Name: Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę oznaczania takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS. Ta technika umożliwia mało inwazyjny pobiór próbek i monitorowanie stężenia leku u pacjentów po przeszczepach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Federalną Agencję Leków Stanów Zjednoczonych (FDA) HHSF223201310224C oraz grant 1U01FD004573-01 Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych/FDA.

Niezidentyfikowane próbki krwi od zdrowych osób pochodziły ze Szpitala Uniwersytetu Kolorado (Aurora, Kolorado). Wykorzystanie zanonimizowanych próbek z banku krwi do badań walidacyjnych, jak również do przygotowania kalibratorów i próbek kontroli jakości zostało uznane za "wyłączone" przez Wieloinstytucjonalną Komisję Rewizyjną Kolorado (COMIRB, Aurora, Kolorado).
1. Przygotowanie referencji i rozwiązań
<ol>
	<li>Takrolimus i wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus należy zakupić u dostawców wymienionych w wykazie materiałów.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe w czystym metanolu o stężeniu 1 mg/ml dla takrolimusu i stężeniu 10 μg/ml dla D2,13 C-takrolimusu. Sporządzić roztwory podstawowe materiałów odniesienia w oparciu o trzy niezależne wagi. Podwielokrotne roztwory podstawowe i przechowywać w temperaturze -70 °C lub niższej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór do wytrącania białek i ekstrakcji takrolimusu przy użyciu metanolu / 0,2 MZnSO4 w wodzie (7:3, v:v). Roztwór ten zawiera również wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus o stężeniu 2,5 ng/ml i jest stosowany do ekstrakcji wszystkich próbek, z wyjątkiem ekstrakcji próbek zerowych (patrz ppkt 1.3.3).
	<ol>
		<li>Roztwór do wytrącania białek należy przygotowywać świeżo w każdym dniu ekstrakcji i ustawić termin ważności roztworu na 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie krzywej kalibracyjnej i próbek do kontroli jakości (QC)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe takrolimusu, przeprowadzając odpowiednie rozcieńczenia roztworu podstawowego przy użyciu czystego metanolu.</li>
		<li>W celu przygotowania wzorców i próbek do kontroli jakości, należy dodać 20 μl odpowiednio rozcieńczonego roztworu podstawowego do krwi pełnej EDTA, inkubować w temperaturze 37 °C pod delikatnym wstrząsem w łaźni wodnej, aby umożliwić jednorodne rozprowadzenie takrolimusu w składnikach krwi komórkowej przez 20 minut, a następnie rozdzielić do 1,5 ml probówek polipropylenowych ze stożkowym dnem i zatrzaskowymi pokrywkami. Upewnij się, że względna objętość rozpuszczalnika organicznego nie przekracza 5%.</li>
		<li>Za pomocą pipety umieść 50 μl wzbogaconej krwi pełnej w środku każdego okręgu na kartach filtracyjnych.</li>
		<li>Suszyć plamy krwi na kartach filtracyjnych w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
		<li>Przygotować wzorce kalibracyjne takrolimusu w ludzkiej krwi pełnej EDTA przy stężeniach takrolimusu 1, 2,5, 5, 10, 25 i 50 ng/ml. Przygotować ślepą próbkę do ekstrakcji, taką jak wzorce kalibracyjne, z roztworem do wytrącania białek zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus ("próbka zerowa").</li>
		<li>Przygotować próbki QC w ludzkiej krwi pełnej EDTA w stężeniach 0, 2, 4, 20, 40 ng/ml. Przygotować próbkę ślepą. W przeciwieństwie do próbek kontroli jakości, które są ekstrahowane z wytrącaniem zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus, tę ślepą próbkę ekstrahować roztworem do wytrącania białek, który nie zawiera wzorca wewnętrznego D2,13 C-takrolimus ("próbka ślepa").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek klinicznych
	<ol>
		<li>Zebrać wysuszone plamy krwi zgodnie z opisem w43,44.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja próbek suszonej plamki krwi takrolimusu
