Name: Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę równowagi sedymentacji do badania stabilności oligomerów białka błonowego hRSV przy różnym pH. Technika ta pozwala określić wielkość oligomeru i wpływ protonacji na jego strukturę pentameryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez grant National Research Foundation NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) oraz grant Tier 1 RG 51/13.

<ol><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530(2009).</li>
<li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods-a+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li>
<li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li>
<li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li>
<li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li>
<li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1%2C+NS2%2C+SH%2C+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li>
<li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro%3A+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged%2C+attenuated+RSV+subgroup+B%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li>
<li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li>
<li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+%28SH%29+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li>
<li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li>
<li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%3A+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li>
<li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li>
<li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li>
<li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation%3A+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li>
<li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Prot.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22An-50+Ti+and+An-60+Ti+Analytical+Rotor%2C+Cells%2C+and+Counterbalance%22">An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance</a>. , Beckman Coulter, Inc. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003</a> (2005).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation%3A+Different+methods+for+density+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li>
<li>Laue, T. Ch. 20.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaue%2C+T+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBevington%2C+PR+%22Data+reduction+and+error+analysis+for+the+physical+sciences%22">Data reduction and error analysis for the physical sciences</a>. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).</li>
<li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li>
<li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li>
<li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li>
<li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li>
<li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+endocytosis%3A+Close+encounters+of+many+kinds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science+%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono eksperymentalny protokół przygotowania próbki i analizy oligomeryzacji małego białka błonowego w detergentzie z wykorzystaniem sedymentacji równowagowej. Opisany protokół jest równie ważny – i prostszy – dla białek rozpuszczalnych, ponieważ etap dopasowania gęstości nie jest wymagany. Rzeczywiście, system składa się z mieszaniny detergentu i białka. Aby przeprowadzić badania sedymentacji, detergent musi być niewidoczny dla pola grawitacyjnego, aby nie przyczyniał się do flotacji cząstek. W związk...

