu Coomassie w wielu aksonach, co wskazuje na degenerację tych wypustek komórkowych.

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne Jaźró wzrokowe wywołane przez wstrzyknięcie do oka magnetycznych mikrokulek

Ten film pokazuje indukcję jaskry u znieczulonego szczura poprzez wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do żyły nadtwardówkowej. Sól fizjologiczna dostaje się do siatki beleczkowej przez kanał Schlemma, powodując bliznowacenie tkanek, które blokuje odpływ cieczy wodnistej i podnosi ciśnienie wewnątrzgałkowe. Podwyższone ciśnienie uszkadza komórki zwojowe siatkówki, prowadząc do jaskry.

Technika wstrzykiwania hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do wywoływania jaskry u szczurów

W tym filmie znieczulony szczur przechodzi zabieg okulistyczny, w którym kulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory pod wpływem pola magnetycznego w celu zablokowania kąta tęczówkowo-rogówkowego. Blokada ta blokuje siatkę beleczkową, uniemożliwiając drenaż cieczy wodnistej i prowadząc do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, uszkadzając komórki zwojowe siatkówki i nerw wzrokowy. W ten sposób rozwija się stan podobny do jaskry.

Eksperymentalna indukcja jaskry przez niedrożność kąta tęczówkowo-rogówkowego w modelu mysim

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.

Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy

Jaskra charakteryzuje się uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki. Indukowanie jaskry w modelach zwierzęcych może zapewnić wgląd w badania nad tą chorobą. W tym miejscu przedstawiamy procedurę, która indukuje utratę RGC w modelu szczura in vivo i demonstrujemy przygotowanie całych siatkówk do analizy.

Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukowania nadciśnienia ocznego i neurodegeneracji jaskry w oczach myszy poprzez dokomorowe wstrzyknięcie oleju silikonowego oraz procedurę usuwania oleju silikonowego z przedniej komory w celu przywrócenia podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego do normy.

Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Poznaj metodę indukowania jaskry u szczurów przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do przedniej komory oka. Technika ta umożliwia trwałe podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego i badanie śmierci komórek zwojowych siatkówki.

Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Przeglądaj więcej filmów