Name: Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zmian w adhezji komórkowej w czasie rzeczywistym przy użyciu impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek. Protokół umożliwia badanie dynamiki adhezji komórek śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) oraz, częściowo, przez UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Ogólna hodowla komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Hodowla komórek śródbłonka aorty bydlęcej (pasaże 4–9) na kolbach do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną (powierzchnia hodowli tkankowej płaszcza z 0,1% w/v żelatyny w PBS w temperaturze pokojowej przez 15 min) w pożywce EGM-2 (z zestawem EGM-2 zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej, czynniki wzrostu i wszystkie suplementy dostarczone przez producenta, z wyjątkiem hydrokortyzonu).</li>
	<li>Gdy komórki są prawie zlewające się (ok. 3 dni po wysiewie po podziale 1:4), zbierz komórki przez traktowanie 0,05% w/v trypsyny / 0,02% w/v EDTA w PBS w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu większości komórek dodaj pełną pożywkę EGM-2 w celu wygaszenia trypsyny, a następnie odwiruj (100 x g, 5 min).</li>
	<li>Przygotuj komórki do badań nad adhezją de novo komórek śródbłonka do fibronektyny (Eksperyment 1: Sekcja 2) i późniejszym odadhezją komórek śródbłonka z ustaloną adhezją do tego podłoża (Eksperyment 2: Sekcja 3).
	<ol>
		<li>Pobrane komórki przepłukać jednokrotnie pożywką 199 bez surowicy zawierającą 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i ponownie odwirować (100 x g, 5 min).</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce 199 bez surowicy zawierającej 1% w/v BSA przy 2,5 x 105 komórek/ml (pomiary impedancji substratu komórkowego) lub 5 x 105 komórek/ml (analizy obrazowania żywych komórek) i utrzymać w temperaturze 37 °C przed użyciem. 
		UWAGA: Reakcje adhezyjne komórek są bardzo wrażliwe na różnice temperatur (np. z powodu efektów konwekcji), dlatego wszystkie urządzenia i roztwory używane do obsługi i leczenia komórek podczas poniższych protokołów powinny być utrzymywane w stałej temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperyment 1: Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka de novo na natywnej i utlenionej MPO fibronektynie (impedancja substratu komórkowego)
UWAGA: Eksperyment 1 bada stopień, w jakim utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO osłabia jej zdolność do wspierania adhezji de novo zawieszonych komórek śródbłonka.
<ol>
	<li>Pokryj fibronektynę na 96-dołkowych układach mikroelektrod o impedancji złotego podłoża komórkowego. Dodać 80 μl/basenik oczyszczonej fibronektyny bydlęcej w stężeniu 5 μg/ml w PBS, inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i usunąć roztwór.</li>
	<li>Inkubować powierzchnie pokryte fibronektyną z MPO, aby umożliwić wiązanie MPO z fibronektyną związaną z powierzchnią. Dodać 80 μl/basenik oczyszczonych ludzkich neutrofili MPO o stężeniu 20 nM w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) i inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj powierzchnie dwukrotnie HBSS, aby usunąć wszelkie niezwiązane MPO.</li>
	<li>DodaćH2O2(stężenie końcowe 0-10 μM) do studzienek płytki układu mikroelektrod zawierających 80 μl/dołek HBSS w celu zainicjowania katalizowanego MPO, zależnego od HOCl utleniania fibronektyny i inkubować przez kolejne 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W celu zbadania wpływu odpowiednich inhibitorów lub modulatorów reakcji katalizowanych MPO (np. alternatywnych substratów enzymów MPO, inhibitorów enzymów lub przeciwutleniaczy; szczegółowe informacje patrz9), należy dodać je do HBSS bezpośrednio przed dodaniemH2O2</li>.
	<li>Po 0,5 godziny potraktuj powierzchnie metioniną, aby ugasić resztki utleniających się związków związanych z powierzchnią; tj. reaktywne chloraminy związane z białkami, które mogą wywierać zakłócającą aktywność komórkową. Dodać 10 mM metioniny do 80 μl HBSS na studzienkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Blokuj powierzchnie za pomocą BSA. Dodać 80 μl/basenik BSA o stężeniu 0,2% w/v w PBS, inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i usunąć roztwór. 
	UWAGA: Szczątkowe niepowlekane obszary powierzchni będą wspierać adhezję komórek, a zablokowanie ich za pomocą nieadhezyjnego białka (tj. BSA) zapewnia, że odpowiedzi adhezyjne komórek ściśle zależą od zastosowanej oczyszczonej matrycy adhezyjnej komórek, w tym przypadku fibronektyny.</li>
	<li>Umyj powierzchnie dwukrotnie za pomocą HBSS. 
