Name: Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Odkryj metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych z analizą mikroRNA i walidacją genów docelowych za pomocą testu dual luciferase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Julie Heward za pomoc w przygotowaniu hNSC, oraz Lavaniya Thanabalasundaram za jej wsparcie techniczne przy hodowli i transfekcji HeLa.

1. Zróżnicowanie HNSC w kulturze trójwymiarowej (3D)
UWAGA: Wyizoluj i wyprowadź hNSC z zatwierdzonej etycznie tkanki, opisanej w poprzedniej publikacji2. Postępując zgodnie z tą procedurą, należy postępować zgodnie z wytycznymi etycznymi i instytucjonalnymi.
1.1) Kultura 3D przy użyciu płytki 12-dołkowej
<ol>
	<li>Stosuj technikę aseptyczną podczas całej procedury. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ponownie nawodnić rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę 70% etanolu przygotowanego przy użyciu wody do nawadniania (WFIr). Unikaj dotykania rusztowań, dozując 70% etanolu po ścianie każdej studni.</li>
	<li>Ostrożnie odessać 70% etanol i natychmiast umyć rusztowania 2 ml/studzienkę DMEM: F12 przez 1 min. Powtórzyć procedurę mycia dwukrotnie. Ostrożnie odessać DMEM: F12 po ostatnim praniu.</li>
	<li>Pokryj rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę lamininy (10 μg / ml) w DMEM: F12. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny. Umyj płytę ciepłym DMEM: F12.</li>
	<li>Wysiewaj każde rusztowanie około 500 000 hNSC w objętości 150 μl RMM+GFs.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 , aby umożliwić komórkom osadzenie się na rusztowaniach.</li>
	<li>Dodać 3,5 ml RMM do każdego dołka, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 7 dni; wymienić pożywkę RMM (3,5 ml/dołek) po 1 dniu (pierwsze karmienie) i ponownie po 2-3 dniach od pierwszego karmienia.</li>
	<li>Po 7 dniach usunąć pożywkę i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) do immunocytochemii (ICC) lub dodać 500 μl/studzienkę odczynnika do lizy w celu ekstrakcji całkowitego RNA (przechowywać płytkę w temperaturze ≤ -80 °C lub przystąpić do ekstrakcji całkowitego RNA).</li>
</ol>
1.2) Pomiar wzrostu procesu Axon
<ol>
	<li>Barwienie 4% PFA utrwaliło zróżnicowane hNSC zgodnie ze standardowym protokołem ICC20 przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała β3-tubuliny (TUBB3) wykrytego za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorochromem. Przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą Hoechst (1 μM).</li>
	<li>Uchwyć reprezentatywne obrazy komórek barwionych β3-tubuliną za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego; zapisz obrazy w formacie tiff lub jpeg. Pomiar wzrostu procesu aksonowego za pomocą programowego narzędzia pomiarowego (np. Image-Pro Plus).</li>
	<li>Otwórz obraz, wybierz opcję pomiarów na pasku narzędzi i wybierz funkcję śledzenia.</li>
	<li>Aby rozpocząć śledzenie, wybierz punkt początkowy na wyrostku aksonu, klikając przycisk myszy. Śledź na całej długości wyrostka aksonu; Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć każdy ślad. Powtórz tę czynność, aby zmierzyć wszystkie wyrostki aksonów w polu view.</li>
	<li>Wyrażaj pomiary w pikselach lub μm (w oczekiwaniu na konfigurację kalibracji). Eksport pomiarów długości do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia próbnej analizy porównawczej i statystycznej.</li>
</ol>
2. Ekspresja miRNA za pomocą komórek macierzystych i szlaków rozwojowych Skoncentrowana matryca miRNA PCR
2.1) ekstrakcja całkowitego RNA miRNA
<ol>
	<li>Wykonaj ekstrakcję miRNA na rusztowaniach i próbkach wyhodowanych 2D (zróżnicowane i niezróżnicowane, kontrola hNSC).</li>
	<li>W razie potrzeby rozmrozić rusztowania, umieszczone w płytce 12-dołkowej. Połączyć zawartość odczynnika do lizy (500 μl) z 2 studzienek w tej samej probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, końcowa objętość 1 ml odczynnika do lizy. Uważaj, aby zostawić rusztowanie w studni.</li>
	<li>W przypadku próbek uprzednio pobranych w postaci granulek suchych komórek 2D (zróżnicowane kultury hNSC 2D i niezróżnicowana kontrola) należy dodać 1 ml odczynnika do lizy i przenieść zawartość do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Homogenizować każdą badaną próbkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i krótkiej igły o rozmiarze 20-25. Przepuścić lizat przez igłę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml do 5 razy, aż do uzyskania jednorodnego lizatu.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu do każdej probówki Eppendorf i szczelnie zakręcić. Odwróć i zwiruj probówki, aby wymieszać zawartość.</li>
	<li>Odwirować każdą probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą homogenat przez 15 minut w temperaturze ≥12 000 x g.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną każdej próbki (unikać przenoszenia jakiejkolwiek międzyfazowej, różowej cieczy) do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl 100% etanolu. Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Odpipetować do 700 μl każdej badanej próbki, łącznie z dowolnym osadem, do minikolumny w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę i odwiruj przy ≥8 000 x g przez około 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok, używając pozostałej części próbki.</li>