<ol>
	<li>Sprawdź wzrokowo wysuszoną plamkę krwi, aby upewnić się, że próbka jest akceptowalna i objętość45.</li>
	<li>Przebij środek plamki krwi na karcie filtracyjnej za pomocą dziurkacza o średnicy 6 mm. 
	Uwaga: Jakość stempli może być monitorowana przez ważenie. Dziurkowana nasycona tarcza filtracyjna waży średnio 5,02 mg ± 0,09 mg (zakres: 4,83-5,14 mg, n=12).</li>
	<li>Umieść krążki w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml ze stożkowym dnem i zatrzaskowymi pokrywkami.</li>
	<li>Dodaj 20-30 kul do każdej tuby.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu do wytrącania białek (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7:3, v:v z wzorcem wewnętrznym 2,5 ng/ml) do każdej probówki. Do ekstrakcji próbek zerowych należy użyć roztworu do wytrącania białek bez wzorca wewnętrznego.</li>
	<li>Homogenizuj krążki w blenderze kulowym przez 1 minutę (maksymalna prędkość, ustawienie "10").</li>
	<li>Potrząsaj próbkami w temperaturze pokojowej na wirze wielorurowym (maksymalna prędkość, ustawienie "10") przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki przy ciśnieniu 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do szklanych fiolek HPLC wyposażonych w wkładkę o pojemności 300 μl. Stosować wstępnie nacięte uszczelki teflonowe. 
	Uwaga: Wyekstrahowane próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej do czasu analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
3. Analiza LC-MS/MS
<ol>
	<li>Załadować 100 μl supernatantu z wyekstrahowanej próbki do kolumny ekstrakcyjnej z wkładem C8 i przemywać 0,1% kwasem mrówkowym w stosunku 7:3 w wodzie: acetonitrylu o przepływie 5 ml/min przez 1 min. Połączenia zaworu przełączającego pokazano na rysunku 2, a gradient przebiegający przez pompę wyciągową w tabeli 1.</li>
	<li>Następnie należy aktywować zawór przełączający, powodując płukanie wsteczne analitów z kolumny wstępnej na kolumnę analityczną.</li>
	<li>Ustaw termostat kolumny na 65 °C.</li>
	<li>Eluować anality z kolumny analitycznej, stosując natężenia przepływu i gradient przedstawione w tabeli 1.</li>
	<li>Podłączyć kolumnę analityczną do tandemowego spektrometru mas za pośrednictwem źródła jonizacji turbo electrospray. Dostosuj kluczowe parametry spektrometru mas zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Wykrywanie jonów dodatnich ([M+Na]+) w trybie reakcji wielokrotnej (MRM). Do oznaczania ilościowego należy stosować następujące przemiany jonowe: takrolimus: m/z (masa/ładunek) = 826,6 → 616,2 i D 2,13C-takrolimus: m/z = 829,6 → 619,2, 
	Uwaga: Całkowity czas pracy wynosi 4,6 min.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja
<ol>
	<li>Dla każdej serii należy wygenerować krzywą kalibracyjną na podstawie kalibratorów przygotowanych w ppkt 1.3.5 i uwzględnić ją w każdej serii analitycznej.
	<ol>
		<li>Wygeneruj krzywą kalibracyjną, wykreślając stężenia nominalne w funkcji współczynnika odpowiedzi analitu (powierzchnia piku [analit] / powierzchnia piku [wzorzec wewnętrzny]) za pomocą oprogramowania spektrometru mas.</li>
		<li>Zamontuj kalibratory za pomocą dopasowania kwadratowego w połączeniu z ważeniem 1/X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu uzyskania odpowiedniej ilości takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi należy zintegrować piki takrolimusu i wzorca wewnętrznego w ekstrahowanych chromatogramach MRM. Obliczyć współczynnik odpowiedzi dla takrolimusu (powierzchnia piku [analit] / powierzchnia piku [wzorzec wewnętrzny]) i porównać z krzywą wzorcową przy użyciu oprogramowania do spektrometrii mas.</li>
</ol>
5. Procedury walidacji
<ol>
	<li>Dolna granica wykrywalności (LLOD) i dolna granica oznaczalności (LLOQ).
	<ol>
