Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie szybkich zmian w adhezji macierzy komórkowej w komórkach śródbłonka wystawionych na działanie środków modyfikujących matrycę w czasie rzeczywistym przy użyciu impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek. W tym eksperymencie enzym hemowy peroksydaza mielologiczna jest stosowany jako patofizjologicznie istotny środek modyfikujący matrycę. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie powierzchni fibronektyną w celu uzyskania adhezyjnego podłoża matrycy.

Następnie pozwala się na wiązanie się peroksydazy mio lub MPO z fibronektyną. Następnie zawieszone komórki śródbłonka są osadzane na powierzchni i inkubowane w celu osiągnięcia maksymalnego przyczepienia komórek i rozprowadzenia na fibronektynie. Następnie komórki są wystawiane na działanie nadtlenku wodoru w celu zainicjowania utleniania fibronektyny za pośrednictwem NPO.

Następujące po sobie gwałtowne zmiany w adhezji macierzy komórkowej są następnie określane ilościowo w czasie rzeczywistym za pomocą impedancji substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Wyniki pokazują, że szybkie straty w adhezji macierzy komórek śródbłonka wywołane utlenianiem fibronektyny za pośrednictwem NPO można określić ilościowo w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową i w sposób bezznacznikowy za pomocą impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek. Cóż, zaletą tych technik jest to, że mogą one określać ilościowo zmiany w adhezji macierzy komórkowej w sposób ciągły z wysoką rozdzielczością czasową, a to oznacza, że mogą dostarczyć ważnych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób modyfikacje matrycy napędzają dalsze zmiany w morfologii komórek i procesach sygnalizacji zależnych od adhezji.

Protokoły mają szersze znaczenie, ponieważ można je łatwo dostosować, zastępując MPO innymi środkami modyfikującymi macierz, takimi jak matryca do bramkowania, proteazy lub stosując przylegające typy komórek inne niż komórki śródbłonka, takie jak komórki nabłonkowe. Na początek dodaj 80 mikrolitrów fibronektyny na studzienkę, aby pokryć 96-dołkowe złote układy mikroelektrod do pomiarów impedancji substratu komórkowego lub dodaj dwa mililitry fibronektyny do naczyń do hodowli komórek ze szklanym dnem w celu analizy obrazowania żywych komórek. Inkubować tablice i/lub szalki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie, aby zablokować powierzchnie, dodaj 0,2% BSA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe dwie godziny. Następnie dodaj oczyszczoną ludzką peroksydazę do HBSS i inkubuj przez 30 minut. Następnie użyj HBSS, aby dwukrotnie umyć powierzchnie, aby usunąć wszelkie niezwiązane MPO.

Następnie zobacz 250 000 komórek na mililitr zawieszonych komórek śródbłonka przygotowanych zgodnie z protokołem tekstowym Na 96 ogniwach studziennych układy mikroelektrod o impedancji podłoża z powierzchniami pokrytymi natywną lub MPO z fibronektyną. W przypadku naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 35 milimetrów ze szklanym dnem dodaj dwa mililitry po 500 000 komórek na mililitr. Natychmiast po wysianiu komórek zamontuj płytki układu mikroelektrod na porcie inkubatora impedancji podłoża komórkowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

I wykonaj puste odczyty, aby zainicjować ciągłe pozyskiwanie danych indeksu komórek. Przenieś 35-milimetrowe szklane płytki do hodowli komórek dolnych do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 35 stopni Celsjusza. Inkubować przez dwie godziny, aby umożliwić maksymalne przyczepienie i rozprzestrzenianie się komórek.

Po inkubacji wstrzymaj odczyty indeksu komórek i na krótko wyjmij płytkę z matrycą mikroelektrod lub wyjmij szklane naczynie z dnem z inkubatora, odessaj snat i dodaj podgrzany HBSS w celu zbadania działania inhibitorów, modulatorów MPO, reakcji katalizowanych lub inhibitorów sygnalizacji komórkowej. Dodaj je do kultur. W tym momencie natychmiast umieść płytkę matrycy z powrotem w porcie inkubatora lub naczynie ze szklanym dnem w inkubatorze i pozwól komórkom zrównoważyć się przez 30 minut.