	<li>Przeprowadzaj trawienie DNA przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu RWT do mini kolumny i odwirowywać przez około 30 sekund przy ≥8 000 x g. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Przemyć mini kolumnę, dodając 500 μl buforu RPE i odwirowując przez około 30 sekund przy ≥8 000 x g. Wyrzucić przepływ. Powtórz pranie. Wirować przy ≥12 000 x g przez 1 minutę, aby dalej wysuszyć membranę.</li>
	<li>Eluować całkowite RNA w 1,5 ml probówce Eppendorfa, dodając 40 μl wody wolnej od RNaz do mini kolumny i wirując przez 1 minutę przy ≥8 000 x g. Zmierzyć całkowite stężenie RNA za pomocą odpowiedniego spektrofotometru.</li>
</ol>
2.2) miRNA cDNA Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj główny miks z odwrotną transkrypcją. Każda próbka wymaga 4 μl 5x bufora miScript HiSpec, 2 μl 10x mieszanki nukleinowej, 2 μl mieszanki odwrotnej transkryptazy miScript.</li>
	<li>Podać podamy 8 μl mieszanki wzorcowej w probówce do PCR, dodać wymaganą objętość całkowitego RNA (250 ng) i dodać wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 20 μl.</li>
	<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C, aby dezaktywować mieszaninę odwrotnej transkryptazy miScript.</li>
	<li>Dodaj 200 μl wody wolnej od RNaz do każdej 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji, przechowuj w temperaturze –20 °C lub natychmiast przystąp do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>
2.3) Komórki macierzyste i szlaki rozwojowe Skoncentrowana matryca miRNA PCR
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę składników PCR w probówce o pojemności 15 ml, dodając 1375 μl 2x zielonej mieszanki wzorcowej SYBR, 100 μl preparatu cDNA miRNA, 275 μl 10x miScript Universal Primer i 1000 μl wody wolnej od RNaz (całkowita objętość 2,750 μl).</li>
	<li>Przenieś składniki PCR na zbiornik ładujący PCR. Ostrożnie wyjąć 96-dołkowy zestaw PCR z zamkniętej torby.</li>
	<li>Dodaj 25 μl składników PCR do każdego dołka macierzy PCR za pomocą pipetora 8-kanałowego lub pipetora 12-kanałowego przy użyciu tylko 8 końcówek. Końcówki pipet należy wymieniać po każdym etapie pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną i odwiruj przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej (15–25 °C) w celu usunięcia pęcherzyków. Sprawdź wzrokowo płytkę od spodu, aby upewnić się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową matrycę PCR na płytce w cyklerze czasu rzeczywistego.</li>
	<li>Zaprogramuj odpowiednio cykler w czasie rzeczywistym: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut i 45 cykli przez 15 sekund w temperaturze 95 °C oraz 1 minuta w temperaturze 60 °C ustaw pojedynczy (zbieranie danych fluorescencyjnych). </li>
	<li>Eksportuj wartości Ct dla wszystkich studzienek do pustego arkusza kalkulacyjnego Excel do użytku z szablonem analizy danych PCR Array Excel i oprogramowaniem internetowym. 
	UWAGA: Oprogramowanie jest dostępne pod adresem <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php.</a></li>
</ol>
3. Analiza obliczeniowa do przewidywania docelowego celu miRNA i walidacji docelowych mRNA za pomocą transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.
3.1) Analiza obliczeniowa do przewidywania celu miRNA
<ol>
	<li>Przeglądaj PicTar (<a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a>)21, dostępny online algorytm do identyfikacji mRNA do przewidywania docelowych mRNA.</li>
	<li>Kliknij "kliknij tutaj, aby przewidzieć PicTar dla kręgowców". Otworzy się nowa strona.</li>
	<li>Na nowej stronie, w interfejsie internetowym PicTar, wybierz gatunek z menu rozwijanego i wstaw interesujące go miRNA w polu identyfikatora miRNA. Kliknij przycisk Wyszukaj cele miRNA.</li>
	<li>Obserwuj listę docelowych mRNA uszeregowanych według wyniku aPicTar. 
	UWAGA: PicTar oblicza wynik odzwierciedlający prawdopodobieństwo, że dany UTR będzie celem wybranego miRNA, i oparty na komplementarności nasion, termodynamice i kombinatorycznym przewidywaniu dla wspólnych celów w zestawach współeksprymowanych miRNA22.</li>
	<li>Podobnie pobierz listę docelowych mRNA za pomocą alternatywnych algorytmów dostępnych on-line (<a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a>)23 i TargetScan (<a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a>)24.</li>
	<li>Sporządź tabelę porównawczą miRNA na podstawie rankingu uzyskanego przy użyciu różnych narzędzi programowych. PicTar klasyfikuje się według wyniku, DianaLab według precyzji (na podstawie stosunku sygnału do szumu i wyniku precyzji dla oceny istotności przewidywanych wyników), a TargetScan według zagregowanego PCT (w oparciu o komplementarność nasion, termodynamiczną energię swobodną wiązania, zachowanie nad różnymi gatunkami), patrz tabela 1.</li>
</ol>
3.2) Walidacja docelowych mRNA za pomocą transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.