		<li>Za dolną granicę wykrywalności (LLOD) należy uznać najniższe stężenie takrolimusu o stosunku wartości szczytowej do szumu wynoszącym 4:1. Zdefiniować dolną granicę oznaczalności (LLOQ) jako najniższe stężenie krzywej kalibracyjnej z dokładnością równą lub lepszą niż ± 20 % odchylenia od stężenia nominalnego i precyzją równą lub lepszą niż 20 % (współczynnik wariancji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładność i precyzja w ciągu dnia i między nimi.
	<ol>
		<li>Przetestuj dokładność i precyzję przy czterech poziomach stężeń: 2 ng/ml (QC1), 4 ng/ml (QC2), 20 ng/ml (QC3) i 40 ng/ml (QC4).</li>
		<li>Przygotuj próbki kontroli jakości w każdym dniu walidacji w ludzkiej krwi pełnej EDTA, wysusz na kartach filtracyjnych, wyekstrahuj i przeanalizuj zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Określ dokładność i precyzję w ciągu dnia na podstawie 6 próbek na poziom stężenia QC.</li>
		<li>Oceń dokładność i precyzję w ciągu 20 dni. Mierz każdy poziom kontroli jakości za pomocą 4 próbek każdego dnia.</li>
		<li>Analizuj dwie krzywe kalibracyjne razem z próbkami kontroli jakości każdego dnia.</li>
		<li>Obliczyć dokładność śróddzienną jako % stężenia nominalnego (sześć próbek na poziom stężenia, zob. ppkt 5.2.2). Obliczanie precyzji jako współczynnika wariancji (CV%).</li>
		<li>Należy uznać dokładność śróddzienną za dopuszczalną, jeżeli mieści się ona w granicach dopuszczalności od 85% do 115% stężenia nominalnego. Uznaj, że precyzja śróddzienna jest dopuszczalna, jeśli jest równa lub lepsza niż CV (współczynnik wariancji) wynoszący 15%.</li>
		<li>Oblicz dokładność i precyzję między dniami jako średnią dla każdego poziomu stężenia QC analizowanego w ciągu 20 dni walidacji.</li>
		<li>Za dopuszczalną uznaje się średnią dokładność międzydzienną, jeżeli mieści się ona w granicach dopuszczalności od 85% do 115% stężenia nominalnego. Uznaj, że precyzja międzydzienna jest akceptowalna, jeśli jest równa lub lepsza niż CV (współczynnik wariancji) wynoszący 15%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykluczenie zakłóceń matrycy.
	<ol>
		<li>Aby wykluczyć zakłócenia, które mogą być spowodowane sygnałami matrycy, przeanalizuj puste wysuszone plamy krwi (8 różnych osób, najlepiej 4 samce i 4 samice).</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo chromatogramy jonowe. W przypadku wykrycia pików takrolimusu w oknie retencji należy zintegrować i porównać ich pola pod krzywą z obszarami pików takrolimusu w ślepych próbkach wzbogaconych takrolimusem w LLOQ. Zakłada się, że powierzchnia pików w próbkach zerowych nie przekracza 15 % powierzchni pików takrolimusu w LLOQ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tłumienie jonów/wzmacnianie jonów.
	<ol>
		<li>Należy zastosować protokół infuzji po kolumnie, jak opisano45, aby ocenić potencjalną interferencję tłumienia jonów/wzmacniania jonów spowodowaną przez składniki matrycy koelucyjnej.</li>
		<li>Podawać takrolimus w stężeniu 10 μg/ml rozpuszczonym w 0,1% kwasie mrówkowym: metanolu (30:70, v/v) po kolumnie z szybkością 10 μl/min.
		<ol>
			<li>Podłączyć pompę strzykawkową za pomocą trójnika między kolumną analityczną a źródłem elektrorozpylania spektrometru masowego.</li>
			<li>Monitorować intensywność sygnału MS/MS przejść MRM dla takrolimusu i jego wzorca wewnętrznego (m/z = 826,6 → 616,2 i m/z = 829,6 → 619,2) po wstrzyknięciu ekstrahowanych próbek zerowych (n = 8 próbek od różnych osobników). 
			Uwaga: W przypadku braku tłumienia jonów/wzmacniania jonów, wstrzyknięcie matrycy ślepej nie powinno mieć wpływu na ciągły sygnał spowodowany infuzją analitów, podczas gdy tłumienie jonów powoduje spadek sygnału i wzmocnienie jonów o pik.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeniesienia.
	<ol>
