Name: Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę oznaczania wzrostowego i ekstrakcji białek do analizy degradacji w Saccharomyces cerevisiae. Technika umożliwia szybkie określenie wymagań genetycznych dla stabilności białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium Rubensteina za zapewnienie wspierającego i entuzjastycznego środowiska badawczego. Dziękujemy Ryanowi T. Gibsonowi za pomoc w optymalizacji protokołu. Dziękujemy Markowi Hochstrasserowi (Uniwersytet Yale) i Dieterowi Wolfowi (Universität Stuttgart) za szczepy drożdży i plazmidy. Dziękujemy naszym anonimowym recenzentom za pomoc w poprawie przejrzystości i użyteczności tego manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą badawczą przyznaną przez oddział Sigma Xi na rzecz SGW na Uniwersytecie Stanowym Ball, grant National Institutes of Health (R15 GM111713) dla E.M.R., nagrodę badawczą ASPiRE Uniwersytetu Stanowego Ball dla E.M.R. oraz fundusze z Biura Rektora i Wydziału Biologii Uniwersytetu Stanowego Ball.

1. Test wzrostu drożdży w celu identyfikacji potencjalnych mutantów z defektem degradacji białek
<ol>
	<li>Przeprowadzić transformację komórek drożdży typu dzikiego oraz mutantów plazmidem kodującym niestabilne białko połączone, w odpowiedniej ramce odczytu, z reporterowym enzymem metabolicznym.</li>
	<li>Zaszczepić transformanty w 5 ml syntetycznego medium zdefiniowanego (SD), które jest selektywne dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym rotowaniu.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) dla każdej hodowli nocnej. 
	UWAGA: Po nocnej inkubacji komórki w hodowli mogą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego lub stacjonarnego, ale powinny osiągnąć minimalną wartość OD600 równą 0,2. Bardzo wolno rosnące szczepy drożdży mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji niż jedna noc lub zaszczepienia większej liczby komórek, co należy ustalić empirycznie.</li>
	<li>Przygotować sześciokrotne rozcieńczenia seryjne transformowanych komórek drożdży w sterylnej płytce 96-dołkowej, zaczynając od rozcieńczenia komórek do OD600 0,2. Każdego badanego transformanta drożdży należy umieścić w osobnym rzędzie płytki 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Dla każdego transformanta obliczyć objętość hodowli nocnej wymaganą do rozcieńczenia komórek do OD600 0,2 w końcowej objętości 200 µl. Dodać tę objętość hodowli nocnej do odpowiedniego dołka w kolumnie 1. Dodać odpowiednią ilość sterylnej wody, aby uzyskać objętość 200 µl.</li>
		<li>Dla każdego rzędu drożdży dodać 125 µl sterylnej wody do dołków w kolumnach 2, 3 i 4. 
		UWAGA: Indywidualnie pakowane sterylne płytki 96-dołkowe mogą być dostarczone ze sterylnymi pokrywkami. Pokrywki mogą służyć jako zbiorniki dla sterylnej wody rozprowadzanej w tym kroku. Pozwala to na jednoczesny transfer sterylnej wody do wszystkich dołków w danej kolumnie za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Wymieszać zawartość pierwszej kolumny (drożdże rozcieńczone do OD600 0,2) poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy pipetą wielokanałową.</li>
		<li>Przenieść 25 µl drożdży z kolumny 1 do kolumny 2 za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszać poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy. Przenieść 25 µl z kolumny 2 do kolumny 3 oraz 25 µl z kolumny 3 do kolumny 4 (dokładnie mieszając na każdym etapie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać każdą próbkę pipetą wielokanałową. Przechodząc od kolumn z najbardziej do najmniej rozcieńczonych drożdży, nanieść 4 µl każdej próbki na dwie płytki zawierające odpowiednie medium selektywne. Użyć jednej płytki z medium utrzymującym selekcję plazmidu (płytka ta służy jako kontrola naniesienia i wzrostu drożdży). Użyć drugiej płytki z medium selekcjonującym utrzymanie plazmidu i ekspresję niestabilnego białka połączonego z enzymem reporterowym. Ponieważ drożdże szybko osiadają, należy mieszać komórki poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy w regularnych odstępach czasu. 