UWAGA: 3' reportery lucyferazy UTR do walidacji docelowego mRNA zostały wcześniej opisane25.
<ol>
	<li>Transfekcja
	<ol>
		<li>Umieść komórki HeLa w gęstości 105 komórek / dołek w 24-dołkowej płytce.</li>
		<li>Po 24 godzinach współtransfekować komórki HeLa z 1,5 μl odczynnika do transfekcji i 100 ng plazmidu NR4A3 3' UTR lub SOX5 3' UTR, a także mimikami 20 nM miRNA (has-miR-96-5p dla SOX5 3' UTR i has-miR-7-5p i has-miR-17-5p odpowiednio dla NR4A3 3' UTR) na studzienkę.</li>
		<li>Studzienki kontrolne kotransfekcji z NR4A3 3' UTRor SOX5 3' UTRplasmidem i fluorochromowymi siRNA kontrolnymi znakowanymi fluorochromem. Transfekcja studzienek kontrolnych za pomocą znakowanych fluorochromem siRNA kontroli ujemnej umożliwia ocenę skuteczności transfekcji i uwzględnia swoistość wiązania mimimicznego 3'UTR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar podwójnej aktywności lucyferazy
	<ol>
		<li>Zmierz aktywność lucyferazy świetlika i Renilla 24 godziny po transfekcji. Usuń pożywkę do wzrostu komórek.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy I, dodając 50 μl substratu I do 10 ml roztworu I; dokładnie wymieszać. Dodać 300 μl roztworu roboczego I do każdego 24 dołka.</li>
		<li>Przenieść zawartość każdej z 24 studzienek do 3 dołków z 96 białymi płytkami, po 100 μl każdy. Odczekaj 10 minut i zmierz lucyferazy świetlika w luminometrze ustawionym do akwizycji luminescencji.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy II, dodając 50 μl substratu II do 10 ml roztworu II; dokładnie wymieszać. Dodać 100 μl roztworu roboczego I do każdej 96 studzienek zawierających już 100 μl roztworu roboczego I.</li>
		<li>Odczekaj 10 minut i zmierz lucyferazy Renilla w luminometrze ustawionym do akwizycji luminescencji. Oblicz stosunek luminescencji lucyferazy świetlików do lucyferazy Renilla.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li>
<li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li>
<li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li>
<li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li>
<li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li>
<li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+repair%3A+cell+therapy+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li>
<li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+feel+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li>
<li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70(2010).</li>
<li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li>
<li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alvetex%28R%29%3A+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture%3A+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li>
<li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49(2014).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295(2009).</li>
<li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+seed+pairing%2C+often+flanked+by+adenosines%2C+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li>
<li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3%27UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance%2C+pyramidal+cell+survival%2C+and+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li>
<li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami, posiadaczami akcji i/lub opcji na akcje w ReNeuron Ltd lub jej spółce macierzystej. Badanie to było wspierane przez ReNeuron (RENE. L).

Opracowanie nowych testów in vitro do oceny i poprawy różnicowania komórek macierzystych zawsze stanowiło wyzwanie dla badania ich funkcjonalności i możliwości terapeutycznych. Zajęto się kwestią długoterminowego i stabilnego przyłączania hNSC, niezbędnego do opracowania solidnego testu różnicowania 3D in vitro , testując kilka substratów 3D o różnych właściwościach pod względem materiałów i struktur. W ramach opracowywania testu oceniliśmy również optymalne stężenie wysiewu komórek i określiliśmy wymóg, aby rusztowania były pokryte lamininą. Chociaż nasze hNSC mogą spontanicznie różnicować się po usunięciu 4-OHT i czynnika wzrostu, wdrożenie systemu hodowli 3D wykazało znaczną poprawę ich zdolności różnicowania mierzonej wzrostem procesu aksonów w porównaniu ze standardowymi hNSC różnicowanymi 2D.
Aby zbadać wpływ różnicowania indukowanego przez 3D na ekspresję miRNA hNSC, użyliśmy macierzy PCR. W porównaniu ze standardowym chipem, macierz PCR z mikromacierzą oferuje korzyści płynące z bezpośredniej kwantyfikacji i walidacji miRNA, które są przedmiotem zainteresowania. Chociaż matryca PCR jest ograniczona pod względem całkowitej liczby miRNA na macierz, na przykład w tym przypadku mniej niż 96, można ją dostosować tak, aby zawierała interesujące miRNA, w naszym przypadku wcześniej zgłoszone w rozwoju komórek macierzystych. Ekspresja miRNA skoncentrowanych na szlaku była profilowana w hNSC zróżnicowanych 3D i 2D w porównaniu z niezróżnicowanymi hNSC. Najbardziej znacząco obniżone miRNA zostały wybrane i przeanalizowane w celu oceny ich przypuszczalnych docelowych mRNA z zamiarem określenia ich funkcjonalności i interpretacji biologicznej przy użyciu algorytmów dostępnych online (DIANA Lab, PicTar i TargetScans).