Aby zainicjować katalizowane przez NPO utlenianie i adhezję fibronektyny zależnej od kwasu podchlorawego w badaniach impedancji komórek, wyjmij płytkę z matrycą mikroelektrod z inkubatora i wstrzymaj pomiary indeksu komórek. Dodać nadtlenek wodoru do HBSS i delikatnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie, natychmiast ponownie zamontować na matrycy mikroelektrod z powrotem do portu inkubatora i wznowić odczyty indeksu komórek do badań obrazowania żywych komórek przy użyciu 35-milimetrowych naczyń ze szklanym dnem. Po wyjęciu szalki z inkubatora, zamontowanej na podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w soczewkę obiektywu wodnego o kącie powiększenia 63 stopni.

I optyka DIC Aby nagrywać filmy na żywo z komórek, skup się na komórkach i zoptymalizuj optykę DIC zgodnie z wytycznymi, o których tutaj mowa. Rozpocznij film DIC i rejestruj odczyty linii bazowej komórek niepoddanych działaniu substancji przez jedną minutę, następnie dodaj nadtlenek wodoru i delikatnie wymieszaj przez wielokrotne pipetowanie, ponownie ustaw ostrość mikroskopu i kontynuuj nagrywanie filmów DIC leczonych komórek przez wymagany okres czasu. Aby przeanalizować dane dotyczące impedancji substratu komórkowego, zacznij od wyeksportowania danych do arkusza kalkulacyjnego pod kątem adhezji d komórek.

Badania normalizują dane, ustawiając wartości zarejestrowane bezpośrednio przed rozpoczęciem utleniania fibronektyny za pośrednictwem NPO do jednych obecnych danych jako wykresów znormalizowanego indeksu komórkowego w funkcji czasu w celu analizy danych obrazowania żywych komórek. Otwarte filmy obrazowania żywych komórek DIC nagrane bezpośrednio przed i po zainicjowaniu utleniania fibronektyny za pośrednictwem MPO w programie do analizy obrazu, takim jak Image J, w co najmniej dwóch oddzielnych filmach DIC, losowo wybierz wiele komórek i zmierz ich rzutowany obszar w sekwencyjnych klatkach, ręcznie śledząc ich krawędź błony i określając ilościowo liczbę zamkniętych pikseli. Na koniec przedstaw dane jako wykres znormalizowanej powierzchni komórki w funkcji czasu, umieszczenie zawiesin komórek śródbłonka na fibronektynie lub MPO zawierającej fibronektynę powoduje maksymalne przyczepienie się komórek i rozprzestrzenianie się w ciągu dwóch godzin, co ocenia się na podstawie plateau wartości indeksu komórkowego w podłożu komórkowym.

Pomiary impedancji, po ustaleniu maksymalnej adhezji komórek na fibronektynie natywnej lub NPO, ukierunkowane utlenianie fibronektyny za pośrednictwem katalizowanego przez NPO katalizowanego kwasem podchlorawym i zainicjowane przez dodanie NPO, ponieważ substrat nadtlenek wodoru powoduje szybki spadek powierzchni kontaktu z macierzą komórkową mierzoną impedancją substratu komórkowego i obrazowaniem żywych komórek, jak pokazano tutaj, szybka adhezja komórkowa widoczna w komórkach śródbłonka związanych z NPO zawierającym fibronektynę w odpowiedzi na leczenie nadtlenkiem wodoru jest nieobecna w komórkach traktowanych samym nadtlenkiem wodoru. Hamowanie funkcji motorycznej miozyny dwóch za pomocą statyn BLE hamuje szybkość adhezji komórek śródbłonka mierzoną impedancją substratu komórkowego oraz obrazowaniem żywych komórek identyfikując, że adhezja i skurcz komórkowy w odpowiedzi na katalizowanie MPO utlenianie macierzy subkomórkowej jest napędzane przez siły rozciągające miozyny ACTO. Ponieważ metody te mogą dokładnie mierzyć bardzo szybkie zmiany w adhezji komórek, mogą dostarczyć krytycznego wglądu w związki przyczynowe między zmianami adhezji a dalszymi zmianami w procesach sygnalizacji zależnych od adhezji, takich jak fosforylacja SARK lub sygnalizacja adhezji ogniskowej, które można łatwo zmierzyć w równoległych eksperymentach w czasie przy użyciu Western blotting.