Ultrawirowanie analityczne1-5 jest jedną z najważniejszych metod badania oddziaływań makrocząsteczek w warunkach fizjologicznych, dostępną zarówno dla słabych, jak i silnych oddziaływań. Metoda jest bezznacznikowa i wykorzystuje absorpcję lub interferencję światła, a nawet fluorescencyjne systemy optyczne mogą być używane do uzyskiwania dostępu do zakresów stężeń w zakresie kilku rzędów wielkości6.
Ta metoda jest szczególnie przydatna, ponieważ większość procesów biochemicznych zależy od odwracalnych interakcji. Stechiometria i siła tych oddziaływań muszą być scharakteryzowane ilościowo, aby zrozumieć procesy biologiczne, a istnieje szereg metod w tym celu 7,8. Jednak interakcje przejściowe są trudne do zbadania 9.
Wybór metody charakteryzowania oddziaływań makromolekularnych zależy od jej statycznej lub dynamicznej natury. W pierwszym przypadku stosuje się prędkość sedymentacji (SV), w której mierzy się szybkość transportu promieniowego, a kompleksy frakcjonuje się na podstawie różnic w masie i kształcie wyporu.
Natomiast dynamiczne skojarzenia, które są odwracalne na skali czasowej eksperymentu, nie mogą być fizycznie oddzielone. W tym przypadku interakcje własne lub hetero prowadzące do oddziaływań niekowalencyjnych są w równowadze, która zależy od całkowitego stężenia białka. Te dynamiczne oddziaływania można badać zarówno za pomocą równowagi sedymentacji (SE), jak i prędkości sedymentacji (SV) 10. Jednak pierwsza metoda jest prostsza do wykonania i została opisana tutaj. W SE wirowanie odbywa się z wystarczająco niską prędkością, aby osiągnąć równowagę między dyfuzją a sedymentacją. W tym momencie profil równowagowy sygnału optycznego (UV-VIS) w funkcji odległości radialnej może być analizowany przy użyciu wstępnie ustawionych modeli termodynamicznych dla asocjacji11.
W niniejszym artykule przedstawiono badanie równowagi sedymentacji dotyczące samokojarzenia białka błony wirusowej, które tworzy kanały jonowe. Ze względu na jego hydrofobowość eksperyment przeprowadza się w obecności detergentu i w tym przypadku gęstość rozpuszczalnika musi być dopasowana do gęstości detergentu. Jednak opisany protokół byłby identyczny w przypadku białka rozpuszczalnego w wodzie, z wyjątkiem tego, że nie byłoby wymagane dopasowanie gęstości rozpuszczalnika.
Użyte białko jest kodowane w ludzkim syncytialnym wirusie oddechowym (hRSV), otoczkowym wirusie pneumowirusa z rodziny paramyxoviridae, który powoduje choroby dolnych dróg oddechowych u niemowląt, osób starszych i z obniżoną odpornością na całym świecie 12. Każdego roku dochodzi do 64 milionów zgłoszonych przypadków zakażenia wirusem hRSV i 160 000 zgonów.
Genom hRSV transkrybuje 11 białek, w tym trzy białka błonowe F, G i małe hydrofobowe (SH). Białko SH bierze udział w patogenezie zakażenia RSV. RSV pozbawiony genu SH (RSVΔSH) był żywotny, powodował powstawanie syncytii i rozwijał się tak samo jak wirus typu dzikiego (WT) 13-16. Jednak wirus RSVΔSH replikował się 10-krotnie mniej efektywnie niż WT w górnych drogach oddechowych 15,16. Wirus RSVΔSH był również atenuowany w modelach in vivo myszy i szympansów 13,17.
Białko SH to 64 (RSV podgrupa A) lub 65 (RSV podgrupa B) aminokwasy o długim integralnym typie II białko błonowe, które gromadzi się głównie na błonach kompartmentu Golgiego 18. SH białko ma pojedynczą przewidywaną domenę transbłonową a-helisową (TM) 19, która jest wysoce konserwatywna 20,21. C- i N-końcowe domeny zewnątrzbłonowe są zorientowane odpowiednio światłem/zewnątrzkomórkowo i cytoplazmatycznym.
<>jove_contentWykazano, że zarówno syntetyczna domena TM (reszty 18-43), jak i białko SH o pełnej długości tworzą homopentamery w różnych detergentach. Forma homopentameryczna jest odpowiedzialna za aktywność kanałową w płaskich dwuwarstwach lipidowych 22,23. Prawidłowa orientacja monomerów TM w dwuwarstwie lipidowej została po raz pierwszy określona za pomocą specyficznego dla miejsca dichroizmu podczerwonego 23, który wykazał, że His-22 znajduje się w orientacji świetlnej, bliskiej międzyhelikalnej. Ta sama orientacja domeny TM została potwierdzona w badaniach NMR, które zrekonstruowały pentameryczne pęczek a-helisowy białka o pełnej długości w micelach dodecylofosfocholiny (DPC) 22. W tym modelu "miceli" pojedyncza a-spiralna domena TM była otoczona N-końcowo przez a-helisę, a C-końcowo przez przedłużoną b-spinkę do włosów. Dwie