Name: Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Poznaj metodę hodowli Heligmosomoides polygyrus i izolacji wydzielanych produktów immunomodulujących w celu badania mechanizmów supresji odpowiedzi immunologicznej u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są finansowani przez Wellcome Trust poprzez Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) i Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) oraz fundusze Fellowship (J.R.G.), BBSRC (G.C.), American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. i R.M.M.), Asthma UK (H.J.M.) oraz Rainin Foundation (D.J.S. i R.M.M.).

UWAGA: Wszystkie procedury w tym protokole są wykonywane zgodnie z wytycznymi określonymi przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych Wielkiej Brytanii i Służby Weterynaryjne Uniwersytetu w Edynburgu.
1. Zakażenie myszy przez zgłębnik
<ol>
	<li>Larwy Heligmosomoides polygyrus L3 należy przechowywać w wodzie destylowanej przez okres do sześciu miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przed użyciem przemyć larwy L3 trzykrotnie w wodzie destylowanej: odwirować przy 300 x g przez 10 minut (z hamulcem), usunąć wszystko oprócz 500 μl wody (aby uniknąć zakłócenia granulowanych larw L3) i za każdym razem ponownie zawiesić osad</li>.
	<li>Do trzeciego prania dodaj wodę do dokładnej objętości (zwykle 40 ml) i odessaj 20 μl z naciętą końcówką o objętości 200 μl, aby poszerzyć jej otwór. Umieścić dwie próbki o objętości 20 μl na powierzchni szalki hodowlanej o średnicy 60 mm i policzyć larwy L3 (zwykle ruchome i najlepiej oglądać je pod 50-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu preparacyjnego). Zawiesić końcowe osady w wodzie destylowanej do stężenia 2 000 larw L3 na ml.</li>
	<li>W celu produkcji cyklu życiowego należy zainfekować 8-tygodniowe myszy F1 (C57BL/6xCBA) 400 larwami H. polygyrus L3 w 200 μl wody destylowanej przez zgłębnik doustny (myszy należy przytrzymać w pozycji pionowej za kark szyi i delikatnie wprowadzić igłę przez usta i przełyk do żołądka). Przed każdym zakażeniem dokładnie wymieszać (larwy szybko osadzają się w wodzie) i odessać 200 μl do strzykawki o pojemności 1 ml; Użyj dedykowanej igły do zgłębnika z zaokrąglonym końcem. W przypadku eksperymentalnego zakażenia młodszych myszy (w wieku 6-8 tygodni) lub innych szczepów wsobnych (np. C57BL/6 lub BALBc) należy zainfekować myszy 200 larwami L3.</li>
</ol>
2. Rozmnażanie i utrzymanie H. polygyrus
<ol>
	<li>Umieść węgiel drzewny na środku dużej plastikowej wanny i pozwól, aby zimna woda z kranu spływała po niej przez co najmniej 30 minut (niemyty węgiel aktywny jest toksyczny dla larw L3). Spuść wodę z wanny i umieść węgiel drzewny na dwóch warstwach chłonnego papieru, pozostawiając go wystawionym na działanie powietrza w pomieszczeniu do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Jeśli potrzebne są jaja, najpierw zeskrob kał z okrężnicy za pomocą kleszczy (i nożyczek, jeśli to konieczne). Jeśli potrzebna jest duża liczba larw L3, umieść myszy na siatce drucianej i zbieraj granulki kału przez kilka dni.</li>
	<li>Wymieszaj kał z granulowanym węglem drzewnym w stosunku co najmniej 1:1, aby uzyskać konsystencję wystarczająco wilgotną, aby przylegała do bibuły filtracyjnej. Rozsmaruj cienką warstwę na środku zwilżonej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i umieść ją w wilgotnym pudełku (dodaj wilgotny ręcznik papierowy i naczynie z wodą) w ciemności na 12-14 dni.</li>
	<li>Począwszy od 7 dnia, należy usunąć larwy L3 i zebrać je co najmniej dwa razy przed wyrzuceniem papieru. Larwy tworzą pierścień wokół krawędzi bibuły filtracyjnej; Wyjąć bibułę filtracyjną z płytki Petriego i wypłukać larwy pozostałe z płytki (za pomocą pipety i 5 ml sterylnej wody na płytkę) do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zdjąć bibułę filtracyjną i zebrać pozostałe larwy pozostawione na płytce z wodą destylowaną do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować roztwór ściekowy o stężeniu 300 x g przez 10 minut. Larwy należy trzykrotnie przemyć wodą destylowaną, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w ilości do 50 ml wody destylowanej, aż będą potrzebne. 