Pojedyncze miRNA może rozpoznawać setki celów i z tego powodu zwalidowaliśmy interakcje miRNA z mRNA 3' UTR, które mogą być odpowiednimi kandydatami w regulacji aksonalnej. NR4A3, cel z rodziny has-miR-7 i miR-17, jest członkiem receptorów jądrowych rodziny NR4A, które, w zależności od poziomu ekspresji, biorą udział w różnicowaniu, przeżyciu, apoptozie i regulacji przewodnictwa aksonów hipokampa26. Podobnie SOX5, cel has-miR-96, kontroluje progresję cyklu komórkowego w neuronalnych progenitorachodługości aksonu27 28, migrację, różnicowanie pomigracyjne i projekcje neuronów29. Zarówno SOX5, jak i NR4A3 zostały zidentyfikowane jako bezpośrednie docelowe mRNA has-miR-96 i has-miR-7 i 17 odpowiednio za pomocą podwójnych testów reporterowych lucyferazy. Podwójna lucyferazy (Firefly i Renilla) opiera się na dwóch różnych genach reporterowych w tym samym plazmidzie i oferuje ulepszony system umożliwiający normalizację efektów spowodowanych nieoptymalną transfekcją i efektami cytotoksycznymi w porównaniu z pojedynczym systemem plazmidowym lucyferazy. W ramach rozwoju naszych testów zoptymalizowaliśmy również warunki transfekcji, aby uzyskać wysoką wydajność.
Protokoły opisane w niniejszym dokumencie mogą być wykorzystane do dalszej optymalizacji i scharakteryzowania różnicowania hNSC in vitro , co może być wdrożone w protokołach transplantacyjnych do badań przedklinicznych i przyszłych zastosowań klinicznych.

Badania nad komórkami macierzystymi odgrywają kluczową rolę w medycynie regeneracyjnej, która obejmuje również takie dyscypliny jak inżynieria tkankowa, biologia komórkowa, terapia komórkowa, terapia genowa i biomateriały (rusztowania i matryce). Komórki macierzyste są ważne zarówno w rozwoju narządów, jak i naprawie tkanek; Zrozumienie, jak działają komórki macierzyste, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii opartych na komórkach macierzystych1. CTX0E03 to klonalna, warunkowo unieśmiertelniona linia2 ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC) wyizolowana z kory płodu ludzkiego w pierwszym trymestrze ciąży. CTX0E03 ma zdefiniowane cechy jakościowe, które są niezbędne do klinicznego bankowania komórek zgodnie z dobrą praktyką wytwarzania (GMP)3. HNSC mogą spontanicznie różnicować się w neurony, komórki glejowe i oligodendrocyty i udowodniono, że łagodzą deficyty neurologiczne po przeszczepieniu do modelu ogniskowego niedokrwienia u gryzoni2,4,5. CTX0E03 hNSC są obecnie w fazie badań klinicznych dotyczących niepełnosprawności po udarze mózgu (6 NCT01151124 i NCT02117635 Clinicaltrials.gov).
MiRNA mają średnio 22 nukleotydy długości i są sprawdzonymi cząsteczkami regulatorowymi7, nie kodują białek, ale raczej wiążą 3 główne nietranslowane regiony (3'UTR) mRNA, regulując ich stabilność i translację do białek. Doniesiono, że MiRNA uczestniczą w regulacji wielu procesów komórkowych, w tym rozwoju, proliferacji i różnicowania8. Kilka miRNA jest zaangażowanych w regulację losu i specyfikację nerwowych komórek macierzystych9.
W dwuwymiarowym (2D) standardowym środowisku hodowlanym złożoność środowiska in vivo nie jest dopasowana, a co za tym idzie, indukcja i regulacja różnicowania hNSC nie jest optymalna. In vivo komórki są otoczone trójwymiarowym (3D) mikrośrodowiskiem złożonym z innych komórek i ligandów zewnątrzkomórkowych, w tym wielu rodzajów kolagenów, lamininy i innych białek macierzy (macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM). Wcześniejsze badania wykazały, że topografia architektoniczna materiałów naśladujących ECM i ich geometria wpływają na fenotyp i los komórki10-15. Dostępnych jest wiele dostępnych na rynku rusztowań 3D; Użyliśmy wysoce porowatego rusztowania polistyrenowego zaprojektowanego z dobrze zdefiniowaną i jednolitą architekturą w membranie o grubości 200 μm, która zapewnia przestrzeń 3D, w której komórki mogą atakować i różnicowaćsię 16-18.