		<li>Oceń potencjalne przeniesienie, analizując wyekstrahowane próbki ślepe po najwyższych kalibratorach (50 ng/ml, n = 6).</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo chromatogramy jonowe. W przypadku wykrycia pików takrolimusu w oknie retencji należy zintegrować i porównać ich pola pod krzywą z obszarami pików takrolimusu w ślepych próbkach wzbogaconych takrolimusem w LLOQ. Zakłada się, że powierzchnia pików w próbkach zerowych nie przekracza 15 % powierzchni pików takrolimusu w LLOQ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzysk wydobycia.
	<ol>
		<li>Określić poziomy odzysku, porównując sygnały analitów po ekstrakcji próbek kontroli jakości przy wszystkich czterech poziomach stężeń (n = 6 na stężenie) z sygnałami ślepej próby wysuszonej krwi wzbogaconej odpowiednimi ilościami takrolimusu po ekstrakcji.</li>
		<li>Przygotować cztery zestawy kontroli jakości (poziomy stężenia: 2, 4, 20, 40 ng/ml).</li>
		<li>Przygotować kolejne 4 zestawy odpowiednich "próbek do testów odzysku", nasycając 50 μl ślepej próby pełnej EDTA na kartach bibuły filtracyjnej i susząc przez 2 godziny.</li>
		<li>Następnie, zarówno w przypadku kontroli jakości, jak i ślepych "próbek do badania odzysku", należy wyciąć nożyczkami całą plamkę krwi na karcie filtracyjnej i umieścić powstałe krążki w polipropylenowej probówce ze stożkowym dnem i zatrzaskową pokrywką.</li>
		<li>Wyodrębnić wszystkie próbki.</li>
		<li>Przenieść supernatanty (400 μl) do szklanych fiolek HPLC.</li>
		<li>Dodać roztwór podstawowy takrolimusu do ślepej próby "wyekstrahowanych próbek do badania odzysku" w celu uzyskania stężeń 2, 4, 20 i 40 ng/ml (4 μl 200, 400, 2 000, 4 000 ng/ml roztworów podstawowych takrolimusu na 400 μl supernatantu).</li>
		<li>Po analizie LC-MS/MS porównaj sygnały zarówno w próbkach QC, jak i "próbkach do testu odzysku" o odpowiednim stężeniu (odzysk% = próbki sygnału wzmocnione przed ekstrakcją / próbki sygnału wzmocnione po ekstrakcji x 100).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integralność rozcieńczenia.
	<ol>
		<li>Ustalić integralność rozcieńczenia, używając próbek wzbogaconych analitami w stężeniach 500, 250 i 100 ng/ml.</li>
		<li>Po ekstrakcji próbki rozcieńczyć roztworem do wytrącania białek (1:10, n = 3 na poziom stężenia).</li>
		<li>Obliczyć odchylenia od stężeń nominalnych. Weź pod uwagę wyniki, które mieszczą się w zakresie 85%-115% akceptowalnych wartości nominalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stabilność.
	<ol>
		<li>Zbadać stabilność, używając próbek kontroli jakości na wszystkich czterech poziomach stężeń (n = 4 na stężenie) analizowanych w różnych punktach czasowych i w różnych warunkach przechowywania.</li>
		<li>Porównaj wyniki po przechowywaniu z wartościami nominalnymi. Weź pod uwagę wyniki, które mieszczą się w zakresie 85%-115% akceptowalnych wartości nominalnych.</li>
		<li>Ustalić stabilność próbki przez 1 tydzień w temperaturze otoczenia, 1 tydzień w temperaturze 4 °C, 1 miesiąc w temperaturze -20 °C i 1 miesiąc w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zbadać stabilność podczas zamrażania i rozmrażania w trzech cyklach (-20 °C). Zbadaj stabilność wyekstrahowanej próbki i automatycznego podajnika próbek, umieszczając je w termostatowanym autosamplerze ustawionym na 4 °C. Wstrzyknąć próbki po 72 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż, jak wspomniano powyżej, koncepcja monitorowania leku terapeutycznego i przestrzegania zaleceń dotyczących stosowania takrolimusu w oparciu o wysuszone plamki krwi jest atrakcyjna, istnieją wyzwania analityczne, które wykraczają poza te zwykle związane z analizą LC-MS/MS takrolimusu w żylnych próbkach krwi pełnej EDTA. Należą do nich między innymi fakt, że matryca jest pełną krwią kapilarną nasączoną bawełnianym materiałem linters użytego tutaj materiału karty filtracyjnej oraz niską objętość krwi (20 μl). Niemni...