	UWAGA: Larwy pozostają żywotne i zakaźne przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Kolekcja dorosłych robaków H. polygyrus
<ol>
	<li>Zmodyfikowaną aparaturę Baermanna należy wcześniej przygotować, jak pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Ubój myszy czternaście dni po zakażeniu.</li>
	<li>Umyj brzuch 70% etanolem. Przetnij skórę na brzuchu i odciągnij do tyłu, aby odsłonić przednią ścianę brzucha. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby wejść do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Usuń całe jelito cienkie i grube (od bliższej dwunastnicy do dystalnej odbytnicy). Umieść na suchej szalce Petriego.</li>
	<li>Wyprostuj jelito na całej jego długości, wytnij okrężnicę zawierającą kał, a następnie umieść ją w osobnym naczyniu do przygotowania jajek.</li>
	<li>Wytnij proksymalne 20 cm jelita cienkiego, które zawiera dorosłe robaki – identyfikowane przez stosunkowo grubą ścianę dwunastnicy i często czerwony wygląd spowodowany robakami wewnątrzświetlnymi. Umieścić na szalce Petriego o średnicy 100 mm z 5 ml roztworu Hanksa, ogrzanego do temperatury 37 °C (dwie próbki na szalkę).</li>
	<li>Otwórz wypełnioną robakami proksymalną część jelita wzdłuż nożyczek (najlepsze są do tego nożyczki z okrągłymi końcami) i zeskrob wnętrze wyściółki jelita za pomocą dwóch szklanych szkiełek, aby usunąć robaki. Następnie wyrzuć czystą ścianę jelita.</li>
	<li>Wrzuć robaki do małych muślinowych woreczków, zamknij zszywki i zabezpiecz spinaczami do papieru wokół krawędzi szklanego lejka (Rysunek 1).</li>
	<li>Napełnij lejek roztworem Hanksa i dodaj około 4 szalki Petriego robaków do każdego lejka.</li>
	<li>Umieść aparaturę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1-2 godziny, delikatnie mieszając w połowie, aby usunąć zanieczyszczenia z preparatu jelitowego, które mogą zasłaniać filtr muślinowy. Należy uważać, aby nie wysypać zanieczyszczeń na zewnątrz woreczka muślinowego – spowoduje to zanieczyszczenie końcowego preparatu HES. Dorosłe robaki powinny powoli migrować przez muślinową tkaninę i osiąść na dnie szklanej probówki. Ostrożnie odłącz probówkę od gumowego węża łączącego nad zlewem (uważając, aby w tym momencie nie zgubić robaków).</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety przenieś robaki do probówki o pojemności 50 ml i przemyj sześć razy roztworem Hanksa (pozwól robakom osiąść grawitacyjnie, usuń podłoże paskiem, dodaj 40 ml roztworu Hanksa i powtórz pięć razy). 
	UWAGA: od tego momentu kultura robaków musi być utrzymywana w sterylności.
	<ol>
		<li>Przenieś do okapu z przepływem laminarnym i umyj kolejne sześć razy w sterylnym roztworze Hanksa uzupełnionym 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, gotowym do hodowli in vitro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz dorosłe robaki, które zostały odzyskane, pobierając dwie próbki o objętości 20 μl pobrane z żółtą końcówką naciętą w celu poszerzenia jej otworu; spodziewaj się około 50% ilości zaszczepionych larw.</li>
</ol>
4. Ustawianie kultur dla HES: przygotowanie podłoża, mycie dorosłych robaków
<ol>
	<li>Namocz robaki z 3.11 w około 10 ml RPMI uzupełnionym 10% gentamycyną przez 20 minut, pozostawiając probówkę pod kątem, aby upewnić się, że robaki są całkowicie zakryte.</li>
	<li>Wykonaj to w okapie z przepływem laminarnym: przemyj ponownie sześć razy roztworem Hanksa (uzupełnionym 5 j./ml penicyliny i 5 μg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Przygotować pożywkę dla H. polygrus.</li>
	<li>Zachowując sterylność w okapie z przepływem laminarnym, do 500 ml RPMI1640 dodać 11,1 ml 45% glukozy (stężenie końcowe 1,2%, ponieważ RPMI1640 zawiera 0,2% glukozy), 5 ml 100x Penicyllina-Streptomycyna (stężenie końcowe 5 U/ml penicyliny, 5 μg/ml streptomycyny), 5 ml L-glutaminy (stężenie końcowe 2 mM) i 5 ml Gentamycyny (stężenie końcowe 1%). Nie dodawaj FCS.</li>
	<li>Porcje robaków umieścić w wentylowanych kolbach T25, ok. 1 000 robaków w 15 ml pożywki H. polygyrus na kolbę i umieścić pionowo w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5% CO2) na 3 tygodnie.</li>
</ol>
5. Przygotowanie HES
<ol>
	<li>Pożywki hodowlane zawierające HES należy pobierać z kultur w odstępach nie dłuższych niż dwa razy w tygodniu, odkładając na bok pierwsze pobranie po 24 godzinach hodowli (ze względu na wysoki poziom zanieczyszczenia LPS i białkami gospodarza – mogą być przetwarzane oddzielnie lub odrzucane). Każdą kolekcję należy przechowywać oddzielnie i wyraźnie oznaczyć datą i numerem partii. Za każdym razem zastępować równą objętością podłoża H. polygyrus.</li>
	<li>Odwirować pożywkę zawierającą HES przy 400 x g przez 5 min. Następnie przesterylizuj filtr przez filtry o niskiej zawartości białka 0,2 μm do probówek o pojemności 50 ml. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C, wyraźnie oznaczonej datą zbioru robaków i datą pobrania HES.</li>
	<li>Po 21 dniach zbierania HES z hodowli wyrzuć robaki.</li>
	<li>Zebrać 500-1 000 ml supernatantu HES (zwykle z zamrożonego bulionu, nie licząc pierwszego 24-godzinnego zbioru) i stężyć na filtrze 3 000 MWCO w urządzeniu do ultrafiltracji pod ciśnieniem azotu. 
	UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, aby filtr nie wysechł.
	<ol>
		<li>Aby ustawić urządzenie filtrujące, najpierw umyj membranę 3 kDa błyszczącą stroną do dołu w 1-litrowej zlewce z wodą destylowaną przez 3 x 20 minut, mieszając. Zamontuj urządzenie do ultrafiltracji zgodnie z instrukcjami producenta z membraną filtracyjną błyszczącą stroną do góry. Umieścić w komorze w temperaturze 4 °C i przepuścić przez nią 50 ml wody destylowanej przed rozpoczęciem zagęszczania połączonego HES.</li>
		<li>W razie potrzeby dodać każdą probówkę HES do urządzenia filtrującego (100-140 ml dziennie), aż objętość zostanie zagęszczona do 2-5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu usunięcia zanieczyszczeń z pożywki hodowlanej zawierającej HES, dodać 50 ml PBS wolnego od pirogenów do urządzenia filtrującego, a następnie zagęścić do około 2 ml. Powtórzyć ten krok dwukrotnie (łącznie 150 ml PBS). Przenieść HES do probówki o pojemności 15 ml, przefiltrować, wysterylizować (z filtrem 0,2 μm) w okapie z przepływem laminarnym i zmierzyć stężenie białka za pomocą spektrofotometru (E280 = 10) lub testu Bradforda.</li>
	<li>Podwielokrotność, oznaczyć etykietą z numerem partii i datą, a następnie zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przed użyciem należy wykonać chromogenny test LAL zgodnie z protokołami producenta na każdej partii HES. Jeśli poziomy LPS są większe niż 1 U LPS na 1 μg białka, należy rozważyć niestosowanie tej partii do eksperymentów in vivo lub hodowli in vitro.</li>
	<li>Przetwarzaj HES zebrany po 24 godzinach oddzielnie w ten sam sposób; będzie on zawierał LPS i niektóre białka gospodarza i, chociaż nie nadaje się do eksperymentów funkcjonalnych, jest użytecznym źródłem pojedynczych cząsteczek, które można wyizolować przez oczyszczanie powinowactwa przeciwciał monoklonalnych.</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Cykl życiowy H. polygyrus przebiega w niezawodnie spójny sposób. Po naturalnym spożyciu lub doustnym zgłębniku larw L3 w dniu 0, torbiele zaczynają tworzyć się pod błoną surowiczą dwunastnicy w 5 dniu, przechodząc w linienie larwalne, a następnie pojawiając się jako dorosłe robaki w świetle jelita od 10 dnia, jaja można zobaczyć w kale od 14 dnia, a ziarniniaki są widoczne na powierzchni surowiczości dwunastnicy od 21 dnia. Protokół opisany powyżej (i podsumowany na rycinie 6) pozwala na wysokoprzepustową produkcję produktów wydalniczo-wydzielniczych H. polygyrus (HES), a także na niezawodne odzyskiwanie żywotnych larw L3 do przyszłych infekcji eksperymentalnych i związanych z cyklem życia.
Wykazano, że zakażenie H. polygyrus działa ochronnie w modelach astmy zależnych od OVA lub Der p 1 (alergen roztoczy kurzu domowego)14. Co więcej, tłumienie zapalenia dróg oddechowych może być przenoszone za pomocą limfocytów T regulatorowych CD4 + CD25 + 14 lub limfocytów Bregulatorowych B CD19 + CD23 24 od nieuczulonych myszy zakażonych H. polygyrus. W modelach autoimmunizacji wykazano, że zakażenie H. polygyrus jest supresyjne w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) stwardnienia rozsianego 9, a supresja może być przenoszona za pomocą limfocytów T CD4 + lub limfocytów B CD19 + od zakażonych myszy 24.
Produkty wydalniczo-wydzielnicze Heligmosomoides polygyrus (HES) modulują odpowiedź immunologiczną gospodarza i hamują stan zapalny za pośrednictwem Th2 za pomocą wielu mechanizmów (opisanych na rycinie 7), w tym: a) hamowania odpowiedzi komórek dendrytycznych na stymulację 25, b) indukcji limfocytów T regulatorowych CD4 + Foxp3 + 18 . oraz c) blokada produkcji Ił-33 20. Wykazano, że HES jest ochronny, gdy jest podawany w momencie uczulenia lub prowokacji w modelu OVA-ałun astmy 19, a także gdy jest podawany donosowo z alergenem ekstraktu Alternaria 20, poprzez hamowanie wczesnego uwalniania IL-33. Unikanie zanieczyszczenia HES LPS jest często kluczowe dla powodzenia przyszłych eksperymentów immunologicznych. W przedstawionym tutaj protokole kluczowymi krokami w osiągnięciu tego celu są zapewnienie, że zanieczyszczenia znajdujące się w muślinowych workach aparatu Baermanna nie dostaną się do końcowego preparatu HES (patrz 2.10) oraz odłożenie roztworu ES z pierwszych 24 godzin hodowli (patrz 5.1).