Tutaj testy różnicowania 2D i 3D są używane do oceny przerostu procesu aksonowego. Ponadto opisujemy metodę profilowania ekspresji miRNA linii hNSC klasy klinicznej w celu dalszego zbadania wpływu miRNA na jej różnicowanie. Przedstawione tu metody są oparte na metodach pierwotnie opisanych wpunkcie 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>Do przygotowania podłoża RMM</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy ludzkiej&nbsp;</td><td>Baxter Health Care Limited&nbsp;</td><td>1501052</td><td>Do pożywki RMM stosowanej w stężeniu końcowym &nbsp; 0,03%</td></tr><tr><td>Transferyna, Rekombinowana Sigma ludzka</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>Do pożywki RMM stosowana w stężeniu końcowym &nbsp; 5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Putrescyna DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Do pożywki RMM stosowana w stężeniu końcowym &nbsp; 16,2 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Insulina ludzka rekombinowana&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>Do podłoża RMM stosowanego w końcowym stężeniu &nbsp; 5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>Do pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>Do pożywki RMM stosowany w końcowym stężeniu &nbsp; 2</td></tr><tr><td>mM Selenin sodu&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>Do pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu 40 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 20 ng/ml</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 100 nM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>Woda do nawadniania</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI) (sklep -20&deg; C)</td><td>Płytka 12-dołkowa Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta; III tubulina</td><td>przeciwciało Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini zestaw</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>DNazy wolne od RNaz&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw SYBR do zielonego PCR</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>Rozwój komórek & Różnicowanie miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 biała 96 płytka</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; folia uszczelniająca</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Wektor NR4A3 miRNA 3' docelowe klony UTR&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Wektor SOX5 miRNA 3' docelowe klony UTR&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars kontrola negatywna siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>Kontrola transfekcji MiRNA</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Lucyferazy Test</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometr mikropłytkowy Roche GloMax 96&nbsp;</td><td>Preparat Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikrorna i przypuszczalnych genów docelowych

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w określonych lokalnych mikrośrodowiskach. W niniejszym artykule przedstawiamy zestaw metod stosowanych do trójwymiarowego (3D) różnicowania i analizy miRNA linii klonalnych ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC), obecnie w badaniach klinicznych dotyczących niepełnosprawności po udarze mózgu (NCT01151124 i NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSC pochodziły z zatwierdzonej etycznie ludzkiej kory płodowej w pierwszym trymestrze ciąży i zostały warunkowo unieśmiertelnione przy użyciu retrowirusowej integracji pojedynczej kopii konstruktu c-mycERTAM. Opisujemy, jak mierzyć rozrost procesu aksonowego hNSC zróżnicowanych na rusztowaniach 3D i jak określić ilościowo związane z tym zmiany w ekspresji miRNA za pomocą macierzy PCR. Ponadto przeprowadzamy analizę obliczeniową w celu wyboru przypuszczalnych celów miRNA. SOX5 i NR4A3 zidentyfikowano jako odpowiedni przypuszczalny cel miRNA wybranych, znacznie obniżonych miRNA w zróżnicowanym hNSC. Walidację celu MiRNA przeprowadzono na 3'UTR SOX5 i NR4A3 za pomocą podwójnej transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.

Na Rysunku 1 przedstawiono badanie i kwantyfikację różnicowania hNSC na rusztowaniach 3D w porównaniu z tradycyjnymi kulturami na płaskiej powierzchni (2D), wyrażone jako pomiary wzrostu wypustek aksonalnych. Na Rysunku 2 przedstawiono schemat pracy oraz wyniki kwantyfikacji miRNA z wykorzystaniem macierzy PCR dla miRNA ukierunkowanej na komórki macierzyste i szlaki rozwojowe, w celu zbadania różnicowej ekspresji miRNA w zróżnicowanych hNSC w warunkach 2D i 3D w porównaniu z niezróżnicowaną kontrolą. Po porównawczej analizie miRNA pomiędzy zróżnicowanymi i niezróżnicowanymi hNSC oraz analizie obliczeniowej w celu przewidywania celów, zidentyfikowano SOX5 i NR4A3 (NOR1) jako potencjalne docelowe mRNA. Aby zbadać bezpośrednią interakcję między miRNA a ich potencjalnymi miejscami wiązania w 3’UTR mRNA, wykorzystano dwa dostępne komercyjnie plazmidy zawierające sekwencję 3′UTR SOX5 lub NR4A3 wstawioną poniżej genu reporterowego lucyferazy świetlika, a także zawierające w tym samym plazmidzie gen lucyferazy renilla do normalizacji. Reprezentatywne wyniki obniżenia aktywności lucyferazy 3’ UTR przedstawiono na Rysunku 3.