	UWAGA: Żadna z powyższych obróbki powierzchni nie wpływa znacząco na odczyty substratu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesiny nasiennej komórek śródbłonka (dodać 200 μl/studzienkę w tempie ok. 2,5 x 105 komórek/ml, przygotowanych w pożywce 199 bez surowicy zawierającej 1% BSA; patrz 1.3) na powierzchnie pokryte natywną lub utlenioną fibronektyną MPO.</li>
	<li>Natychmiast po wysianiu komórek (tj. przed przyłączeniem i rozprowadzeniem komórek) zamontuj płytkę z matrycą mikroelektrod na porcie inkubatora (umieszczonym w inkubatorze o temperaturze 37 °C w obecności 5%CO2).
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania przyrządu, natychmiast wykonaj "pusty" odczyt w celu znormalizowania kolejnych wartości impedancji ogniwo-substrat ("indeks komórki") do początkowych wartości tła uzyskanych przy braku adhezji komórek.</li>
		<li>Rozpocznij akwizycję ciągłych danych indeksu komórek (co najmniej jeden odczyt indeksu komórki/min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny, przy czym jest to okres, w którym osiąga się maksymalne przyłączanie i rozprzestrzenianie komórek; znajduje to odzwierciedlenie w ustabilizowaniu się wartości wskaźnika komórek (patrz rysunek 3A). 
	UWAGA: Poprzedni eksperyment (Eksperyment 1) bada, w jaki sposób początkowe utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO ogranicza zdolność komórek śródbłonka do ustanowienia adhezji komórkowej na tym podłożu. Poniższy eksperyment (Eksperyment 2) bada, w jaki sposób utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO sprzyja zmniejszeniu adhezji macierzy komórkowej (tj. Deadhezji) w komórkach śródbłonka z ustaloną adhezją do tego substratu. Leczenie w tych dwóch eksperymentach jest zasadniczo identyczne, z wyjątkiem czasu utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO (tj. przed adhezją komórek – Eksperyment 1; po adhezji komórek – Eksperyment 2).</li>
</ol>
3. Eksperyment 2: Kwantyfikacja deadhezji komórek śródbłonka od fibronektyny w odpowiedzi na utlenianie fibronektyny za pośrednictwem MPO (impedancja substratu komórkowego i obrazowanie żywych komórek)
<ol>
	<li>Pokryj fibronektynę na 96-dołkowych złotych matrycach mikroelektrod w celu pomiaru impedancji substratu komórkowego (dodać 80 μl/basenik fibronektyny przy 5 μg/ml w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C) lub 35-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych ze szklanym dnem do analiz obrazowych żywych komórek (dodać 2 ml/naczynie fibronektyny w stężeniu 5 μg/ml w PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C).</li>
	<li>Blokuj powierzchnie za pomocą BSA. Dodać BSA w stężeniu 0,2% m/v w PBS o objętościach wskazanych w ppkt 3.1 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inkubować powierzchnie z MPO, aby umożliwić wiązanie MPO z fibronektyną. Dodać 20 nM oczyszczonego ludzkiego MPO do HBSS o objętościach wskazanych w ppkt 3.1 i inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj powierzchnie dwukrotnie HBSS, aby usunąć wszelkie niezwiązane MPO.</li>
	<li>Zawiesiny nasienne komórek śródbłonka (przygotowanych w pożywce 199 bez surowicy, zawierającej 1% w/v BSA; patrz 1.3) na powierzchniach pokrytych fibronektyną natywną lub zawierającą MPO.
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl / studzienkę przy 2,5 x 105 ogniw / ml do 96 dołków mikroelektrod impedancji substratu komórkowego.</li>
		<li>Dodać 2 ml / naczynie w proporcji 5 x 105 komórek/ml do naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednio po wysianiu komórek (tj. przed przyłączeniem się i rozprzestrzenieniem komórek):
	<ol>
		<li>Zamontuj 96-dołkowe płytki układu mikroelektrod na porcie inkubatora impedancji ogniwo-substrat (umieszczonym w inkubatorze o temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 ) i wykonaj "ślepe" odczyty, aby rozpocząć ciągłe pobieranie danych o indeksie komórek (patrz sekcja 2.10).</li>
		<li>Przenieść szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem do inkubatora o temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić maksymalne przyłączenie i rozprzestrzenienie komórek (porównaj sekcja 2.11).</li>
	<li>Na krótko wyjąć 96-dołkową płytkę z matrycą mikroelektrod (w tym momencie wstrzymać odczyty indeksu komórek) lub 35-milimetrową szalkę do hodowli komórek ze szklanym dnem z inkubatora w temperaturze 37 °C, usunąć supernatant komórek i dodać ogrzany (37 °C) HBSS (objętości jak w kroku 3.1). 
