Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena różnicowania mikro RNA, profilowania i walidacji Mr.NA docelowych linii ludzkich nerwowych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę ludzkich nerwowych komórek macierzystych w trójwymiarowym systemie hodowli w celu wywołania różnicowania komórek. Drugim krokiem jest ilościowe określenie zróżnicowania poprzez pomiar przerostu procesu aksonowego.

Następnie zmiany w ekspresji mikro RNA są oceniane za pomocą macierzy mikro R-N-A-P-C-R. Następnie przeprowadza się analizę obliczeniową wybranych mikroRNA o zróżnicowanej ekspresji w celu zidentyfikowania zestawu przypuszczalnie docelowych mRNA. Ostatecznie docelowe mRNA są walidowane przez plazmid reporterowy, transfekcję i test podwójnej lucyferazy.

Tak więc metoda, która zostanie tutaj przedstawiona, może pomóc odpowiedzieć na kluczowe problemy w dziedzinie neuronalnych komórek macierzystych, takie jak charakterystyka ekspresji mikroRNA, i celują one w informacyjne RNA w ludzkich nerwowych komórkach macierzystych, gdy przechodzą one różnicowanie. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w biologię neuronalnych komórek macierzystych. Może być również stosowany do innych systemów komórek macierzystych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub inne systemy, które wymagają indukcji różnicowania i charakterystyki molekularnej.

Wizualna demonstracja tej metody rozbija krytyczne etapy różnicowania ludzkiej linii komórek macierzystych nerwic oraz badanie profilowania mikroRNA i walidacji docelowego mRNA, demonstrując część procedury, będzie lavania, naukowiec z mojego laboratorium. Cała ta procedura powinna być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zastosowaniem technik aseptycznych. Ponownie nawodnić rusztowania, dodając do każdej studzienki AL VX 12.

Dobrze nałóż dwa mililitry 70% etanolu przygotowanego przy użyciu wody do nawadniania. Unikaj dotykania rusztowań, dozując 70% etanol po ścianie każdego z nich. Dobrze ostrożnie odessać 70% etanol i natychmiast umyć rusztowania dwoma mililitrami na studzienkę D-M-E-M-F 12 przez jedną minutę.

Powtórz procedurę prania dwukrotnie, ostrożnie zassaj D-M-E-M-F 12 po ostatnim praniu. Pokryj rusztowania, dodając do każdego z nich dwa mililitry lamininy w D-M-E-M-F 12. Dobrze inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej dwie godziny.

Następnie umyj płytkę ciepłymi nasionami D-M-E-M-F 12 z każdego rusztowania z około 500 000 ludzkich nerwowych komórek macierzystych lub H nscs w objętości 150 mikrolitrów pożywki RMM z czynnikami wzrostu. Inkubować płytkę przez trzy godziny, aby komórki mogły osiąść na rusztowaniach po trzech godzinach. Dodaj 3,5 mililitra RMM do każdej studzienki, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań.

Inkubuj płytkę przez siedem lub 21 dni. Wymień pożywkę RMM po jednym dniu, który jest pierwszym karmieniem, i ponownie wymień pożywkę dwa do trzech dni po pierwszym karmieniu. Siedem i 21 dni po hodowli 3D H nscs.

Usunąć pożywkę RMM i utrwalić zróżnicowane komórki za pomocą 4% aldehydu paraformowego. Utrwalone komórki są następnie barwione za pomocą pierwszorzędowego przeciwciała beta trzech tubuliny wykrytego ze sprzężonym fluorochromem. Jądra komórek przeciwciała wtórnego są barwieniem przeciwstawnym za pomocą haczyków.

Uchwyć reprezentatywne obrazy trzech komórek barwionych tubuliną beta. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zapisz obrazy w formacie TIFF lub JPEG. Pomiar wyrostu procesu aksonowego odbywa się za pomocą narzędzia pomiarowego image PRO plus seven.

Aby rozpocząć otwieranie obrazu, wybierz opcję pomiaru na pasku narzędzi i wybierz funkcję śledzenia. Aby rozpocząć śledzenie, wybierz punkt początkowy na wyrostku aksonu, klikając przycisk myszy, śledź na całej długości wyrostka aksonu, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć każdy ślad. W ten sposób zmierz wszystkie wyrostki aksonów w polu widzenia, wyrażając pomiary jako piksele lub mikrometry.

Eksport pomiarów długości do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy porównawczej i statystycznej próbki w celu oceny zmian w ekspresji mikro RNA w trójwymiarowych hodowanych HSC. Najpierw wykonaj ekstrakcję mikro RNA i przygotowanie mikro RNA CD NA zgodnie z opisem w dołączonym protokole. Tekst bezpośrednio po uzyskaniu mikro RNA CD NA.