Takrolimus jest silnym środkiem immonosupresyjnym1-7, który ma strukturę makrolidową8 (Rysunek 1). Ze względu na izomerię cis-trans wiązań C-N tworzy dwa rotamery w roztworze9, które można rozdzielić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) Takrolimus jest lipofilowy i rozpuszczalny w alkoholach (metanol: 653 g/l, etanol: 355 g/l), chlorowcowanych węglowodorach (chloroform: 573 g/l) i eterze. Jest trudno rozpuszczalny w węglowodorach alifatycznych (heksan: 0,1 g/l i wodzie (pH 3: 0,0047 g/l)9. Cząsteczka nie zawiera chromoforu, a jej maksymalna absorpcja promieniowania UV wynosi 192 nm. Takrolimus działa poprzez hamowanie kalcyneuryny. Jego mechanizm działania został omówiony w piśmiennictwie10,11. Obecnie stosuje się go u ponad 80% pacjentów po przeszczepach narządów litych w Stanach Zjednoczonych12.
Indeks terapeutyczny takrolimusu jest uważany za wąski13. Ponadto korelacja między dawkami takrolimusu a stężeniami we krwi jest słaba, a farmakokinetyka zmienna14,15. Monitorowanie terapeutyczne leków w celu kierowania dawkowaniem takrolimusu u pacjentów po przeszczepieniu jest zatem ogólną praktyką kliniczną16-20. Celem jest utrzymanie stężenia takrolimusu we krwi w ustalonym zakresie terapeutycznym. Stężenia takrolimusu we krwi poniżej zakresu terapeutycznego mogą powodować zwiększoną aktywność przewlekłych lub ostrych reakcji alloimmunologicznych, podczas gdy stężenia powyżej okna terapeutycznego zwiększają ryzyko nadmiernej immunosupresji, raka i toksyczności, takich jak nefrotoksyczność, neurotoksyczność, nadciśnienie tętnicze i cukrzyca. Duża farmakokinetyczną zmienność wewnątrzosobniczą takrolimusu może być szkodliwa zarówno dla przeżycia przeszczepionego narządu, jak i pacjenta21,22. Podczas gdy zmienność międzyosobnicza farmakokinetyki takrolimusu jest spowodowana głównie polimorfizmami CYP3A5, przyczyny zmienności wewnątrzosobniczej obejmują między innymi interakcje lek-lek, choroba-lek i żywność-lek14,15. Również brak przestrzegania schematu leczenia immunosupresyjnego jest czynnikiem przyczyniającym się i główną przyczyną utraty przeszczepu23,24.
Te rozważania sugerują, że częste domowe stosowanie leków terapeutycznych i monitorowanie przestrzegania zaleceń dotyczących stężenia takrolimusu we krwi pełnej może być korzystne dla zapewnienia, że pacjenci mają kontakt z takrolimusem w pożądanym oknie terapeutycznym przez cały czas. Jednak logistyka i koszty częstszego monitorowania leków terapeutycznych, zgodnie z obecną praktyką kliniczną15, są zaporowe. Jednym z powodów jest to, że pacjent musi udać się do flebotomisty w celu pobrania wymaganej próbki krwi żylnej. Zaschnięte plamy krwi pojawiły się ostatnio jako atrakcyjna koncepcja25-28. Po zwykłym opuszkowaniu palca pacjent pobiera kroplę krwi na specjalnej karcie z bibuły filtracyjnej, a po wyschnięciu plamki krwi może ona zostać wysłana do laboratorium centralnego w celu analizy takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych, które pacjent może obecnie przyjmować. Stało się to możliwe dzięki opracowaniu wysoce czułych i specyficznych testów LC-MS/MS do oznaczania ilościowego takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych w bardzo małych objętościach krwi, takich jak suche plamki krwi (zwykle 20 μl krwi)25,29-43. Kolejną zaletą jest to, że minimalnie inwazyjne strategie pobierania próbek o małej objętości, takie jak wysuszone plamki krwi, znacznie ułatwiają monitorowanie leków terapeutycznych i badania farmakokinetyczne u małych dzieci28.
Takrolimus jest zwykle mierzony w żylnej krwi pełnejEDTA 15. Powodem jest to, że takrolimus w znacznym stopniu przenika do komórek krwi, a badania kliniczne wykazały lepszą korelację między minimalnymi stężeniami takrolimusu we krwi niż w osoczu ze zdarzeniami klinicznymi15,18. Dla porównania, analiza takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi opiera się na krwi włośniczkowej, która jest zmieszana z matrycą bibuły filtracyjnej. Stwarza to wyzwania w zakresie solubilizacji takrolimusu i potencjalnych zakłóceń w analizie LC-MS/MS. W tym miejscu przedstawiamy uznany i zwalidowany test oparty na homogenizacji wysuszonej plamki krwi za pomocą mieszalnika kulowego w połączeniu z procedurą czyszczenia próbki w trybie online o wysokim przepływie i analizą LC-MS/MS. Na dzień dzisiejszy test ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego oznaczania ponad pięciu tysięcy próbek suszonej kropli krwi takrolimusu w celu monitorowania przestrzegania zaleceń w badaniach klinicznych.