	UWAGA: HBSS jest stosowany podczas badania reakcji utleniania katalizowanych przez MPO zamiast kompletnych pożywek hodowlanych, ponieważ te ostatnie zawierają utleniające się gatunki, które zakłócają reakcje utleniania.</li>
	<li>Aby zbadać wpływ inhibitorów/modulatorów reakcji katalizowanych przez MPO (alternatywne substraty enzymatyczne, inhibitory enzymów lub przeciwutleniacze) lub inhibitorów sygnalizacji komórkowej (np. 40 μM blebbistatyna w celu zahamowania kurczliwości aktomiozyny), dodaj je teraz.</li>
	<li>Natychmiast umieścić płytkę z matrycą mikroelektrod z powrotem w porcie inkubatora o temperaturze 37 °C (w tym momencie ponownie rozpocząć odczyty indeksu komórek) lub naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom zrównoważyć się w HBSS przez 0,5 godz. 
	UWAGA: Po 0,5 godziny równowagi w HBSS wartości indeksu komórek stabilizują się na nieco niższych wartościach; Podczas wstępnej inkubacji komórek z substratami enzymatycznymi, inhibitorami enzymów i sygnalizacji komórkowej lub przeciwutleniaczami należy najpierw upewnić się, że nie wpływają one znacząco na wartości uzyskane po zrównoważeniu.</li>
	<li>Zainicjuj katalizowane MPO, zależne od HOCl utlenianie fibronektyny i deadhezję.
	<ol>
		<li>Do badań impedancji ogniw przy użyciu 96-dołkowych płytek z matrycą mikroelektrod:
		<ol>
			<li>Wyjąć płytkę z matrycą mikroelektrod z inkubatora i wstrzymać pomiary wskaźnika komórki.</li>
			<li>DodaćH2O2(końcowe stężenie 0-10 μM) do HBSS i delikatnie wymieszać, wielokrotnie pipetując.</li>
			<li>Natychmiast ponownie zamontuj matrycę mikroelektrod z powrotem w porcie inkubatora o temperaturze 37 °C i ponownie rozpocznij rejestrację odczytów indeksu komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do badań obrazowania żywych komórek przy użyciu 35-milimetrowej płytki do hodowli komórkowych ze szklanym dnem:
		<ol>
			<li>Wyjąć naczynie hodowlane z inkubatora i zamontować na podgrzewanym w temperaturze 37 °C stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w soczewkę obiektywu wodnego o powiększeniu 63x z odpowiednią optyką DIC do nagrywania filmów z komórek na żywo.</li>
			<li>Skoncentruj się na komórkach i zoptymalizuj optykę DIC (oświetlenie Köhlera, opóźnienie polaryzacji i przesunięcie/wzmocnienie kamery; szczegółowe informacje znajdują się w13).</li>
			<li>Rozpocznij film DIC i rejestruj odczyty wyjściowe nieleczonych komórek przez 1 minutę.</li>
			<li>DodaćH2O2(końcowe stężenie 0-10 μM) i delikatnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Ponownie ustaw ostrość mikroskopu (jeśli to konieczne) i kontynuuj nagrywanie filmów DIC leczonych komórek przez wymagany okres czasu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza i prezentacja danych
<ol>
	<li>Dane dotyczące impedancji podłoża ogniwa
	<ol>
		<li>Eksportuj nieprzetworzone dane (indeks komórki w funkcji czasu) do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>W przypadku badań deadhezji komórek (Eksperyment 2: Sekcja 3) należy znormalizować dane, ustawiając wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO na wartość 1 (tj. bezpośrednio przed dodaniemH2O2 w 3.11.1.1). 
		UWAGA: Gwarantuje to, że względne zmiany w wartościach indeksu komórkowego wywołane utlenianiem fibronektyny za pośrednictwem MPO nie są maskowane przez małe początkowe różnice w bezwzględnych wartościach indeksu komórkowego między studzienkami.