protonowalne reszty białka SH, His-22 i His-51, znajdują się odpowiednio w domenie TM (zorientowane światłem) i na końcu zewnątrzbłonowej C-końcowej β spinki do włosów (daleko od poru kanału). Jednak w środowisku dwucelarnym α-helisa TM rozciąga się aż do His-51, a obie Jego reszty są dostępne dla światła kanału24. Struktura kanału przyjmuje architekturę lejkową 22, gdzie węższy obszar (od Ser-29 do Cys-45) 22 jest wyłożony hydrofobowymi łańcuchami bocznymi (Ile-32, Ile-36, Ile-40 i Leu-44), a Ile-36 określa najwęższy punkt w świetle kanału. His-22 znajduje się w największym otworze tego lejka, podczas gdy His-51 znajduje się na końcu najmniejszego otworu.
W niniejszym artykule, wirowanie analityczne w trybie równowagi sedymentacji zostało użyte do określenia, czy Jego protonacja wpływa na stabilność pentameru białka SH. W tym przypadku białko SH zostało rozpuszczone w detergencie C14-betaina, który był wcześniej używany do wykazania, że białko SH tworzy oligomery pentamerowe22.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimetylomistylamido)propanosulfonian</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru 99,8%</td><td>Izotop Cambridge</td><td>DLM-4-99,8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Wirnik analityczny, 8-miejscowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti, Analityczny, 4-miejscowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa ogniwa</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>Sześciokanałowy element centralny 12 mm, wypełniony węglem elektrycznym Beckman</td><td>Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt okienny</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka okienna</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Nakładka okienna</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Szafirowa</td> szyba <td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Okno kwarcowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka pierścieniowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień śrubowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Redlica Beckman 306812</td><td></td><td></td></tr> Zespół <tr><td>stojaka momentu obrotowego</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwwaga</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do wyrównywania komórek</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analityczne ultrawirowanie (AUC) może być używane do badania odwracalnych oddziaływań między makrocząsteczkami w szerokim zakresie intensywności oddziaływań i w warunkach fizjologicznych. To sprawia, że AUC jest metodą z wyboru do ilościowej oceny stechiometrii i termodynamiki asocjacji homo- i hetero, które są przejściowe i odwracalne w procesach biochemicznych. W modalności równowagi sedymentacji (SE) równowaga między dyfuzją a sedymentacją zapewnia profil jako funkcję odległości promieniowej, która zależy od określonego modelu asocjacji. W niniejszym artykule opisano szczegółowy protokół SE w celu określenia wielkości i energii asocjacji monomer-monomer małego oligomeru białka błonowego za pomocą ultrawirówki analitycznej. AUC-ES jest bezznacznikowy, oparty tylko na zasadach fizycznych i może być stosowany zarówno na białkach rozpuszczalnych w wodzie, jak i błonowych. Pokazano przykład tego ostatniego, małego hydrofobowego (SH) białka w ludzkim syncytialnym wirusie oddechowym (hRSV), 65-aminokwasowym polipeptydzie z pojedynczą α-helisową domeną transbłonową (TM), która tworzy pentameryczne kanały jonowe. Dane strukturalne oparte na NMR pokazują, że białko SH ma dwie protonatowalne reszty He w swojej domenie transbłonowej, które są zorientowane w kierunku światła kanału. Eksperymenty SE zostały zaprojektowane w celu określenia, w jaki sposób pH wpływa na stałą asocjacyjną i oligomeryczną wielkość białka SH. Podczas gdy forma pentameryczna była zachowana we wszystkich przypadkach, jej stała asocjacyjna była zmniejszona przy niskim pH. Dane te są zgodne z podobną zależnością pH obserwowaną dla aktywności kanału SH, zgodną z orientacją światła dwóch reszt He w białku SH. Te ostatnie mogą ulegać odpychaniu elektrostatycznemu i zmniejszonej stabilności oligomerów przy niskim pH. Podsumowując, metoda ta ma zastosowanie wszędzie tam, gdzie konieczne jest zmierzenie informacji ilościowych na temat subtelnych zmian asocjacji białko-białko w warunkach fizjologicznych.