<table><tbody><tr><td>Konwencja</td><td>Farmakopealna Stanów Zjednoczonych</td><td></td> 1642802 <td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Czerwone krwinki</td><td>Szpital Uniwersytetu Kolorado</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Osocze</td><td>Szpital Uniwersytetu Kolorado</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Aceton CHROMASOLV, HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol 99,9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 &ndash; 10 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>MÄTTLER TOLEDO</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l końcówki do pipet z filtrem, sterylne</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1,000 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>MÄTTLER TOLEDO</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l końcówki do pipet z filtrem, sterylne</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l końcówki do pipet z filtrem, sterylne</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Probówka Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>MÄTTLER TOLEDO</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l końcówki do pipet z filtrem, sterylne</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l końcówki do pipet z filtrem</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l końcówki do pipet z filtrem, sterylne</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l wkładki do fiolek HPLC</td><td>Wirówka Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Balances AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogenizator</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td></td> Jednorazowe chusteczki<td></td><td></td> Biofuge Fresco Heraeus 290395 <td></td></tr><tr><td></td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pojemniki, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice, nitrylowe</td><td>Rękawice marki Titan</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki HPLC, 9 mm, 2 ml, przezroczyste</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki do fiolek HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Igła, 18 G 1.5</td><td></td><td>305196Precyzyjny</td><td></td></tr><tr><td>stojak na rurki Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na fiolki HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki stalowe 0,9 i 2 mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki do przechowywania zamrażarek / lodówek</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy wielorurowy wirownik</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny podajnik próbek</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>kumpel. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa binarna, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa binarna, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Mikro odgazowywacz próżniowy, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Piec kolumnowy,&nbsp; Agilent 1290 z 2 pozycjami&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Termostatowana komora kolumny ze zintegrowanym 6-portowym zaworem przełączającym</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Wkład wstępnej kolumny HPLC, Zorbax XDB C8 (5 &micro; Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; Kolumna analityczna 12,5 mm</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>HPLC, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &mikro; Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; 150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>Tandemowy spektrometr</td><td></td><td></td><td></td>masowy</tr><tr><td>API5000 MS/MS ze źródłem TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do spektrometrii mas</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą lc-ms/ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Inhibitor kalcyneuryny, takrolimus, jest kamieniem węgielnym większości protokołów leczenia immunosupresyjnego po przeszczepie narządów litych w Stanach Zjednoczonych. Takrolimus jest lekiem o wąskim indeksie terapeutycznym i jako taki wymaga monitorowania dawki terapeutycznej i dostosowania dawki w oparciu o minimalne stężenia we krwi pełnej. Aby ułatwić domowe monitorowanie leków terapeutycznych i ich przestrzegania, atrakcyjną koncepcją jest pobieranie wysuszonych plam krwi. Po nakłuciu palca pacjent pobiera kroplę krwi na bibułę filtracyjną w domu. Po wysuszeniu krew jest wysyłana do laboratorium analitycznego, gdzie takrolimus jest oznaczany ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (HPLC-MS/MS) w połączeniu z prostym etapem ręcznego wytrącania białek i ekstrakcją kolumnową w trybie online.
Do analizy takrolimusu, 6-milimetrowy krążek jest wybijany z nasyconego środka plamki krwi. Plamka krwi jest homogenizowana za pomocą mieszalnika kulowego, a następnie białka są wytrącane metanolem/0,2 MZnSO4 zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus. Po wirowaniu i odwirowaniu 100 μl supernatantu wstrzykuje się do kolumny ekstrakcyjnej online i przemywać 5 ml/min 0,1-kwasem mrówkowym/acetonitrylem (7:3, v:v) przez 1 min. Następnie aktywowany jest zawór przełączający, a anality są przepłukiwane wstecznie na kolumnę analityczną (i rozdzielane za pomocą 0,1% gradientu kwasu mrówkowego/acetonitrylu). Takrolimus jest oznaczany ilościowo w dodatnim trybie wielokrotnej reakcji (MRM) przy użyciu tandemowego spektrometru masowego.
Test jest liniowy od 1 do 50 ng/ml. Zmienność między testami (3,6%-6,1%) i dokładność (91,7%-101,6%) oceniane w ciągu 20 dni spełniają kryteria akceptacji. Średni odzysk ekstrakcji wynosi 95,5%. Nie ma istotnych przeniesień, zakłóceń matrycowych i efektów matrycowych. Takrolimus utrzymuje się w suchych plamkach krwi w temperaturze pokojowej i +4 °C przez 1 tydzień. Próbki wyekstrahowane w automatycznym podajniku próbek są stabilne w temperaturze +4 °C przez co najmniej 72 godziny.