		<ol>
			<li>Przedstaw dane jako wykresy znormalizowanego indeksu komórki (oś y) w funkcji czasu (oś x).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dane z obrazowania żywych komórek (badania deadhezji komórek w eksperymencie 2: sekcja 3)
	<ol>
		<li>Otwarte filmy obrazowania żywych komórek DIC nagrane bezpośrednio przed i po rozpoczęciu utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO w standardowym programie do analizy obrazu (np. oprogramowaniu ImageJ).</li>
		<li>W co najmniej dwóch oddzielnych filmach DIC losowo wybierz wiele komórek i zmierz ich wyświetlany obszar w sekwencyjnych klatkach (np. w odstępach 1-minutowych), ręcznie śledząc ich krawędź membrany i określając ilościowo liczbę zawartych pikseli.</li>
		<li>Eksportuj surowe dane (przewidywany obszar komórki w funkcji czasu) do arkusza kalkulacyjnego Excel i znormalizuj dane dotyczące obszaru komórki, ustawiając wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO na wartość 1 (tj. bezpośrednio przed dodaniemH2O2 w 3.11.2.3).</li>
		<li>Przedstaw dane jako wykres znormalizowanego obszaru komórki (oś y) w funkcji czasu (oś x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li>
<li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li>
<li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li>
<li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+%28RT-CES%29+technology+to+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li>
<li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li>
<li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li>
<li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Procesy adhezji i deadhezji matryc komórkowych mogą być dokładnie określane ilościowo w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu impedancji komórka-substrat i analiz obrazowania żywych komórek. Te podejścia w czasie rzeczywistym zapewniają dużą przewagę nad analizami adhezji komórek w punktach końcowych, które zapewniają słabą rozdzielczość czasową. Dzięki dokładnemu ilościowemu określeniu szybkich reakcji na deadhezję z wysoką rozdzielczością czasową, analizy te mogą dostarczyć krytycznych inform...

Stabilne kontakty adhezyjne między komórkami i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową są niezbędne do utrzymania homeostazy tkanek. Na przykład adhezja komórek śródbłonka do macierzy podśródbłonkowej w naczyniach krwionośnych odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności warstwy śródbłonka i jej homeostatycznej funkcji jako regulacyjnej, półprzepuszczalnej bariery naczyniowej1. Cytoszkielet aktynowy jest mechanicznie sprzężony z cząsteczkami macierzy adhezyjnej w miejscach adhezji macierzy komórkowej, a kontakty adhezyjne na granicy faz komórka-matryca odgrywają ważną rolę w określaniu położenia błony komórkowej, opierając się centralnie skierowanym siłom rozciągającym aktomiozynę. Bodźce zewnątrzkomórkowe, które zmieniają adhezję komórka-macierz, z konieczności zmieniają równowagę sił na granicy komórka-macierz, zdarzenie, które jest szybko "wyczuwane" przez mechanowrażliwe białka sygnałowe, co skutkuje transdukcją "sygnalizacji zewnętrznej do wewnątrz". Ten wzajemny oddziaływanie między komórkami i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu kształtu, ruchliwości, funkcji, proliferacji i przeżycia komórek2.
Różnorodne procesy patofizjologiczne (rozwój embrionalny, zapalenie, gojenie ran i przerzuty raka) charakteryzują się dynamiczną przebudową substratów matrycy adhezyjnej przez utleniacze rozkładające matrycę i/lub enzymy3,4. Na przykład adhezyjne białka macierzy podśródbłonkowej w naczyniach krwionośnych (np. fibronektyna) są uważane za główne cele modyfikacji lub degradacji w chorobach zapalnych u ludzi ze względu na miejscową produkcję reaktywnych utleniaczy (np. kwasu podchlorawego, HOCl) przez enzym mieloperoksydazę pochodzącą z leukocytów (MPO), który gromadzi się w śródbłonku podczas zapalnej choroby naczyniowej (ryc. 1)5-9. Zmiany w adhezji macierzy komórkowej wywołane przez utleniacze pochodzące z MPO i inne bodźce modyfikujące matrycę mogą odgrywać ważną rolę w zmianie homeostazy naczyń krwionośnych podczas różnych procesów patologicznych; Na przykład poprzez zmianę sygnalizacji, morfologii i żywotności komórek śródbłonka, co z kolei zaburza funkcję śródbłonka i integralność bariery. Jednak morfologiczne i sygnalizacyjne odpowiedzi komórek przylegających do modyfikacji macierzy zewnątrzkomórkowej dopiero zaczynają być rozumiane.
Aby zrozumieć, w jaki sposób modyfikacje matrycy napędzają zmiany w dynamice adhezji komórek i zależnych od adhezji szlakach sygnalizacji komórkowej, potrzebne są techniki, które dokładnie określają ilościowo zmiany w adhezji matrycy komórkowej w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasową. W tym miejscu opisujemy komplementarne techniki impedancji impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek, które spełniają te kryteria i stanowią platformę do ilościowego określania procesów adhezji i deadhezji komórek w sposób nieinwazyjny.