Przygotuj mieszaninę składników PCR do PCR w czasie rzeczywistym w 15-mililitrowej probówce. Dodaj 1375 mikrolitrów dwóch X-S-Y-B-R zielonej mieszanki głównej. 100 mikrolitrów mikro RNA CD NA 275 mikrolitrów uniwersalnego startera i 1000 mikrolitrów RNA wolnego transferu wody.

Składniki PCR mieszają się ze zbiornikiem ładującym PCR. Ostrożnie wyjmij 96-dołkową matrycę PCR z zapieczętowanej torby. Za pomocą pipetera wielokanałowego dodaj 25 mikrolitrów składników PCR.

Wymieszać do każdego dołka w matrycy PCR. Wymieniaj końcówki pipet po każdym etapie pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między uszczelkami studzienek. Płytka 96-dołkowa z optyczną folią samoprzylepną i wirować przez jedną minutę w temperaturze 1000 GS w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków, sprawdzić wzrokowo płytkę, aby upewnić się, że w miejscu studzienek nie ma pęcherzyków.

96-dołkowa matryca PCR w programie cyklera czasu rzeczywistego. Odpowiednio cykler w czasie rzeczywistym. Następnie wyeksportuj wartości CT dla wszystkich studzienek do pustego arkusza kalkulacyjnego Excel w celu analizy danych z tablicy PCR, algorytm dostępny online ktar służy do identyfikacji przewidywanych celów mikro RNA.

Kliknij na, kliknij tutaj, aby przewidywać ktar na kręgowcach, aby otworzyć nową stronę w interfejsie internetowym KTAR. Wybierz gatunek z menu rozwijanego i wstaw interesujący go mikro RNA w polu identyfikatora mikro RNA. Kliknij przycisk Wyszukaj cele mikro RNA.

Przedstawiona zostanie lista docelowych mRNA uszeregowanych według punktacji KTAR. Uzyskane rankingi są następnie wykorzystywane do sporządzenia tabeli porównawczej mikroRNA. Plazmid reporterowy podwójnej lucyferazy jest używany jako narzędzie do walidacji docelowych mRNA, aktywności świetlika i lucyferazy nerkowej mierzy się 24 godziny po transfekcji komórek hela.

Przygotuj roztwór roboczy, dodając 50 mikrolitrów substratu, jeden do 10 mililitrów roztworu i dokładnie mieszając, usuń pożywkę do wzrostu komórek z każdej studzienki 24-dołkowej płytki i dodaj 300 mikrolitrów roztworu roboczego po jednym do każdego. Dobrze przenieś 100 mikrolitrów zawartości każdej studzienki. Z 24-dołkowej płytki do trzech studzienek 96-dołkowej płytki odczekaj 10 minut, a następnie zmierz aktywność lucyferazy świetlików w luminometrze ustawionym do akwizycji luminescencji.

Przygotuj roztwór roboczy dwa, dodając 50 mikrolitrów substratu, od dwóch do 10 mililitrów roztworu dwa i dokładnie mieszając. Dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego po dwa do każdej studzienki z 96-dołkowej płytki zawierającej już 100 mikrolitrów roztworu roboczego. Odczekaj 10 minut, a następnie zmierz aktywność el lucyferazy nerkowej.

Następnie oblicza się stosunek luminescencji lucyferazy świetlika do lucyferazy nerkowej. Reprezentatywne mikrofotografie H NSCS na rusztowaniach 3D uzyskano po barwieniu immunochemicznym tubuliny beta 3 pokazanej na zielono i barwienia przeciw jądrom z haczykami pokazanymi na niebiesko, pomiar procesów aksonowych wykonano za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Porównanie wzrostu procesu aksonowego między H nsc wyhodowanymi na rusztowaniach 3D i z tradycyjnymi kulturami o płaskiej powierzchni lub 2D pokazuje, że po jednym tygodniu lub trzech tygodniach zróżnicowane 3D HSC wykazywały większy wzrost procesu aksonowego.

Analiza obliczeniowa w celu przewidywania celów zaowocowała przedstawionymi tutaj informacjami: listą mikroRNA, przewidywanymi genami docelowymi oraz precyzją, wynikiem i wartościami zagregowanymi. SOX 5 i NR 4 A 3 zostały zidentyfikowane jako przypuszczalne geny docelowe. Do walidacji celów mikroRNA, jak pokazano tutaj, zastosowano test reporterowy podwójnej lucyferazy.

Względna aktywność lucyferazy od trzech głównych reporterów UTR genów SOX 5 i NR 4 A 3 została znacznie obniżona w obecności wskazanych mikroRNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować go w nerwowych komórkach macierzystych i badać ekspresję mikro RNA oraz walidację docelowego Messenger.RNA.