	UWAGA: Płytki bardziej wysuszone chłoną ciecz łatwiej niż świeżo przygotowane, dlatego są zalecane do tych eksperymentów. Wilgotne płytki można suszyć poprzez inkubację w temperaturze pokojowej przy niskiej wilgotności przez 1–2 dni lub krócej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Płytki mogą wysychać nierównomiernie, jeśli laminarny przepływ powietrza jest równoległy do blatu. Użycie szablonu ułatwia nanoszenie komórek drożdży w regularnych odstępach. Dwa przykładowe szablonu przedstawiono na Rysunku 1. Można je wydrukować, wyciąć i przymocować do wnętrza pokrywki szalki Petriego.</li>
	<li>Pozostawić płytki do wyschnięcia na blacie.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2–6 dni.</li>
	<li>Wykonać zdjęcie każdej płytki po inkubacji.</li>
</ol>
<img alt="Schematy projekcji stereograficznej A i B ilustrujące koncepcje transformacji matematycznej." src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Szablony do nanoszenia komórek drożdży na 100-mm płytki agarowe. Szablony te mogą być wykorzystane w celu ułatwienia nanoszenia drożdży w regularnych odstępach za pomocą pipety wielokanałowej. Szablony można wydrukować, wyciąć i przymocować do wewnętrznej strony pokrywki szalki Petriego. Należy umieścić szalkę Petriego z pożywką wewnątrz pokrywki z przymocowanym szablonem. Szablony są oznaczone nacięciem w celu śledzenia orientacji. Zaleca się, aby płytki stosowane w testach wzrostu były w podobny sposób oznaczone nacięciem w celu śledzenia orientacji. Przedstawiono szablony do nanoszenia czterech (A) lub pięciu (B) rozcieńczeń seryjnych komórek drożdży. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126%20Fig%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić wersję tego rysunku do druku z szablonami 100-mm.</a>
2. Biochemiczne potwierdzenie testu wzrostu drożdży
<ol>
	<li>Wzrost komórek drożdży i ekstrakcja białek po traktowaniu zasadą (zmodyfikowano na podstawie 31)
	<ol>
		<li>Przetransformuj komórki drożdży typu dzikiego oraz mutanty plazmidem kodującym niestabilne białko.</li>
		<li>Zaszczep transformanty w 5 ml pożywki SD selektywnej dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubuj przez noc w 30 °C w rotacji.</li>
		<li>Zmierz OD600 każdej kultury nocnej. 
		UWAGA: Po inkubacji nocnej komórki mogą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego lub stacjonarnego, ale powinny osiągnąć wartość OD600 pozwalającą na rozcieńczenie do OD600 wynoszącej 0,2 w 10 ml świeżej pożywki selektywnej (krok 2.1.4). Szczepy drożdży o bardzo wolnym wzroście mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji niż jedna noc lub zaszczepienia większej liczby komórek, co należy określić empirycznie.</li>
		<li>Rozcieńcz komórki drożdży do OD600 wynoszącej 0,2 w 10 ml świeżej pożywki selektywnej.</li>
		<li>Kontynuuj inkubację komórek w 30 °C w rotacji lub wytrząsaniu, aż kultury osiągną OD600 w zakresie od 0,8 do 1,2 (t.j. znajdą się w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego). 
		UWAGA: Jeśli badane niestabilne białko znajduje się pod kontrolą promotora regulowanego, optymalny czas indukcji ekspresji białka i zbioru komórek może się różnić w zależności od wcześniejszych badań lub obserwacji empirycznych.</li>
		<li>Zbierz 2,5 jednostek OD600 kultury do 15-ml probówki stożkowej poprzez wirowanie przy 5,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji. 