Pokazujemy, jak te podejścia do impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek mogą być łatwo wykorzystane do (i) monitorowania dynamiki przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek (tj. adhezji komórek de novo) na natywnych i zmodyfikowanych substratach matrycy oraz (ii) do pomiaru dynamiki odklejania się matrycy komórkowej (tj. deadhezji) przez przylegające komórki wystawione na bodźce modyfikujące matrycę. System biosensorów impedancji komórka-substrat xCELLigence zapewnia ciągły pomiar obszaru styku komórka-matryca poprzez ilościowe określenie impedancji elektrycznej na powierzchni 96-dołkowych złotych układów mikroelektrod i wyraża te pomiary impedancji elektrycznej jako "indeks komórki", bezwymiarową wartość, która jest w dużej mierze proporcjonalna do obszaru styku komórka-podłoże10 (Rysunek 2), przy jednoczesnej wrażliwości na zmiany średniej odległości między (izolującą) błoną komórkową a powierzchnią elektrody11. Dalszy wzrost wartości indeksu komórkowego osiąga się również po utworzeniu ścisłych kontaktów komórka-komórka, które ograniczają przepływy prądów parakomórkowych, warunki, które nie występują w eksperymentach opisanych w tym badaniu. Pomiar rzutowanego obszaru poszczególnych komórek w czasie za pomocą analizy obrazu filmów z poklatkowym kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) zapewnia uzupełniający pomiar zmian w obszarze kontaktu komórka-substrat i dostarcza dodatkowych informacji dotyczących dokładnej natury i dynamiki zmian morfologicznych określanych ilościowo za pomocą podejścia impedancji komórka-substrat.
Konkretnie, opisujemy zastosowanie tych podejść do monitorowania, jak utlenianie za pośrednictwem MPO adhezyjnych białek macierzy podśródbłonkowej (np. fibronektyny) (i) zmniejsza de novo adhezję zawieszonych komórek śródbłonka do oczyszczonej fibronektyny i (ii) powoduje deadhezję macierzy komórkowej w komórkach śródbłonka z ustaloną adhezją na fibronektynie. Wykonując równoległe analizy sygnalizacji komórkowej w czasie przy użyciu odpowiednich testów biochemicznych (np. Western blotting), można określić czasowe i przyczynowe relacje między procesami adhezji/deadhezji a powiązanymi zmianami w zdarzeniach sygnalizacji komórkowej zależnych od adhezji.
Te podejścia zostały ostatnio użyte do wykazania, że utlenianie macierzy zewnątrzkomórkowej katalizowane przez podśródbłonkowe złogi MPO powoduje szybką utratę adhezji komórek śródbłonka do macierzy komórkowej, która jest napędzana przez istniejące wcześniej siły skurczu aktomiozyny9. Co ważne, umożliwiając określenie czasowego związku między zmianami zarówno w adhezji komórek, jak i zależnej od adhezji sygnalizacji komórkowej, podejścia te pozwoliły zidentyfikować, że indukowana przez MPO modyfikacja macierzy i deadhezja komórkowa wywołują zmiany w ważnych szlakach sygnalizacji komórkowej zależnych od adhezji, w tym fosforylację paxyliny zależną od kinazy Src i fosforylację łańcucha lekkiego II miozyny (Figura 1)9. Ten tryb sygnalizacji zależnej od redoks, obejmujący aktywację wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych przez zewnątrzkomórkowe reakcje oksydacyjne, które zakłócają adhezję macierzy komórkowej, reprezentuje nowy tryb sygnalizacji komórkowej określany jako "sygnalizacja redoks na zewnątrz do wewnątrz" (ryc. 1) 9.
Ogólnie rzecz biorąc, te komplementarne podejścia do biosensorycznego czujnika impedancji i obrazowania żywych komórek powinny być cenne w odkrywaniu, jak różne bodźce lub czynniki modyfikujące matrycę napędzają zmiany w dynamice adhezji komórek, morfologii i sygnalizacji w różnych przylegających typach komórek podlegających szerokiej gamie ustawień eksperymentalnych.