Reprezentatywne chromatogramy jonowe ślepej próbki, próbki wzbogaconej o dolną granicę oznaczalności oraz próbki pacjenta są pokazane na rysunku 3.
Krzywe kalibracyjne
Dolna granica wykrywalności wynosiła 0,5 ng/ml, a dolna granica oznaczalności wynosiła 1,0 ng/ml. Pięćdziesiąt ng/ml zostało wybrane jako najwyższy kalibrator, ponieważ wyższe stężenia prawdopodobnie nie zostaną osiągnięte w klinice w normalnych warunkach.
...

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z oznaczaniem ilościowym takrolimusu w próbkach krwi po dożylnym pobraniu krwi jest to, że pacjenci mogą samodzielnie pobierać próbki; minimalnie inwazyjne strategie pobierania próbek o małej objętości, takie jak wysuszone plamki krwi, ułatwiają również monitorowanie leków terapeutycznych i badania farmakokinetyczne u małych dzieci. Po zwykłym opuszkowaniu palca pacjent pobiera kroplę krwi na specjalnej karcie z bibuły filtracyjnej, a po wysuszeniu plamki krwi może ona zostać wysłana do centralnego laboratorium w celu analizy takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych, które pacjent może przyjmować.Kwantyfikacja leków na wysuszone plamki krwi stała się możliwa dzięki opracowaniu wysoce czułych i swoistych testów LCM SM S do oznaczania ilościowego takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych w bardzo małych objętościach krwi, takich jak wysuszone plamki krwi. Najpierw należy przygotować roztwory podstawowe w czystym metanolu o stężeniu jednego miligrama na mililitr dla takrolimusu i stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Dla D dwóch podwielokrotnych roztworów podstawowych o stężeniu 13 C i przechowywać w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza lub niższej w każdym dniu ekstrakcji, należy przygotować metanol i 0,2 molowy siarczan w wodzie w proporcji 7 do 3 w celu wytrącenia białek i ekstrakcji takrolimusu.Roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego jest dodawany do roztworu strącającego. Ustaw termin wygaśnięcia roztworu na 12 godzin. Następnie należy przygotować roztwory podstawowe takrolimusu, przeprowadzając odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego przy użyciu czystego metanolu w celu przygotowania wzorców i próbek do kontroli jakości.Wlać 20 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonego roztworu podstawowego do EDT. Krew pełną inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym wstrząsaniem w łaźni wodnej przez 20 minut, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie takrolimusu do komórkowych składników krwi. W celu przygotowania większej ilości kalibratorów i próbek kontroli jakości należy wprowadzić 2000 mikrolitrów odpowiednio rozcieńczonego roztworu podstawowego do EDT.Krew pełną inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym wstrząsaniem w łaźni wodnej przez 20 minut, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie takrolimusu do komórkowych składników krwi. Następnie porcjować próbki do 1,5-mililitrowych probówek polipropylenowych ze stożkowym dnem i zatrzaskowymi pokrywkami. Umieścić 50 mikrolitrów wzbogaconej krwi pełnej w środku każdego okręgu na kartach filtracyjnych za pomocą pipety po wysuszeniu plam krwi w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, przygotować wzorce kalibracyjne takrolimusu w ludzkiej krwi pełnej EDTA przy stężeniach takrolimusu wynoszących jeden 2,5, 5, 10, 25 i 50 nanogramów na mililitr.Przygotować ślepą próbkę do ekstrakcji, taką jak wzorce kalibracyjne, z roztworem do wytrącania białek, niezawierającym wzorca wewnętrznego D dwa 13 C takrolimus. Następnie przygotuj próbki kontroli jakości w ludzkiej pełnej krwi EDTA w stężeniach 0, 2, 4, 20 i 40 nanogramów na mililitr. Przygotuj również ślepą próbkę Po zebraniu wysuszonych plam krwi należy wizualnie sprawdzić każdą z nich, aby zapewnić akceptowalną jakość i objętość próbki.Następnie przebij środek plamki krwi na karcie filtracyjnej sześciomilimetrowym dziurkaczem. Umieść krążki w 1,5-mililitrowych rurkach polipropylenowych ze stożkowym dnem i zatrzaskaj pokrywki. Dodaj od 20 do 30 pocisków do każdej tuby.Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu do wytrącania białek do każdej probówki. Homogenizuj krążki w blenderze kulowym przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Po zakończeniu wstrząsać próbkami w temperaturze pokojowej na wirze z wieloma probówkami z maksymalną prędkością przez 10 minut.Następnie odwirować próbki w temperaturze 16 000 GS i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu przenieść SNAT do szklanych fiolek HPLC wyposażonych w wkładkę o pojemności 300 mikrolitrów. W tym momencie załadować 100 mikrolitrów supernatu ekstranatu wyekstrahowanej próbki na kolumnę ekstrakcyjną z ośmioma wkładami C, przemyć ją w stosunku siedem do trzech 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i kwaśnego nitrylu przy przepływie pięciu mililitrów na minutę.Następnie na jedną minutę należy aktywować zawór przełączający, co powoduje płukanie wsteczne analitów z kalibracji wstępnej do kolumny analitycznej. Następnie ustaw termostat kolumnowy na 65 stopni Celsjusza. Eluować anality z kolumny analitycznej, stosując przedstawione tutaj natężenia przepływu i gradient.Podłączyć kolumnę analityczną do tandemowego spektrometru mas za pośrednictwem źródła jonizacji turbo electrospray. Dostosuj kluczowe parametry spektrometru mas zgodnie z poniższą tabelą. Następnie wykryj jony dodatnie w trybie reakcji wielokrotnej.W celu ilościowego określenia takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi należy porównać go z krzywą kalibracyjną przy użyciu reprezentatywnych chromatogramów jonowych ślepej próbki za pomocą oprogramowania do spektrometrii mas. Pokazano tutaj próbkę wzbogaconą o dolną granicę oznaczalności oraz próbkę pacjenta. Typowa krzywa kalibracyjna jest pokazana tutaj.Średni współczynnik korelacji wynosi 0,9994. Wyniki dokładności i precyzji są szczegółowo przedstawione tutaj. Nie zaobserwowano żadnych oznak znaczącej supresji jonów lub wzmocnienia jonów i nie zaobserwowano istotnego przeniesienia skutkującego przekroczeniem pików.Wykryto 15% sygnału przy dolnej granicy oznaczalności. Integralność rozcieńczenia badano, analizując próbki przygotowane w stężeniach powyżej najwyższego kalibratora i rozcieńczone w roztworze do wytrącania białek po ekstrakcji w celu osiągnięcia stężeń docelowych. Wszystkie badane rozcieńczenia spełniały kryteria akceptacji.Nie stwierdzono żadnych strat po tygodniu przechowywania w temperaturze pokojowej, po tygodniu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza i po miesiącu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ponadto nie zaobserwowano żadnych strat po miesiącu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po trzech cyklach zamrażania i rozmrażania oraz po 72 godzinach ekstrakcji próbek w próbniku automatycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po opanowaniu 20 próbek można wyekstrahować w czasie krótszym niż jedna godzina.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że kluczem do wiarygodnej oceny ilościowej jest jakość wysuszonej plamki krwi oraz to, że krążek jest wykrawany z całkowicie nasyconego obszaru bibuły filtracyjnej. Techniki i test pokazane w tym filmie zapewniają technologię platformy do ilościowego oznaczania innych leków immunosupresyjnych i leków w wysuszonych plamach krwi.

