Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie i przeanalizowanie cząsteczek wydzielanych przez długowieczne pasożyty helmuth, które obniżają odpowiedź immunologiczną gospodarza, umożliwiając w ten sposób przetrwanie pasożytów. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie pasożytów w ich naturalnym środowisku, przewodzie pokarmowym myszy. Drugim krokiem jest wyizolowanie dojrzałych pasożytów od myszy po eutanazji.

Następnie pasożyty helmuth są hodowane w hodowli tkankowej, pożywka wybucha do trzech tygodni, podczas których uwalniają duże ilości cząsteczek wydalniczych, wydzielniczych lub ES. Ostatnim krokiem jest odzyskanie i zagęszczenie uwolnionych cząsteczek z supernatantów hodowlanych w partiach ES do badań biologicznych i biochemicznych. Ostatecznie skoncentrowane supernatanty mogą być testowane bezpośrednio na określonych typach komórek in vitro w celu zbadania zmian w funkcjonowaniu komórek odpornościowych lub podawane myszom w celu przetestowania ich zdolności do tłumienia alergii i innych zaburzeń.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że supresja immunologiczna była związana z zakażeniem żywym pasożytem, co wskazuje na aktywne i trwające uwalnianie cząsteczek immunosupresyjnych od żywych pasożytów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w infekcje pasożytnicze, cząsteczki, odkrywamy, że tłumienie odporności może być bardzo skuteczne w leczeniu kluczowych chorób świata zachodniego, takich jak alergia, autoimmunizacja i nieswoiste zapalenie jelit. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy odzyskiwania i przetwarzania pasożytów pasożytniczych są dość specjalistyczne i wymagają szczególnej uwagi na technikę hodowli aseptycznej.

Ośmiotygodniowe myszy F1 zostaną zakażone larwami H polyus przez zgłębnik doustny w celu produkcji H polyus w cyklu życiowym. Przygotować trzy larwy H polyus L w ilości 2000 na mililitr wody destylowanej, jak opisano w dołączonym protokole. Tekst do podania 400 L trzy na mysz w 200 mikrolitrach przed każdą infekcją.

A edukować zawiesinę larw, odwracając ją pięciokrotnie za pomocą jednomililitrowej strzykawki z dedykowaną igłą do zgłębnika z zaokrąglonym końcem, zassać 200 mikrolitrów zawiesiny larw. Aby wykonać zgłębnik ustny, przytrzymaj mysz w pozycji pionowej za kark szyi i delikatnie przełóż igłębnik przez usta i przełyk do żołądka. Dorosłe robaki i jaja pasożytów zostaną odzyskane od myszy.

14 dni po zakażeniu, 14 dni po zakażeniu. Dorosłe robaki h polyus są zbierane od myszy za pomocą zmodyfikowanego aparatu bayamon przygotowanego w sposób pokazany tutaj. Aby rozpocząć tę procedurę, umyj brzuch zwierzęcia poddanego eutanazji 70% etanolem.

Przetnij skórę na brzuchu i odciągnij do tyłu, aby odsłonić przednią ścianę brzucha. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby wejść do jamy otrzewnej. Usuń całe jelito cienkie i grube od bliższej dwunastnicy do dystalnej odbytnicy.

Umieść go na suchej szalce Petriego. Wyprostuj jelito na całej jego długości, aby wyciąć kał zawierający okrężnicę i umieść je w osobnym naczyniu, aby później odzyskać jaja. Następnie zidentyfikuj proksymalne 20 centymetrów jelita cienkiego, w którym znajdują się dorosłe robaki.

Charakteryzuje się stosunkowo grubą ścianą dwunastnicy i często ma czerwony wygląd z powodu robaków śródświetlnych. Wytnij tę część jelita cienkiego i umieść ją w naczyniu petro z pięcioma mililitrami roztworu Hanka. Podgrzej do 37 stopni Celsjusza za pomocą nożyczek z okrągłymi końcami.

Otwórz wypełnioną robakami proksymalną część jelita wzdłużnie i zeskrob wnętrze wyściółki jelita za pomocą dwóch szklanych szkiełek. Aby usunąć robaki, wyrzuć czystą ścianę jelita. Zbuduj lejek za pomocą rozwiązania Hanka.

Zamknij małą muślinową torebkę i wsyp do niej robaki z dwóch szalek Petriego. Ułóż dwie muślinowe torebki do każdego szklanego lejka i zabezpiecz woreczki spinaczami do papieru wokół krawędzi lejka. Umieść aparat w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch godzin.

W połowie inkubacji delikatnie porusz aparatem, aby usunąć zanieczyszczenia z preparatu jelitowego, które mogą zatkać filtr muślinowy. Należy uważać, aby nie wysypać zanieczyszczeń na zewnątrz torby muślinowej, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie końcowego preparatu HES. Pod koniec inkubacji ostrożnie odłącz probówkę do pobierania od gumowego węża łączącego nad zlewem za pomocą plastikowej pipety, przenieś robaki do probówki o pojemności 50 mililitrów i pozwól robakom osiąść grawitacyjnie.

Usuń nośnik za pomocą paska. Dodaj 40 mililitrów roztworu Hanka i pozwól robakom się uspokoić Powtórz pięć razy, w sumie sześć prań. Unikanie zanieczyszczenia kultury zamglenia ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu.

Od tego momentu kultura robaków musi być utrzymywana w sterylności. Przenieś się do okapu przepływowego Laina i umyj kulturę robaków kolejne sześć razy w sterylnym roztworze Hanka, uzupełnionym antybiotykami za pomocą pipety i zbierz dwie próbki po 20 mikrolitrów do policzenia odzyskanych dorosłych robaków. Oczekuje się, że około 50% ilości zaszczepionych larw zbierze jaja w 14 dniu infekcji, aby zeskrobać kał z wcześniej wyciętej okrężnicy za pomocą kleszczy.