Poniższy protokół opisuje, jak określić ilościowo wpływ utleniania matrycy za pośrednictwem MPO na procesy adhezji komórek śródbłonka de novo (Eksperyment 1) i deadhezji komórek śródbłonka (Eksperyment 2). MPO wiąże się zachłannie z fibronektyną i innymi adhezyjnymi subśródbłonkowymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i wykorzystuje nadtlenek wodoru (H2O2) do przekształcania jonów chlorkowych (Cl–) w wysoce reaktywny chlorujący utleniacz kwas podchlorawy (HOCl), który reaguje lokalnie z tymi białkami macierzy i zakłóca ich właściwości adhezyjne komórek (Figura 1)8,9,12.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa matryca mikroelektrod impedancji gold-substrate</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>jednorazowa płytka służąca do wykonywania testów komórkowych w systemie xCELLigence</td></tr><tr><td>blebbistatyna</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>selektywny inhibitor komórek śródbłonka bydlęcej aorty bez miozyny mięśniowej-II</td></tr><tr><td>, kriokonserwowany&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td> zestaw <td>pożywek do wzrostu komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>Fibronektyna, liofilizowany proszek</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>z osocza bydlęcego</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Naczynie do hodowli komórek z dnem ze szkła o jakości optycznej do obrazowania</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry bydlęcej</td><td>Podłoże do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>G9391</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Technologie życia</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>pożywka komórkowa bez surowicy</td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>gasi utleniacze chlorujące wytwarzane przez mieloperoksydazę mieloperoksydazę</td></tr><tr><td>, ludzkie wielojądrzaste leukocyty</td><td>Milipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence system impedancji substratu komórkowego</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>Składa się z analizatora RTCA, stacji MP RTCA (Multiple Plate) i jednostki sterującej RTCA</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>Numer katalogowy: 15400-054&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Adhezja macierzy komórkowej odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu morfologii komórki i sygnalizacji. Bodźce, które zaburzają adhezję macierzy komórkowej (np. mieloperoksydaza i inne utleniacze/enzymy modyfikujące macierz uwalniane podczas stanu zapalnego) są zaangażowane w wywoływanie patologicznych zmian w funkcjonowaniu komórki, fenotypie i żywotności w wielu chorobach. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób impedancja komórka-substrat i podejścia do obrazowania żywych komórek mogą być łatwo wykorzystane do dokładnego ilościowego określenia zmian w czasie rzeczywistym w adhezji i deadhezji komórek wywołanych modyfikacją macierzy (przy użyciu komórek śródbłonka i mieloperoksydazy jako patofizjologicznego bodźca modyfikującego matrycę) z wysoką rozdzielczością czasową i w sposób nieinwazyjny. System impedancji komórka-substrat xCELLigence w sposób ciągły określa ilościowo obszar adhezji komórka-matryca, mierząc impedancję elektryczną na granicy faz komórka-podłoże w komórkach hodowanych na złotych matrycach mikroelektrod. Analiza obrazu poklatkowych różnicowych filmów interferencyjnych z kontrastem ilościowym określa ilościowo zmiany w rzutowanym obszarze poszczególnych komórek w czasie, reprezentując zmiany w obszarze kontaktu komórka-matryca. Obie techniki dokładnie określają ilościowo szybkie zmiany w procesach adhezji i deadhezji komórkowej. Impedancja podłoża komórkowego na matrycach bioczujników mikroelektrodowych stanowi platformę do solidnych, wysokowydajnych pomiarów. Analizy obrazowania żywych komórek dostarczają dodatkowych szczegółów dotyczących charakteru i dynamiki zmian morfologicznych określanych ilościowo za pomocą pomiarów impedancji komórka-substrat. Te uzupełniające się podejścia dostarczają cennych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób katalizowana przez mieloperoksydazę oksydacyjna modyfikacja subkomórkowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej wyzwala szybkie zmiany w adhezji komórek, morfologii i sygnalizacji w komórkach śródbłonka. Podejścia te mają również zastosowanie do badania dynamiki adhezji komórkowej w odpowiedzi na inne bodźce modyfikujące macierz oraz w powiązanych komórkach przylegających (np. komórkach nabłonkowych).

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym odklejania się komórek śródbłonka od fibronektyny w odpowiedzi na utlenianie fibronektyny indukowane przez MPO (Eksperyment 2). Wysiew zawiesin komórek śródbłonka na natywną (wolną od MPO) fibronektynę lub fibronektynę z MPO prowadzi do maksymalnego przylegania i rozprzestrzeniania się komórek w ciągu 2 hr, co stwierdzono na podstawie osiągnięcia plateau wartości indeksu komórkowego w pomiarach impedancji między komórką a podłożem (Rycina 3A). Ta począ...