Profil rozkładu radialnego miceli detergentu C14SB w 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 tworzy bardzo płytką funkcję wykładniczą, którą można dopasować do modelu liniowego (Rysunek 7A). Nachylenie tego rozkładu jest odwrotnie skorelowane z stężeniem D2O (Rysunek 7B). Punkt, w którym nachylenie wynosi zero, tj. dopasowane stężenie D2O, wyniósł 32,3%.
Patrz Rysunek 7 poniżej.
<p class="jove_content...

Równowaga sedymentacji (SE) może być wykorzystana do badania interakcji białko-białko w środowisku fizjologicznym. Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie tej techniki do określenia wpływu pH na stabilność homo-pentameru utworzonego przez małe białko hydrofobowe (SH) kodowane przez ludzkiego syncytialnego wirusa oddechowego (hRSV).

Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie wielkości oligomeru tworzonego przez mały hydrofobowy polipeptyd w detergencie sulfalan C 14 oraz stabilności tego oligomeru przy zmianie pH. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez określenie, jakie stężenie tlenku deuteru odpowiada gęstości miceli detergentu, a tym samym neutralizuje ich wyporność. W drugim kroku przeprowadzono zestaw eksperymentów równowagi sedymentacyjnej dla solubilizowanych próbek małego hydrofobowego białka.W detergencie C 14 sulfalan przeprowadza się pomiar z określonym stężeniem detergentu. Następnie pierwszy i drugi krok powtarza się przy innym pH, aby porównać profil sedymentacji białka w tych różnych wartościach pH. Wyniki wykażą zarówno rozmiar oligomeryczny małego białka hydrofobowego w tym detergencie, jak i wpływ pH na stabilność tego oligomeru w detergencie C 14 sulfalan.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ obejmuje ona kilka etapów, takich jak montaż, ładowanie komórek, dopasowanie gęstości oraz osiągnięcie warunków równowagi, co może być przytłaczające i mylące dla osób korzystających z niej po raz pierwszy. Każdy niewielki błąd na tych etapach może potencjalnie doprowadzić do utraty kilku dni czasu eksperymentalnego. Procedurę zademonstruje Suria, doktorantka w moim laboratorium.W pierwszej kolejności należy przygotować 10 x bufor i 50 x detergent. Roztwory stokowe należy wysterylizować przez filtr strzykawkowy o rozmiarze 0,2 µm do probówek o pojemności 1,5 ml z roztworów stokowych 10 x buforu i 50 x detergentu. Należy przygotować po 200 µl trzech oddzielnych roztworów próbek zawierających 10%, 30% i 50% tlenku deuteru objętościowo.Aby złożyć sześciokanałową analityczną celę ultrafiltracyjną bez zewnętrznego napełnienia, należy umieścić uszczelkę okna w uchwycie okna, lekko wygiąć wkładkę okna i umieścić ją w uchwycie okna w taki sposób, aby szczelina utworzyła się naprzeciwko wpustu uchwytu okna. Następnie należy umieścić okno szafirowe we wkładce okna, dopasowując znacznik do wpustu uchwytu okna. Na koniec należy nałożyć obudowę celi o odpowiednim numerze katalogowym do góry nogami, tak aby wpusty były wyrównane z wypustem obudowy.Wsuń sześciosektorowy element centralny z ukośnymi krawędziami do obudowy celi, a następnie jeden zespół okna oknem skierowanym w dół. Następnie lekko pokryj gwinty pierścienia dociskowego oraz podkładkę pierścienia dociskowego smarem do powlekania wirowego. Umieść podkładkę pierścienia dociskowego na górze zespołu okna. Zamontuj pierścień dociskowy w obudowie okna, kierując napis „out” na zewnątrz, i dokręć go ręcznie za pomocą narzędzia do centrowania celi.Następnie dokręć pierścień śruby z momentem 60 inch pounds, używając klucza dynamometrycznego. Po tym ustaw pionowo kuwetę o odpowiednim numerze katalogowym, pozycjonując ją na godzinie 12. Nalej 120 µL roztworu wzorcowego do lewych rzędów oraz 110 µL roztworu próbki do prawych rzędów.Używając pipety 200 µL, należy starannie upewnić się, że każda próbka i wzorzec są prawidłowo sparowane. Wsunąć jeden zespół okienny oknem skierowanym w dół do obudowy celi, dbając o to, aby nie potrząsać celą nadmiernie, co mogłoby spowodować rozlanie ich zawartości. Powtórzyć poprzednie kroki, dokręcając drugi pierścień śruby z momentem 120 inch pounds.Następnie odwróć ogniwo i ponownie dokręć pierwszy pierścień śruby z momentem 120 inch pounds. Umieść ogniwa w rotorze. Zamontuj rotor w wirówce, a następnie zainstaluj monochromator zgodnie z instrukcjami producenta.Po osiągnięciu odpowiedniej próżni uruchom wirówkę z prędkością 3000 RPM. Podgląd wzoru interferencyjnego wykonaj w oprogramowaniu interfejsu użytkownika i dostosuj parametry lasera, aby uzyskać najwyższy kontrast. Następnie utwórz nowy plik konfiguracji, określając pomiar równowagi oraz interferencji.Skonfiguruj metodę równowagi sedymentacyjnej do pracy przy 45 000 obrotów na minutę lub najwyższej przewidywanej prędkości dla próbek białek, przy temperaturze pracy 20 °C. Po zebraniu pierwszej próbki wykonuj skanowanie co 15 minut przez co najmniej 12 godzin. Monitoruj postęp osiągania równowagi, otwierając pliki danych w programie hetero analysis i wybierając funkcję match. Na tym etapie złóż sześciokanałową komorę analitycznej ultrawirówki z oknami kwarcowymi w taki sam sposób jak poprzednio.Używając końcówek do nakładania na żel, nanieś wcześniej przygotowaną próbkę małego białka hydrofobowego o najwyższym stężeniu do kanału najbliższego środka rotora, a próbkę o najniższym stężeniu do kanału najdalej oddalonego od środka rotora. Aby skonfigurować pomiar absorbancji, utwórz nowy plik konfiguracji, określając stan równowagi oraz pomiar absorbancji. Jako długość fali detektora określ 280 nanometrów.Następnie przeprowadź kalibrację radialną przy 3000 RPM, zaznaczając opcję sprawdzania kalibracji radialnej przed pierwszym skanowaniem w ustawieniach skanowania. Określ zbieranie danych w niskiej rozdzielczości i wykonaj pojedynczy skan. Po zakończeniu skanowania odznacz tę opcję.Skonfiguruj metodę równowagi sedymentacyjnej do pracy z pierwszą prędkością obliczoną wcześniej w temperaturze 20°C i zbieraj jeden skan co 30 minut w szczegółach każdej komórki. Określ zbieranie danych w niskiej rozdzielczości po upływie co najmniej 18 godzin. Monitoruj postępy osiągania równowagi, otwierając pliki danych w analizie hetero i wybierając funkcję dopasowania po osiągnięciu stanu równowagi.Po zakończeniu skanowania wykonaj pojedynczy pomiar w wysokiej rozdzielczości. Powtórz poprzednie kroki dla kolejnej prędkości, jeśli znany jest czas wymagany do osiągnięcia stanu równowagi dla każdej prędkości. Skonfiguruj skanowanie metodą równowagi sedymentacyjnej tak, aby objęło wszystkie wcześniej obliczone prędkości i aby wykonano jeden pomiar po czasie równoważenia dla każdej z nich.W tym przypadku określono wysoką rozdzielczość gromadzenia danych w każdej komórce, szczegółowo opisując rozkład radialny detergentu C 14 sultan w komórkach oraz 50 molarnego buforu fosforanowego sodu. Przy pH 7,3 powstaje bardzo płytka funkcja wykładnicza, którą można dopasować do modelu liniowego. Nachylenie tego profilu zależy od stężenia wody ciężkiej, a stężenie dające nachylenie równe zero wyniosło 32,3%. Ten sam eksperyment powtórzono dla pH 5,5 oraz pH 3, aby uzyskać odpowiadające im stężenia wody ciężkiej wynoszące odpowiednio 30,3% i 41%.Przy pH 7,3 stwierdzono, że małe białko hydrofobowe i detergent tworzą pentamery z pozorną logarytmiczną wartością stałej powinowactwa wynoszącą 21,05. Stała asocjacji nie uległa zmianie przy pH 5,5, lecz uległa znacznemu obniżeniu przy pH 3. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wykazującymi spadek przewodnictwa przy niższym pH z wartością pK wynoszącą około 4,5.Po opanowaniu metody montażu komórki w stanie równowagi, załadunek oraz przygotowanie eksperymentu mogą zająć jedną godzinę, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować eksperyment z równowagi sedymentacyjnej, aby móc określić rozmiar oligomeryczny białka błonowego, a także porównać jego stabilność w różnych warunkach eksperymentalnych.