W ostatnich latach HES został dokładnie scharakteryzowany na poziomie proteomicznym z ponad 370 odrębnymi zidentyfikowanymi białkami 26,27. Ponadto ES z larw 4. stadium poddano analizie proteomicznej 28. Trwające prace obejmują scharakteryzowanie głównych składników glikanowych HES, o których wiadomo, że są silnie immunogenne 3, oraz wydzielanych mikro-RNA, które są zamknięte w pęcherzykach lub egzosomach o długości 50-100 nm (Buck i wsp., przedłożone do publikacji). Dzięki ustanowieniu powtarzalnych protokołów pobierania ES z tego wysoce immunomodulującego pasożyta oraz przy obszernych danych proteomicznych identyfikujących składniki molekularne HES, przygotowano grunt pod identyfikację i testowanie terapeutyczne pojedynczych cząsteczek H. polygyrus , które mogą pośredniczyć w kluczowych skutkach dla układu odpornościowego gospodarza.

Heligmosomoides polygyrus to naturalny mysi robak żołądkowo-jelitowy, który jest blisko spokrewniony z bardzo rozpowszechnionymi ludzkimi pasożytami nicieni 1. W przeciwieństwie do innych modeli nicieni, takich jak Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsekwentnie ustanawia przewlekłą infekcję u myszy jako bezpośredni wynik wielu silnych mechanizmów immunomodulacyjnych, które wykorzystuje do tłumienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza 2.
H. polygyrus ma bezpośredni cykl życiowy: zakaźne larwy L3 są spożywane przez transmisję feko-oralną (lub podawane przez zgłębnik w warunkach laboratoryjnych), po czym migrują do warstwy podsurowiczej dwunastnicy i torbu przed powrotem do światła jelita jako dorosłe robaki około ośmiu dni po początkowym zakażeniu. Krycie i produkcja jaj następuje w 10 dniu, a od 14 dnia można zbierać dorosłe robaki w celu hodowli i pobierania produktów wydalniczych i wydzielniczych. H. polygyrus wchodzi również w interakcję z mikroflorą komensalną, ze zwiększoną obecnością pałeczek kwasu mlekowego u zakażonych podatnych myszy 4-6 i zwiększonym poziomem infekcji H. polygyrus po ekspozycji myszy na Lactobacilli 6.
Wykazano, że aktywne zakażenie H. polygyrus chroni przed immunopatologią w wielu zwierzęcych modelach autoimmunizacji 7-10, zapalenia jelita grubego 11,12 i alergii 13-16. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie potencjałem cząsteczek wydalniczo-wydzielniczych tego pasożyta ("HES") do obniżania patologii in vivo 17,18. Rzeczywiście, efekty ochronne obserwuje się po leczeniu myszy produktami HES 19 poprzez szlaki, które są obecnie identyfikowane 18,20. W tym miejscu opisujemy protokół niezawodnej produkcji Heligmosomoides polygyrus i odzyskiwania wydzielanych przez niego produktów, które mogą być dalej wykorzystywane do szeregu funkcjonalnych badań biochemicznych i immunologicznych.

<table><tbody><tr><td>Koncentrator Amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Buforowany roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Węgiel aktywny</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Roztwór glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% roztwór http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Probówki Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>Kolby T25</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>Kolba wentylowana 25cm http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenny test LAL</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 test http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; bez L-glutaminy http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

hodowla heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (dawniej znany jako Nematospiroides dubius, a także określany przez niektórych jako H. bakeri) to robak żołądkowo-jelitowy, który wykorzystuje wiele mechanizmów immunomodulacyjnych do wywoływania przewlekłych infekcji u myszy i bardzo przypomina powszechne infekcje ludzkimi robakami pasożytniczymi. H. polygyrus był szeroko badany w dziedzinie regulacji immunologicznej pochodzącej od robaków pasożytniczych i stwierdzono, że silnie tłumi eksperymentalne modele alergii i autoimmunizacji (zarówno w przypadku aktywnej infekcji, jak i izolowanych wydzielanych produktów). Protokół opisany w tym artykule przedstawia zarządzanie cyklem życiowym H. polygyrus w celu konsekwentnej produkcji larw L3, odzyskiwania dorosłych pasożytów i zbierania ich produktów wydalniczo-wydzielniczych (HES).

Podatność na zakażenie H. polygyrus jest w dużej mierze kontrolowana przez tło genetyczne szczepu myszy (Tabela 1); myszy C57BL/6 i CBA wykazują wysoką podatność 21,22. W celu utrzymania cyklu życiowego pasożyta wybrano hybrydę F1 między tymi dwoma szczepami ze względu na jej zdolność do zniesienia znacznie wyższego obciążenia nicieniami bez wystąpienia zachorowalności (nadmiernego uszkodzenia nabłonka jelitowego) w porównaniu z którymkolwiek ze szczepów rodzicielskich. Do utrzymania cyklu życiowego u myszy F1 stosuje się gavage doustny 400 larw L3 (co skutkuje obciążeniem dorosłymi nicieniami pokazanym na Rysunku 2), natomiast w eksperymentach na homozygotycznych szczepach inbredowych (np. C57BL/6 lub BALBc) zazwyczaj stosuje się dawkę 200 larw L3. Jednakże dawkę tę należy być może zmniejszyć w zależności od kofaktorów środowiskowych, które mogą się różnić między ośrodkami dla zwierząt, takich jak różnice w florze jelitowej.