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowe określenie szybkich zmian w adhezji komórek do macierzy w komórkach śródbłonka poddanych działaniu czynników modyfikujących macierz w czasie rzeczywistym, z wykorzystaniem impedancji podłoża komórkowego oraz obrazowania żywych komórek. W tym doświadczeniu jako patofizjologicznie istotny czynnik modyfikujący macierz zastosowano enzym hemowy – mieloperoksydazę. W tym celu powierzchnie najpierw pokryto fibronektyną, aby zapewnić adhezyjne podłoże macierzy.Następnie pozwala się peroksydazie mielopperoksydazie (MPO) związać się z fibronektyną. W dalszej kolejności zawiesinę komórek śródbłonka nanosi się na powierzchnie i inkubuje, aby uzyskać maksymalną adhezję i rozprzestrzenianie się komórek na fibronektynie. Następnie komórki poddaje się działaniu nadtlenku wodoru w celu zainicjowania utleniania fibronektyny zapśredniczonego przez MPO.Następujące szybkie zmiany w adhezji komórek do macierzy są następnie kwantyfikowane w czasie rzeczywistym przy użyciu pomiaru impedancji między komórkami a podłożem oraz analizy obrazowania żywych komórek. Wyniki pokazują, że gwałtowne utraty adhezji komórek śródbłonka do macierzy, wywołane utlenianiem fibronektyny za pośrednictwem NPO, mogą być kwantyfikowane w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową i bez użycia znaczników za pomocą impedancji komórka-podłoże oraz obrazowania żywych komórek. Zaletą tych technik jest możliwość ciągłego kwantyfikowania zmian w adhezji komórek do macierzy z wysoką rozdzielczością czasową, co oznacza, że mogą one dostarczyć istotnych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób modyfikacje macierzy napędzają późniejsze zmiany w morfologii komórek i procesach sygnalizacji zależnej od adhezji.Przedstawione protokoły mają szersze znaczenie, ponieważ można je łatwo dostosować, zastępując MPO innymi czynnikami modyfikującymi macierz, takimi jak matryce bramujące czy proteazy, lub stosując inne rodzaje komórek przylegających niż komórki śródbłonka, na przykład komórki nabłonkowe. W pierwszej kolejności należy dodać 80 µL na dołek fibronektyny w celu pokrycia złotych matryc mikroelektrod 96-dołkowych do pomiarów impedancji podłoża komórkowego lub dodać 2 mL fibronektyny do szalek hodowlanych z dna szklanego do analizy obrazowania żywych komórek. Inkubować matryce i/lub szalki hodowlane w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.Następnie, aby zablokować powierzchnie, należy dodać 0,2% BSA i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne dwie godziny. Następnie należy dodać oczyszczoną ludzką peroksydazę mieloperoksydazową w HBSS i inkubować przez 30 minut. Następnie powierzchnie należy dwukrotnie przemyć HBSS, aby usunąć niezwiązaną MPO.Następnie nanieś zawiesinę komórek endotelialnych o stężeniu 250 000 komórek na mililitr, przygotowaną zgodnie z protokołem tekstowym, na 96-dołkowe macierze mikroelektrod do pomiaru impedancji podłoża komórkowego z powierzchniami pokrytymi natywną fibronektyną lub fibronektyną z MPO. W przypadku 35-milimetrowych naczyń hodowlanych z szklanym dnem dodaj dwa mililitry zawiesiny o stężeniu 500 000 komórek na mililitr. Bezpośrednio po wysianiu komórek zamontuj płytki z macierzami mikroelektrod w porcie inkubatora do pomiaru impedancji podłoża komórkowego w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide.Następnie należy wykonać pomiar tła, aby rozpocząć ciągłą akwizycję danych indeksu komórkowego. Przenieść szalki hodowlane z dna szklanego o średnicy 35 mm do inkubatora w temperaturze 35 °C i przy 5% carbon dioxide. Inkubować przez dwie godziny, aby zapewnić maksymalną adhezję i rozprzestrzenianie się komórek.Po inkubacji wstrzymaj odczyty indeksu komórkowego i krótko wyjmij płytkę z macierzą mikroelektrod lub naczynie z szklanym dnem z inkubatora, odessij supernatant i dodaj podgrzany HBSS, aby zbadać działanie inhibitorów, modulatorów MPO, reakcji katalitycznych lub inhibitorów sygnalizacji komórkowej. Dodaj je do kultur. W tym momencie natychmiast umieść płytkę z macierzą z powrotem w porcie inkubatora lub naczynie z szklanym dnem w inkubatorze i pozwól komórkom wyrównać stan na 30 minut.Aby rozpocząć zależne od kwasu podchlorawego utlenianie fibronektyny i odklejanie komórek katalizowane przez NPO na potrzeby