Następnie wymieszaj kał z granulowanym węglem drzewnym w stosunku co najmniej jeden do jednego. Aby uzyskać konsystencję, wystarczy zaparzyć tyle, aby przylegać do wypełnienia papieru. Rozsmaruj cienką warstwę na środku kawałka wilgotnej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i umieść ją w wilgotnym, odpornym na światło pudełku, aby było ciemne przez 12 do 14 dni.

Od siódmego dnia zacznij zbierać L trzy larwy na larwę. Uformuj pierścień wokół krawędzi bibuły filtracyjnej. Wyjmij bibułę filtracyjną z szalki Petriego i użyj pipety, pięciu mililitrów sterylnej wody na płytkę, aby wypłukać larwy, które pozostały na płytce.

Przenieś larwy do 50-mililitrowej probówki. Umieść bibułę filtracyjną z powrotem na naczyniu i wymieniaj w ciemności powtarzanie pobierania larw co tydzień przez okres do jednego miesiąca. Zebrane larwy są następnie myte zgodnie z opisem w tekście protokołu i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wodzie destylowanej.

Aby rozpocząć tę procedurę, namocz robaki w około 10 mililitrach roztworów do zawieszania, uzupełnionych 10% gentamycyną przez 20 minut, pozostawiając rurkę pod kątem, aby upewnić się, że robaki są całkowicie pokryte po 20 minutach. Umyj robaki sześć razy roztworami Hanka, uzupełnionymi antybiotykami, robakami Eloqua do wentylowanych kolb T 25. Umieść kolby pionowo w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy tygodnie, przygotowując produkty wydzielnicze wydalnicze lub HES z robaków.

HES zawierający kulturę. Pożywki pobiera się z kultur w odstępach nie dłuższych niż dwa razy w tygodniu, zastępując je za każdym razem równą objętością pożywki poliusowej. Każdą kolekcję należy przechowywać oddzielnie i wyraźnie oznaczyć datą i numerem partii, ze względu na większe ryzyko zanieczyszczenia LPS i białkami gospodarza.

Pierwszy zbiór po 24 godzinach hodowli powinien zostać odłożony na bok i przetworzony oddzielnie lub wyrzucony do wirówki HES zawierającej pożywkę 400 razy G przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę za pomocą 50-mililitrowej strzykawki i przejść przez 0,2 mikronowy filtr o niskiej zawartości białka do 50-mililitrowych probówek. Następnie połączony HES Supena jest skoncentrowany na filtrze odcinającym o masie cząsteczkowej 3000 w urządzeniu ultrafiltracyjnym pod ciśnieniem azotu, aby najpierw ustawić urządzenie filtrujące, umyć trzykilogramową membranę Daltona błyszczącą stroną do dołu w jednolitrowej zlewce z wodą destylowaną, mieszając.

Zamontuj urządzenie ultrafiltracyjne zgodnie z instrukcjami producenta z membraną filtracyjną błyszczącą stroną do góry, umieść w szafce o temperaturze czterech stopni Celsjusza i przepuść przez nie 50 mililitrów wody destylowanej przed rozpoczęciem zagęszczania wlewanego HES. Uważaj, aby filtr nie wysechł. W razie potrzeby dodać każdą probówkę HES do urządzenia filtrującego, aż objętość zostanie stężona do dwóch do pięciu mililitrów w celu usunięcia aminokwasów i innych składników pożywki do hodowli tkankowych.

Z preparatu HES dodać 50 mililitrów PBS wolnego od pirotechniki do urządzenia filtrującego, a następnie stężyć do około dwóch mililitrów. Powtórz ten krok dwukrotnie. Używając łącznie 150 mililitrów PBS, przenieś ES do strzykawki i wysterylizuj filtr za pomocą filtra 0,2 mikrona.

Po zmierzeniu stężenia białka podwielokrotną etykietę z numerem partii i datą i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zgłębnik doustny trzech larw o pojemności 400 litrów służy do utrzymania cyklu życiowego H poly gyus u myszy F1. Wynikowe obciążenia dorosłych robaków są pokazane tutaj.

Partie HES mają udowodnioną powtarzalną skuteczność w testach funkcjonalnych i w składzie białkowym. Co więcej, gdy analizowano supernatanty z każdego kolejnego tygodnia hodowli, okazało się, że profile białek są bardzo podobne przez łącznie do czterech tygodni. Kiedy stężenie TS jest mierzone za pomocą testu Bradforda, całkowite białko wynosi zwykle około jednego miligrama na mililitr.

Pokazano wydajność białka HES z 11 różnych partii pochodzących z około 500 mililitrów supernatantu kultury. Unikanie zanieczyszczenia ma kluczowe znaczenie podczas zbierania HES, gdy poziomy zanieczyszczenia LPS w 41 partiach HES mierzono za pomocą testu rąbka AAMI CYTE. Stwierdzono, że większość partii HES znajduje się znacznie poniżej zalecanego progu zanieczyszczenia.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu starannej sterylnej techniki ustawiania kultur. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak proteomika, frakcjonowanie białek i analiza lipidów glikanów i mikroRNA, mogą być wykonane w celu pełnego zrozumienia spektrum produktów molekularnych uwalnianych przez te pasożyty.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozmnażać poly limus. Moid jest poliusowy i zbiera produkty DS z hodowanych dorosłych robaków w celu przetestowania ich wpływu na układ odpornościowy. Chociaż pasożyt ten nie jest skuteczny dla ludzi, ważne jest, aby przestrzegać środków ostrożności i przestrzegać określonego protokołu, aby zapewnić odtwarzalność między partiami Hessa.