Partie HES wykazały powtarzalną skuteczność w testach funkcjonalnych oraz w składzie białkowym; ponadto, po analizie supernatantów z każdego kolejnego tygodnia hodowli, aż do łącznego okresu 4 tygodni, stwierdzono, że profile białkowe są bardzo podobne (Rysunek 3). Kiedy stężenie HES jest mierzone metodą Bradforda (patrz 5.5), całkowita zawartość białka wynosi zazwyczaj około 1 mg/ml (Rysunek 4).
Alternatywną metodą zagęszczania HES jest zastosowanie koncentratora odśrodkowego (np. membrana Vivaspin z progiem odcięcia 3-kDa), w którym próbki wiruje się z prędkością do 4,000 g w wirówce z rotorem kątowym, usuwając sole buforowe i składniki o niskiej masie cząsteczkowej. Koncentracja odśrodkowa najlepiej sprawdza się przy małych objętościach przetwarzania (1-10 ml) i jest ograniczona do maksymalnego stopnia zagęszczenia wynoszącego około 30x.
Podczas pobierania HES kluczowe jest unikanie kontaminacji. Aby zapobiec zanieczyszczeniu cząsteczkami gospodarza, odrzucamy pożywki zawierające HES z pierwszych 24 h po pozyskaniu dorosłych robaków z jelit myszy. Ilość kontaminacji LPS w każdej partii HES oznaczamy za pomocą chromogenicznego testu LAL (patrz 5.7). 1 U LPS odpowiada ok. 100 pg LPS, a poziomy poniżej tej wartości uznaje się za pomijalne 23. W naszych badaniach większość partii HES znajduje się znacznie poniżej tego limitu, a średnie stężenie LPS w HES wynosiło 0,23 U/µg (Rysunek 5). Wywołanie efektów LPS w modelach patologii in vivo (na przykład supresja odpowiedzi astmatycznej) wymaga co najmniej 10 ng LPS 23. Zatem podanie in vivo 5 µg HES z partii zawierającej 100 pg LPS/µg HES dostarczy 500 pg LPS, co jest wartością znacznie poniżej stężenia efektywnego, przy którym LPS staje się problemem.
<img alt="Schemat aparatury lejkowej do izolowania dorosłych nicieni z użyciem worków z muślinu i filtracji w roztworze Hanksa." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Aparatura Baermanna Konfiguracja aparatury Baermanna do zbierania dorosłych H. polygyrus (opisana w sekcji 2).
<img alt="Analiza obciążenia robakami; wykres rozrzutu; liczba dorosłych robaków; zakażenie; parazytologia; dane statystyczne." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Średnie obciążenie robakami 14 dni po zakażeniu 400 larwami L3 Średnie obciążenie robakami 14 dni po zakażeniu 400 larwami L3. Przedstawione punkty danych pochodzą z 19 oddzielnych serii zakażeń myszy C57BL/6xCBA. Przedstawiono średnią ± SEM.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE pokazujący wielkości białek w kilodaltonach (kDa) w kolejnych tygodniach." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Profile białkowe HES z kolejnych tygodni hodowli Profil SDS-PAGE białek HES pobranych w kolejnych tygodniach hodowli.
<img alt="wykres rozrzutu przedstawiający ilość HES z 500 ml pożywki ES; punkty danych wraz ze średnią i odchyleniem standardowym" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Końcowa ilość HES z 500 ml pożywki zawierającej ES Wydajność białka HES z 11 różnych partii pochodzących z około 500 ml nadsączu hodowli. Przedstawiono średnią ± SEM.
<img alt="Wykres zanieczyszczenia LPS, jednostki na mg HES, zaznaczony próg, punkty danych powyżej progu." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zanieczyszczenie HES LPS Poziomy zanieczyszczenia LPS w 41 partiach HES zmierzone za pomocą testu limulocytowego (LAL). Mediana stężenia LPS = 86 U na mg HES.
<img alt="Mouse infection experimental process for H. polygyrus larvae lifecycle; diagram with equipment steps." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
Rycina 6: Animowany schemat H. polygyrus Cykl życia Podsumowanie kluczowych etapów cyklu życiowego: od podania doustnego larw L3, przez odzyskiwanie larw i dorosłych osobników, aż po izolację HES.