<img alt="Pomiar morfologii komórek; obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza porównawcza na wykresie słupkowym; komórki neuronalne." src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Różnicowanie hNSC na rusztowaniach 3D oraz pomiar wzrostu wypustek aksonalnych. (A) Po standardowym barwieniu ICC na β3-tubulinę (kolor zielony) i przeciwbarwieniu jąder Hoechst-em (kolor niebieski) wykonano reprezentatywne mikrofotografie, a pomiar wypustek aksonalnych przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. (B) Wykresy przedstawiające pomiary wzrostu wypustek aksonalnych wykonane dla zróżnicowanych hNSC w 2D i 3D po 1 (1W) lub 3 tygodniach (3W). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig1highres.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="schemat analizy miRNA PCR array; ekstrakcja RNA, synteza cDNA, analiza qRT-PCR, wyniki w formie clustergramu." src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny przebieg analizy profilu miRNA w zróżnicowanych hNSCs. Całkowite RNA, w tym miRNA, ekstrahowano z zróżnicowanych hNSCs na rusztowaniach 3D i w standardowych kulturach 2D lub z niedróżnicowanej kontroli. 250 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji metodą umożliwiającą selektywną konwersję dojrzałych miRNA do cDNA odpowiedniego do kwantyfikacji miRNA za pomocą zestawu miScript miRNA PCR array dla różnicowania i rozwoju ludzkich komórek. Do analizy danych metodą 2-ΔΔct wykorzystano średnią geometryczną z SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A oraz RNU6-2. Istotne zmiany zdefiniowano jako wzrost lub spadek poziomu o +/- 1,5 krotności w stopniu statystycznie istotnym. Dane analizowano za pomocą oprogramowania internetowego dostępnego pod adresem. Wyniki przedstawiono w formie clustergramu. Zmodyfikowano na podstawie Rysunku 319. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat edycji genów i wykres słupkowy przedstawiający aktywność lucyferazy w eksperymentach z mikroRNA; obraz komórek." src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Walidacja przewidywanego mRNA celu miRNA przy użyciu podwójnego testu reporterowego lucyferazy. (A) Reprezentatywny schemat podwójnego plazmidu reporterowego lucyferazy użytego jako narzędzie do walidacji sekwencji 3’UTR jako bezpośredniego celu miRNA. (B) Reprezentatywna mikrografia obrazująca wydajność transfekcji. (C) Sygnały, wyrażone jako względna aktywność lucyferazy, z ludzkich reporterów 3'UTR genów SOX5 i NR4A3 zostały znacząco obniżone w obecności mimetyków miRNA hsa-miR-96 oraz odpowiednio hsa-miR-7 i 17. Zmodyfikowano na podstawie Ryciny 519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">DIANALAB</td>
			<td>PicTar</td>
			<td>TargetScan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA</td>
			<td>Gen docelowy</td>
			<td>Znalezione miejsca docelowe/geny</td>
			<td>Precyzja</td>
			<td>Wynik</td>
			<td>Agregat PTK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-96</td>
			<td>SOX5</td>
			<td>1214/763</td>
			<td>1</td>
			<td>6.74</td>
			<td>0.94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-183</td>
			<td>DUSP10</td>
			<td>302/190</td>
			<td>0.72</td>
			<td>4.75</td>
			<td>0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-302a</td>
			<td>NR4A3</td>
			<td>863/473</td>
			<td>0.84</td>
			<td>3.05</td>
			<td>NF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-182</td>
			<td>FOXN3</td>
			<td>1358/794</td>
			<td>0.94</td>
			<td>NF</td>
			<td>0.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-7</td>
			<td>NR4A3</td>
			<td>NF</td>
			<td>NF</td>
			<td>1.61</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-7</td>
			<td>FOXN3</td>
			<td>399/136</td>
			<td>0.17</td>
			<td>NF</td>
			<td>0.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-20a</td>
			<td>NR4A3</td>
			<td>1650/841</td>
			<td>0.85</td>
			<td>5.87</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-20b</td>
			<td>NR4A3</td>
			<td>1955/973</td>
			<td>0.9</td>
			<td>5.87</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-17</td>
			<td>NR4A3</td>
			<td>1928/961</td>
			<td>0.9</td>
			<td>5.38</td>
			<td>0.63+0.37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-20a</td>
			<td>EIF4G3</td>
			<td>1650/841</td>
			<td>0.97</td>
			<td>NF</td>
			<td>NF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-20b</td>
			<td>EIF4G3</td>
			<td>1955/973</td>
			<td>0.94</td>
			<td>NF</td>
			<td>NF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-miR-17</td>
			<td>EIF4G3</td>
			<td>1928/961</td>
			<td>0.94</td>
			<td>NF</td>
			<td>NF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista przewidzianych mRNA będących celami miRNA. Reprezentatywna tabela miRNA, genów przewidzianych jako cele oraz analizy algorytmów (przewidywanie/wynik/agregat dostarczone odpowiednio przez Diana Lab, PicTar i TargetScan). Zmodyfikowano na podstawie Tabeli 319.