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Równowaga sedymentacyjna małej oligomeryzującej białka membranowego: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentameryczną

Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną służącą do wyznaczenia energii swobodnej Gibbsa fałdowania białek błonowych za pomocą fluorescencji tryptofanu.

Termodynamika fałdowania białek błonowych pomierzona za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej

Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Kanały transportu cząsteczek wody w enzymach wpływają na solwatację i katalizę miejsca aktywnego. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół inżynierii tych dodatkowych motywów katalitycznych w oparciu o modelowanie komputerowe i eksperymenty in silico. Pozwoli to lepiej zrozumieć wpływ dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną.

Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

A przedstawiono protokół do szybkiego testowania stabilności termicznej białek w różnych warunkach za pomocą testów przesunięcia termicznego i nano różnicowej fluorymetrii skaningowej. Systemy buforowe, sole i dodatki, składające się z trzech unikalnych ekranów stabilności, są testowane z białkami w celu zidentyfikowania odpowiednich do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Jak ustabilizować białko: badania przesiewowe stabilności do testów przesunięcia termicznego i nanoróżnicowej fluorymetrii skaningowej w projekcie Virus-X

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Poznaj metodę równowagi sedymentacji do badania stabilności oligomerów białka błonowego hRSV przy różnym pH. Technika ta pozwala określić wielkość oligomeru i wpływ protonacji na jego strukturę pentameryczną.

Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną

Przeglądaj więcej filmów