<img alt="Schemat odpowiedzi immunologicznej: pęcherzyki, Tregs, komórki Th2, IL-33, hamowanie stanu zapalnego, zapobieganie alergiom." src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Animowany schemat HES i jego funkcji Kluczowe efekty immunomodulacyjne rozpuszczalnych mediatorów i egzosomów zawartych w HES.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Genotyp (oraz szczep tła)</td>
			<td>Fenotyp infekcji pierwotnej</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linie inbredowe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/J, CBA, C3H </td>
			<td>Wysoka podatność </td>
			<td>22,29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 i C57BL/10 </td>
			<td>Wrażliwy </td>
			<td>22,30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c, DBA/2, 129/J </td>
			<td>Poziom średniozaawansowany </td>
			<td>22,31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH, SJL, SWR</td>
			<td>Niska podatność </td>
			<td>22,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Transgeniczne dla cytokin lub receptorów cytokinowych</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1β-/-</td>
			<td>Bardziej podatny</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">IL-1R-/-</td>
			<td rowspan="2">Mniejsza podatność (a); brak zmian w podatności, lecz zwiększona liczba ziarniniaków (b)</td>
			<td>(a) 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(b) 34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeniczne myszy IL-2Rβ (C57BL/6)</td>
			<td>Oporny </td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4-/-</td>
			<td>Wyższa płodność</td>
			<td>36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4R-/- (C57BL/6 lub BALB/c)</td>
			<td>Wysoka podatność</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6–/– (BALB/c lub C57BL/6)</td>
			<td>Wysoka oporność </td>
			<td>37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeniczne (FVB) dla IL-9 </td>
			<td>Oporny </td>
			<td>38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21R –/– (C57BL/6)</td>
			<td>Niedobór Th2, zmniejszone tworzenie ziarniniaków</td>
			<td>39,40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-25-/- (BALB/c)</td>
			<td>Bardziej podatne</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-33R (T1/ST2) -/- (BALB/c)</td>
			<td>Brak zmian w podatności</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFβRIIdn (C57BL/6)</td>
			<td>Wysoki poziom Th1, zwiększona podatność</td>
			<td>41,42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Transgeniczne dla markerów limfocytów T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28–/– (BALB/c) </td>
			<td>Nieznacznie wyższa płodność</td>
			<td>43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (B7-2)–/– (BALB/c) </td>
			<td>Wyższa płodność </td>
			<td>44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OX40L–/– (BALB/c) </td>
			<td>Wyższa płodność </td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Transgeniczne loci odporności wrodzonej </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myszy z nokautem receptora interferonu typu 1 (IFNAR)-/- (C57BL/6) </td>
			<td>Wyższa płodność, więcej ziarniniaków</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyD88–/– (C57BL/6) </td>
			<td>Większa oporność, więcej ziarniniaków</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-KitW/Wv (WBB6) </td>
			<td>Bardziej podatny</td>
			<td>46,47</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pierwotne zakażenia H. polygyrus u genetycznie zróżnicowanych oraz celowanych genowo szczepów myszy.

Heligmosomoides polygyrus to mysi nicień o potężnych zdolnościach immunomodulacyjnych, które są bardzo podobne do tych z bardzo rozpowszechnionej infekcji ludzkim robakiem pasożytniczym. W tym miejscu opisujemy protokół długoterminowego utrzymania cyklu życiowego H. polygyrus.

Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pobranie i analiza cząsteczek wydzielanych przez długowieczne pasożyty z rodzaju helminty, które hamują odpowiedzi immunologiczne gospodarza, umożliwiając tym samym przetrwanie pasożytów. Jest to realizowane poprzez hodowlę pasożytów w ich naturalnym środowisku, czyli w przewodzie pokarmowym myszy. Drugim krokiem jest wyizolowanie dojrzałych pasożytów z myszy po przeprowadzeniu eutanazji.Następnie pasożyty Helminthes są hodowane w pożywce tkankowej przez trzy tygodnie, podczas których uwalniają one obfite ilości cząsteczek wydzielniczo-egzkrecyjnych (ES). Ostatnim krokiem jest odzyskanie i skoncentrowanie uwolnionych cząsteczek z supernatantów hodowli w partie ES przeznaczone do badań biologicznych i biochemicznych. Ostatecznie skoncentrowane supernatanty mogą być testowane bezpośrednio na konkretnych typach komórek in vitro w celu zbadania zmian w funkcji komórek odpornościowych lub podawane myszom w celu sprawdzenia ich zdolności do tłumienia alergii oraz innych zaburzeń.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że immunosupresja jest powiązana z infekcją żywymi pasożytami, co wskazuje na aktywny i ciągły uwalnianie cząsteczek immunosupresyjnych przez żywe pasożyty. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat infekcji pasożytniczych, odkryte przez nas cząsteczki hamujące odporność mogą okazać się bardzo skuteczne w leczeniu kluczowych chorób świata zachodniego, takich jak alergie, autoimmunizacja i nieswoiste zapalenia jelit. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy odzyskiwania i przetwarzania pasożytów z grupy nicieni są dość specjalistyczne i wymagają szczególnej uwagi w zakresie technik hodowli aseptycznej.Osimiotygodniowe myszy F1 zostaną zainfekowane larwami H polyus poprzez zgłębnik doustny w celu przeprowadzenia cyklu życiowego H polyus. Przygotować larwy L3 H polyus w stężeniu 2000 na mililitr wody destylowanej zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole. Podać 400 L3 na mysz w 200 microliters przed każdą infekcją.Ujednolicone zawiesinę larw poprzez pięciokrotne odwrócenie jej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dedykowaną igłą do gavage o zaokrąglonym końcu, a następnie pobierz 200 µL zawiesiny larw. Aby przeprowadzić gavage doustny, unieruchom mysz w pozycji pionowej, chwytając ją za kark, i ostrożnie wprowadź tępą igłę do gavage przez pysk i przełyk do żołądka. Z organizmu myszy zostaną odzyskane dorosłe postaci robaków oraz jaja pasożytów.14 dni po zakażeniu, 14 dni po zakażeniu. Dorosłe nicienie h polyus są pobierane z myszy przy użyciu zmodyfikowanego aparatu bayamon przygotowanego zgodnie z przedstawioną procedurą. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przemyć brzuch uśmierconego zwierzęcia 70% ethanol.Naciąć skórę nad brzuchem i odciągnąć ją, aby odsłonić przednią ścianę brzucha. Wykonać cięcie w linii pośrodkowej, aby dostać się do jamy otrzewnowej. Usunąć cały jelito cienkie i grube, od proksymalnej części dwunastnicy do dystalnej części odbytnicy.Umieść go w suchej szalce Petriego. Wyprostuj jelito na całej jego długości, wycinając fragment jelita grubego zawierający kał, i umieść go w osobnej szalce, aby później odzyskać jaja. Następnie zidentyfikuj proksymalne 20 centymetrów jelita cienkiego, w którym znajdują się dorosłe postaci glist.Charakteryzuje się ona stosunkowo grubą ścianą dwunastnicy i często ma czerwone zabarwienie ze względu na obecność nicieni w świetle jelita. Wyciąć ten fragment jelita cienkiego i umieścić go w szalce Petriego z 5 mL roztworu Hank'a. Podgrzać do 37 °C, używając nożyczek z zaokrąglonymi końcami.Otwórz wzdłużnie proksymalną część jelita wypełnioną nicieniami i zeskrob wnętrze wyściółki jelitowej za pomocą dwóch szkiełek podstawowych. Aby usunąć nicienie, odrzuć oczyszczoną ścianę jelita. Napełnij lejek roztworem Hanksa.Zamknij mały woreczek z muślinu za pomocą zszywacza i przesyp do niego dżdżownice z dwóch szalek Petriego. Przymocuj po dwa woreczki muślinowe do każdego szklanego lejka, zabezpieczając je klipsami biurowymi wokół krawędzi lejka. Umieść aparat w inkubatorze w temperaturze 37 °C na jedną do dwóch godzin.W połowie czasu inkubacji delikatnie potrząśnij aparaturą, aby usunąć resztki z preparatu jelitowego, które mogłyby zapchać filtr z muślinu. Należy uważać, aby resztki nie wydostały się poza woreczek muślinowy, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie końcowego preparatu HES. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odłącz probówkę zbiorczą od łączącego ją gumowego węża nad zlewem, używając plastikowej pipety, przenieś nicienie do probówki o pojemności 50 mililitrów i pozwól im osiąść pod wpływem grawitacji.Usunąć pożywkę za pomocą pipety Pasteura. Dodać 40 mililitrów roztworu Hanksa i odczekać, aż nicienie osiądą na dnie. Powtórzyć czynność pięć razy, aby łącznie przeprowadzić sześć przemyć. Unikanie kontaminacji hodowli mętnej jest kluczowe dla powodzenia tego protokołu.Od tego momentu hodowla nicieni musi być utrzymywana w warunkach sterylnych. Przenieś hodowlę pod laminarny przepływ powietrza i przemyj ją kolejnych sześć razy w sterylnym roztworze Hank'a z dodatkiem antybiotyków, używając pipety, a następnie pobierz dwie próbki po 20 µL w celu policzenia odzyskanych dorosłych nicieni. Oczekuje się, że około 50% ilości zaszczepionych larw zniesie jaja w 14. dniu infekcji; należy wówczas zebrać kał z wcześniej wyciętą okolicą okrężnicy za pomocą pęsety.Następnie należy zmieszać kał z węglem granulowanym w stosunku co najmniej jeden do jednego. Aby uzyskać konsystencję wystarczającą do przylegania i wypełnienia papieru, należy dobrać odpowiednią ilość składników. Rozprowadzić cienką warstwę mieszaniny w centrum zwilżonego papieru filtracyjnego w szalce Petriego, a następnie umieścić ją w wilgotnej, światłoszczelnej skrzynce i przechowywać w ciemności przez 12 do 14 dni.Od siódmego dnia rozpocznij zbieranie larw w trzecim stadium rozwojowym (L3). Utwórz pierścień wokół krawędzi papieru filtracyjnego. Podnieś papier filtracyjny z szalki Petriego i użyj pipety, aby przepłukać pozostałe na szalce larwy, stosując 5 ml sterylnej wody na każdą szalkę.Przenieś larwy do probówki o pojemności 50 ml. Włóż papier filtracyjny z powrotem do szalki i odstaw w ciemne miejsce; powtarzaj zbieranie larw co tydzień przez okres do jednego miesiąca. Zebrane larwy należy następnie przemyć zgodnie z opisem w tekście protokołu i przechowywać w temperaturze 4 °C w wodzie destylowanej.Aby rozpocząć tę procedurę, należy namoczyć nicienie