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena profilowania mikroRNA różnicowania oraz walidacja docelowego mRNA w ludzkiej linii komórek macierzystych neuronów. Zostaje to osiągnięte poprzez uprawę ludzkich komórek macierzystych neuronów w trójwymiarowym systemie hodowlanym w celu indukcji różnicowania komórek. Drugim krokiem jest ilościowe określenie różnicowania poprzez pomiar wypustek aksonalnych.Następnie zmiany w ekspresji mikroRNA są oceniane za pomocą macierzy micro RNA-PCR. Przeprowadzana jest analiza obliczeniowa wybranych mikroRNA o różnej ekspresji w celu zidentyfikowania zestawu domniemanych docelowych mRNA. Ostatecznie docelowe mRNA są walidowane za pomocą plazmidu reporterowego, transfekcji oraz podwójnego testu lucyferazowego.Przedstawiona tutaj metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie neuralnych komórek macierzystych, takich jak charakterystyka ekspresjonowanych microRNA oraz ich docelowych mRNA w ludzkich neuralnych komórkach macierzystych w trakcie różnicowania. Choć metoda ta pozwala na pogłębienie wiedzy na temat biologii neuralnych komórek macierzystych, może ona zostać zastosowana również w innych systemach komórek macierzystych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub inne systemy wymagające indukcji różnicowania i charakterystyki molekularnej.Wizualna demonstracja tej metody szczegółowo przedstawia krytyczne etapy różnicowania ludzkiej linii komórek macierzystych neuronów, analizę profilu microRNA oraz walidację docelowego mRNA; część procedury zostanie zaprezentowana przez Lavanię, naukowca z mojego laboratorium. Cały proces należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem technik aseptycznych. Nawilż rusztowania, dodając do każdej studzienki AL VX 12.Do każdego dołka płytki dodaj 2 mL 70% etanolu przygotowanego w wodzie do irygacji. Aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z rusztowaniami, dozuj 70% etanol spływając po ściance każdego dołka. Ostrożnie odessij 70% etanol i niezwłocznie przemyj rusztowania, stosując 2 mL DMEM/F12 na dołek przez jedną minutę.Powtórz procedurę płukania dwukrotnie, a po ostatnim płukaniu ostrożnie odessij D-M-E-M-F 12. Pokryj rusztowania, dodając do każdego dołka dwa mililitry lamininy w D-M-E-M-F 12. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnej inkubatorze z 5% CO2 przez minimum dwie godziny.Następnie wypłucz płytkę ciepłym medium D-M-E-M-F 12 i zasiaj każdy rusztowanie około 500 000 ludzkich komórek macierzystych neuronów lub H nscs w objętości 150 µL medium RMM z czynnikami wzrostu. Inkubuj płytkę przez trzy godziny, aby umożliwić osiedlenie się komórek w rusztowaniach. Po trzech godzinach dodaj 3,5 mL RMM do każdej studni, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań.Inkubuj płytkę przez siedem lub 21 dni. Po jednym dniu wymień pożywkę RMM, co stanowi pierwsze karmienie, a następnie wymień pożywkę ponownie po dwóch do trzech dniach od pierwszego karmienia. Siedem i 21 dni po rozpoczęciu hodowli 3D H nscs.Usunąć pożywkę RMM i utrwalić zróżnicowane komórki w 4% paraformaldehydzie. Utrwalone komórki barwi się następnie przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko beta III tubulinie, wykrywanego za pomocą przeciwciała wtórnego sprzężonego z fluorochromem. Jądra komórkowe barwi się kontrastowo Hoechstem.Należy zarejestrować reprezentatywne obrazy komórek barwionych na beta three tubulin. Korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego, należy zapisać obrazy w formacie TIFF lub JPEG. Pomiar wzrostu wypustek aksonalnych jest wykonywany przy użyciu narzędzia pomiarowego oprogramowania image PRO plus seven.Aby rozpocząć, otwórz obraz, wybierz opcję pomiaru na pasku narzędzi, a następnie wybierz funkcję śledzenia (trace). Aby rozpocząć śledzenie, zaznacz punkt startowy na wypustce aksonu, klikając przyciskiem myszy; prowadź śledzenie wzdłuż całej długości wypustki aksonu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć każdy pomiar. W ten sposób zmierz wszystkie wypustki aksonów w polu widzenia; wyniki pomiarów wyraź w pikselach lub mikrometrach.Wyeksportuj pomiary długości do programu arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy porównawczej i statystycznej próbek, aby ocenić zmiany w ekspresji micro RNA w HSCs hodowanych w trzech wymiarach. Najpierw przeprowadź ekstrakcję micro RNA i przygotowanie micro RNA CD NA zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole. Tekst bezpośrednio po uzyskaniu micro RNA CD NA.Przygotować mieszaninę składników PCR do reakcji real-time PCR w probówce o pojemności 15 ml. Dodać 1375 µl dwukrotnego (2X) master mixu S-Y-B-R green, 100 µl miRNA cDNA, 275 µl uniwersalnego primera oraz 1000 µl wody wolnej od RNaz.Mieszaninę składników PCR przelewa się do zbiornika do ładowania PCR. Należy ostrożnie wyjąć 96-dołkową płytkę do PCR z zapieczętowanej torebki. Za pomocą pipety wielokanałowej należy dodać 25 µL składników PCR.Wymieszać zawartość każdej studzienki macierzy PCR. Po każdym kroku pipetowania należy zmienić końcówki pipety, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych między studzienkami. Płytkę 96-dołkową należy zamknąć optyczną folią adhezyjną i wirować przez jedną minutę przy 1000 