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Określenie ilości takrolimusu immunosupresyjnego na wysypkach krwi suszonej przy użyciu LC-MS/MS

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Przedstawiamy metodę oceny sorpcji leków za pomocą pompy i leków modelowych (diazepam i takrolimus). Po analizie leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej obliczane są stężenia leków i poziomy sorpcji w probówkach zestawów do podawania.

Ocena sorpcji leków do probówek na bazie PVC i innych niż PVC w zestawach do podawania za pomocą pompy

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Ivacaftor i kombinacja iwakaftoru-lumakaftora to dwa nowe leki na mukowiscydozę. Jednak nadal brakuje wiedzy na temat ich farmakokinetyki / choroby farmakologicznej i farmakologii. Przedstawiamy zoptymalizowaną technikę HPLC-MS do jednoczesnej analizy iwakaftoru i jego głównych metabolitów oraz lumakaftoru.

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Ten protokół opisuje prostą i użyteczną metodę przechowywania krwi obwodowej i surowicy/osocza do dalszych analiz, takich jak ocena polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i test ELISA.

Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Obecne metody analizy przestrzegania przez pacjentów złożonych schematów leczenia gruźlicy opornej na leki (DR-TB) mogą być niedokładne i wymagające dużych zasobów. Nasza metoda analizuje włosy, łatwo zbieralną i przechowywaną matrycę, pod kątem stężeń 11 leków DR-TB. Dzięki LC-MS/MS możemy określić poziomy leków poniżej nanogramów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia przestrzegania leków.

Zweryfikowany panel LC-MS/MS do ilościowego określenia 11 leków opornych na gruźlicę w małych próbkach włosów

Opisano niezawodną i powtarzalną metodę wywoływania jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym przy użyciu impaktora Infinite Horizon. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną ramę i zacisk do stabilizacji kręgosłupa. Standaryzowana procedura oraz biomechaniczne parametry urazu pozwalają na uzyskanie wystarczających i trwałych obrażeń.

Model kontuzyjny jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym z wykorzystaniem urządzenia Infinite Horizon Impactor

Aby odkryć najwcześniejsze mechanizmy molekularne leżące u podstaw inicjacji raka prostaty, desperacko potrzebne są nowatorskie i innowacyjne systemy i podejścia do modelowania ludzi.  Potencjał mezenchymy zatok układu moczowo-płciowego przed gruczołem krokowym (UGSM) do indukowania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych do tworzenia ludzkiego nabłonka prostaty jest potężnym narzędziem eksperymentalnym w badaniach nad prostatą.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Poznaj metodę oznaczania takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS. Ta technika umożliwia mało inwazyjny pobiór próbek i monitorowanie stężenia leku u pacjentów po przeszczepach.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Przeglądaj więcej filmów