w około 10 mililitrach roztworu Hanksa z dodatkiem 10% gentamycyny przez 20 minut, pozostawiając probówkę pod kątem, aby upewnić się, że nicienie są całkowicie przykryte po 20 minutach. Nicienie należy przemyć sześć razy roztworem Hanksa z dodatkiem antybiotyków, a następnie przenieść je do wentylowanych kolb T 25. Kolby należy ustawić pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy tygodnie w celu przygotowania produktów wydzielniczo-egzokrynnych (HES) z nicieni.Kultura zawierająca HES. Pożywka jest pobierana z kultur w odstępach nie rzadziej niż dwa razy w tygodniu, a każdorazowo zastępowana równą objętością pożywki h polyus. Każdą pobraną porcję należy przechowywać oddzielnie i wyraźnie oznaczyć datą oraz numerem partii ze względu na zwiększone ryzyko kontaminacji LPS i białkami gospodarza.Pierwszą pobraną próbkę po 24 godzinach hodowli należy odstawić i przetworzyć oddzielnie lub odrzucić; odwiruj media zawierające HES przy 400 ×g przez pięć minut. Następnie odessij media strzykawką o pojemności 50 ml i przefiltruj przez filtr o rozmiarze porów 0,2 µm o niskim wiązaniu białek do probówek o pojemności 50 ml. Następnie połączony nadosad HES należy zagęścić za pomocą filtra o progu odcięcia 3000 Da w urządzeniu do ultrafiltracji pod ciśnieniem azotu; aby przygotować urządzenie filtrujące, najpierw przemyj membranę 3 kDa błyszczącą stroną w dół w zlewce o pojemności 1 l wodą destylowaną podczas mieszania.Zmontować urządzenie do ultrafiltracji zgodnie z instrukcją producenta, umieszczając membranę filtru błyszczącą stroną do góry, a następnie umieścić je w lodówce w temperaturze 4 °C i przepuścić przez nią 50 ml wody destylowanej przed rozpoczęciem zagęszczania wlanego HES. Należy zachować szczególną ostrożność, aby filtr nie wyschł. Dodawać kolejne probówki z HES do urządzenia filtracyjnego zgodnie z potrzebą, aż objętość zostanie zredukowana do poziomu od 2 do 5 ml, w celu usunięcia aminokwasów oraz innych składników pożywki do hodowli tkankowej.Do przygotowanego HES dodać 50 mililitrów wolnego od pirogenów PBS do urządzenia do filtracji, a następnie zagęścić do objętości około dwóch mililitrów. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Zużywając łącznie 150 mililitrów PBS, przenieść ES do strzykawki i wysterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra 0,2 mikrona.Po zmierzeniu stężenia białka należy oznaczyć alikwot numerem partii oraz datą, a następnie zamrozić w temperaturze -80 °C. W celu utrzymania cyklu życiowego H poly gyus u myszy F1 stosuje się gavage doustny 400 L trzech larw. Wynikowe obciążenie dorosłymi robakami przedstawiono tutaj.Partie HES wykazały powtarzalną skuteczność w testach funkcjonalnych oraz w składzie białkowym. Co więcej, analiza supernatantów z każdego kolejnego tygodnia hodowli wykazała, że profile białkowe pozostawały bardzo podobne przez łącznie do czterech tygodni. W przypadku pomiaru stężenia TS za pomocą metody Bradforda, całkowita zawartość białka wynosi zazwyczaj około jednego miligrama na mililitr.Przedstawiono wydajność białka HES z 11 różnych partii uzyskanych z około 500 mililitrów nadsączu hodowli. Unikanie zanieczyszczeń jest krytyczne podczas pozyskiwania HES, co potwierdzono pomiarem poziomu zanieczyszczenia LPS w 41 partiach HES za pomocą testu limbus AAMI CYTE. Stwierdzono, że większość partii HES znajduje się znacznie poniżej zalecanego progu zanieczyszczenia.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o zachowaniu rygorystycznych zasad aseptyki podczas przygotowywania kultur. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym postępowaniu zgodnie z opisaną procedurą, można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin. W celu pełnego zrozumienia spektrum produktów molekularnych uwalnianych przez te pasożyty można zastosować inne metody, takie jak proteomika, frakcjonowanie białek oraz analiza glikanów, lipidów i microRNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak propagować poly limus. Moid jest polyus i zbiera produkty DS z hodowanych dorosłych robaków w celu przetestowania ich wpływu na układ odpornościowy. Chociaż ten pasożyt nie jest groźny dla ludzi, ważne jest przestrzeganie środków ostrożności i trzymanie się określonego protokołu, aby zapewnić powtarzalność między partiami Hess.

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Uprawa Heligmosomoides Polygyrus: Immunomodulujący pasożyt nicieni i jego wydzielany produkt

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Strongyloides ratti to pasożytniczy nicień, który powoduje przejściowe infekcje u myszy laboratoryjnych, wykazując migrację tkanek i etapy życia jelitowego. W tym miejscu przedstawiamy protokół utrzymania cyklu pasożytniczego u szczurów i eksperymentalnego zakażenia myszy, w tym kwantyfikację pasożytów w głowie, płucach i jelicie.

Eksperymentalne zakażenie myszy pasożytniczym nicieniem Strongyloides ratti

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Poznaj metodę hodowli Heligmosomoides polygyrus i izolacji wydzielanych produktów immunomodulujących w celu badania mechanizmów supresji odpowiedzi immunologicznej u myszy.

Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Przeglądaj więcej filmów