g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie należy dokonać wizualnej inspekcji płytki, aby upewnić się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza.Płytka PCR array 96-dołkowa w programie cyklera czasu rzeczywistego. Następnie skonfiguruj cykler czasu rzeczywistego. Następnie wyeksportuj wartości CT dla wszystkich dołków do pustego arkusza Excel w celu analizy danych PCR array; do identyfikacji przewidywanych celów mikroRNA wykorzystuje się dostępny online algorytm PIC ktar.Kliknij tutaj, aby przejść do przewidywania pic ktar dla kręgowców i otworzyć nową stronę w interfejsie sieciowym PIC KTAR. Wybierz gatunek z menu rozwijanego i wprowadź interesujące Cię mikroRNA w polu micro RNA ID. Kliknij search for targets of a micro RNA, aby wyszukać cele dla danego mikroRNA.Przedstawiona zostanie lista docelowych mRNA uszeregowana według wyniku PIC KTAR. Uzyskane rankingi są następnie wykorzystywane do sporządzenia tabeli porównawczej mikroRNA. Plazmid reporterowy z podwójną lucyferazą służy jako narzędzie do walidacji docelowych mRNA; aktywność lucyferazy świetlika oraz lucyferazy nerkowej mierzy się 24 godziny po transfekcji komórek HeLa.Przygotować roztwór roboczy 1, dodając 50 µL substratu do 10 mL roztworu 1 i dokładnie wymieszać. Usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki płytki 24-dołkowej i dodać 300 µL roztworu roboczego 1 do każdej z nich. Przenieść 100 µL zawartości każdej studzienki płytki 24-dołkowej do trzech studzienek płytki 96-dołkowej. Odczekać 10 minut, a następnie zmierzyć aktywność lucyferazy świetlika w luminometrze ustawionym na pomiar luminescencji.Przygotować roztwór roboczy dwa, dodając 50 µL substratu do 10 mL roztworu dwa i dokładnie mieszając. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, zawierającej już 100 µL roztworu roboczego jeden, dodać 100 µL roztworu roboczego dwa. Odczekać 10 minut, a następnie zmierzyć aktywność lucyferazy renal el.Następnie oblicza się stosunek luminescencji lucyferazy świetlikowej do lucyferazy nerkowej. Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie H NSCS na rusztowaniach 3D, uzyskane po barwieniu immunochemicznym na beta three tubulin (kolor zielony) oraz barwieniu przeciwjądrowym Hoechst (kolor niebieski); pomiar wypustek aksonalnych przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Porównanie wzrostu wypustek aksonalnych między H nscs hodowanymi na rusztowaniach 3D a tradycyjnymi kulturami na płaskiej powierzchni (2D) wykazuje, że po jednym lub trzech tygodniach zróżnicowane HSCs w 3D wykazywały większy wzrost wypustek aksonalnych.Analiza obliczeniowa w celu przewidywania celów dostarczyła informacji przedstawionych tutaj: listy przewidywanych genów docelowych dla mikroRNA oraz wartości precyzji i wartości zagregowanych. SOX5 oraz NR4A3 zidentyfikowano jako domniemałe geny docelowe. W celu walidacji celów mikroRNA zastosowano podwójny test reporterowy lucyferazy, jak pokazano tutaj.Względna aktywność lucyferazy z ludzkich reporterów 3' UTR genów SOX5 oraz NR4A3 została znacząco obniżona w obecności wskazanych mikroRNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak różnicować je w komórkach macierzystych neuronów oraz jak badać ekspresję mikroRNA i walidować docelowe mRNA.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Dyferencjacja ludzkiej linii komórek macierzystych neuronów w kulturach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i potencjalnych genów docelowych

Ten film pokazuje rozwój i różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w trójwymiarowym rusztowaniu. Powłoka lamininowa na rusztowaniu sprzyja przyczepianiu się komórek, podczas gdy pożywka nerwowa wolna od czynnika wzrostu indukuje różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe, które rozszerzają swoje procesy w porowatej architekturze w wielu kierunkach, tworząc trójwymiarową...

Różnicowanie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych w kulturę 3D za pomocą porowatego rusztowania

Ten film pokazuje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, czyli hESC, bezpośrednio w neuronalne komórki progenitorowe bez użycia komórek zasilających lub jakichkolwiek etapów pośrednich. Selektywne hamowanie szlaków sygnałowych białka morfogenetycznego kości lub BMP i transformacji czynnika wzrostu-beta lub TGF-β prowadzi do różnicowania hESC w nerwowe komórki progenitorowe lub NPC.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

W tym filmie pokazany jest krok po kroku protokół przekształcania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w organoidy nerwowe. Metoda polega na indukowaniu tworzenia rozety neuronalnej, a następnie kontrolowanej dojrzałości i końcowej hodowli na błonie hydrofobowej w celu uzyskania w pełni rozwiniętych organoidów nerwowych.

Różnicowanie i dojrzewanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do organoidów nerwowych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Odkryj metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych z analizą mikroRNA i walidacją genów docelowych za pomocą testu dual luciferase.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych (Wideo) | JoVE Journal

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Przeglądaj więcej filmów