badań impedancji komórkowej, wyjmij płytkę z macierzą mikroelektrod z inkubatora i wstrzymaj pomiary indeksu komórkowego. Dodaj nadtlenek wodoru do HBSS i delikatnie wymieszaj poprzez wielokrotne pipetowanie, a następnie niezwłocznie umieść macierz mikroelektrod z powrotem w porcie inkubatora i wznowij odczyty indeksu komórkowego dla badań obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem szalek z dna szklanego o średnicy 35 milimetrów. Po wyjęciu szalki z inkubatora zamocuj ją na podgrzewanym do 37 °C stole odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw wodny 63 x.Oraz optyka DIC. W celu rejestracji filmów z żywych komórek, ustaw ostrość na komórkach i zoptymalizuj optykę DIC zgodnie z wytycznymi wskazanymi tutaj. Rozpocznij nagrywanie filmu DIC i rejestruj pomiary bazowe dla komórek niepoddanych działaniu czynnika przez jedną minutę, następnie dodaj nadtlenek wodoru i delikatnie wymieszaj poprzez wielokrotne pipetowanie, ponownie ustaw ostrość mikroskopu i kontynuuj nagrywanie filmów DIC z komórek traktowanych przez wymagany czas. Aby przeanalizować dane dotyczące impedancji podłoża komórkowego, zacznij od wyeksportowania danych do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy adhezji komórek.W badaniach normalizuje się dane, przyjmując wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny przez MPO za wartość równą jeden; dane prezentuje się w formie wykresów znormalizowanego indeksu komórkowego w funkcji czasu w celu analizy danych z obrazowania żywych komórek. Filmy z obrazowania żywych komórek w technice DIC, zarejestrowane bezpośrednio przed i po rozpoczęciu utleniania fibronektyny przez MPO, otwiera się w programie do analizy obrazu, takim jak Image J; w co najmniej dwóch oddzielnych filmach DIC losowo wybiera się wiele komórek i mierzy ich powierzchnię rzutowaną w kolejnych klatkach poprzez ręczne obrysowanie krawędzi błony i ilościowe określenie liczby zamkniętych pikseli. Na koniec dane przedstawia się jako wykres znormalizowanej powierzchni komórek w funkcji czasu; osadzanie zawiesin komórek śródbłonka na fibronektynie lub fibronektynie z MPO prowadzi do maksymalnego przyczepienia i rozprzestrzeniania się komórek w ciągu dwóch godzin, co ocenia się na podstawie plateau wartości indeksu komórkowego w podłożu komórkowym.Pomiary impedancji, po ustanowieniu maksymalnej adhezji komórek do fibrynektyny natywnej lub związanej z NPO, wskazują, że ukierunkowane utlenianie fibrynektyny pośredniczone przez kwas podchlorawy katalizowany przez NPO i inicjowane przez dodanie nadtlenku wodoru jako kosubstratu NPO powoduje gwałtowny spadek powierzchni kontaktu matrycy z komórkami. Jest to mierzone za pomocą impedancji komórka-podłoże oraz obrazowania żywych komórek, co pokazano tutaj; gwałtowna desorpcja komórkowa widoczna w komórkach śródbłonka związanych z fibrynektyną z NPO w odpowiedzi na traktowanie nadtlenkiem wodoru nie występuje w komórkach traktowanych samym nadtlenkiem wodoru. Hamowanie funkcji motorycznej miozyny 2 za pomocą BLESS-tatyny hamuje tempo desorpcji komórek śródbłonka mierzone impedancją komórka-podłoże oraz obrazowaniem żywych komórek, co pozwala zidentyfikować, że desorpcja i skurcz komórkowy w odpowiedzi na katalizowane przez MPO podkomórkowe utlenianie matrycy są napędzane przez siły napięciowe akto-miozyny. Ponieważ metody te mogą precyzyjnie mierzyć bardzo szybkie zmiany w adhezji komórkowej, mogą one dostarczyć kluczowych informacji o związkach przyczynowych między zmianami adhezji a późniejszymi zmianami w procesach sygnałowych zależnych od adhezji, takich jak fosforylacja SARK lub sygnały adhezji ogniskowej, które można łatwo mierzyć w równoległych eksperymentach w czasie, wykorzystując western blotting.

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zastosowanie impedancji komórkowo-podłożowej i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezyjności komórkowej i odczepianiu indukowanym przez modyfikację matrycy

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Poznaj metodę pomiaru zmian w adhezji komórkowej w czasie rzeczywistym przy użyciu impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek. Protokół umożliwia badanie dynamiki adhezji komórek śródbłonka.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Przeglądaj więcej filmów