		UWAGA: Jedną jednostkę OD600 definiuje się jako ilość drożdży obecną w 1 ml kultury przy OD600 wynoszącej 1,0. Objętość kultury (w ml) wymaganą do zebrania 2,5 jednostek OD600 (V) można wyznaczyć za pomocą następującego równania: V = 2,5 jednostek OD600 / zmierzona wartość OD600</li>
		<li>Resuspenduj komórki w 1 ml wody destylowanej. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Osadź komórki przez wirowanie przy 6,500 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji.</li>
		<li>Resuspenduj komórki w 100 µl wody destylowanej poprzez pipetowanie w górę i w dół lub mieszanie w wortexie, a następnie dodaj 100 µl 0,2 M NaOH. Wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubuj próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Osadź komórki (z których większość nie uwolniła jeszcze białek i jest nadal żywa) przez wirowanie przy 18,000 x g przez 5 min. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji.</li>
		<li>Resuspenduj osad w 50 – 100 µl 1x buforu do próbek Laemmli, który zlizuje komórki, poprzez pipetowanie w górę i w dół lub mieszanie w wortexie. 
		UWAGA: Usunięcie zasadowego nadosadu po wirowaniu i późniejsza resuspensja komórek w buforze do próbek Laemmli pozwala na ekstrakcję białek przy pH kompatybilnym z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE) z użyciem systemu buforu do rozdziału Tris-glicyna oraz z analizą western blot.</li>
		<li>Aby całkowicie zdenaturować białka, inkubuj lizaty w 95 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Białka podatne na agregację (np. białka z kilkoma segmentami transbłonowymi) mogą stać się nierozpuszczalne podczas inkubacji w 95 °C. W związku z tym, w analizie takich białek lizaty należy inkubować w niższych temperaturach (np. 37 °C – 70 °C) przez 10 – 30 min, zgodnie z ustaleniami empirycznymi.</li>
		<li>Ochłodź lizaty, umieszczając je na lodzie przez 5 min.</li>
		<li>Wiruj lizaty przy 18,000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej, aby osadzić materiał nierozpuszczalny. Rozdziel nadosad (rozpuszczone wyekstrahowane białko) za pomocą SDS-PAGE przed późniejszą analizą western blot (sekcja 2.2). Alternatywnie przechowuj lizaty w -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reprezentatywny protokół analizy Western Blot
	<ol>
		<li>Naniesie empirycznie określoną objętość lizatów na żel SDS-PAGE.</li>
		<li>Prowadź elektroforezę przy 200 V, aż front barwnika dotrze do dołu żelu.</li>
		<li>Przenieś białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) poprzez transfer mokry przy 20 V przez 60 – 90 min w 4 °C.</li>
		<li>Zablokuj membranę, inkubując ją w 5% odtłuszczonym mleku w soli buforowanej trisem (TBS), w rotacji, przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Odlej roztwór blokujący.</li>
		<li>Inkubuj membranę z przeciwciałem pierwotnym specyficznym dla badanego białka (lub jego znacznika epitopowego) w 1% odtłuszczonym mleku w TBS z 0,1% Tween-20 (TBS/T) przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Inkubuj membranę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z fluorophorem w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji. 
		UWAGA: Ponieważ fluorophore są światłoczułe, rozcieńczenia przeciwciał sprzężonych z fluorophore powinny być przygotowywane w ciemności. Dodatkowo inkubacja membran w obecności przeciwciał sprzężonych z fluorophore powinna odbywać się w pojemnikach światłoszczelnych. Można to osiągnąć poprzez owinięcie kuwet do inkubacji folią aluminiową.</li>
		<li>Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie membrany przy użyciu urządzenia Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowania Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Po obrazowaniu membrany inkubuj ją z przeciwciałem pierwotnym specyficznym dla białka kontrolnego (loading control) w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Inkubuj membranę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z fluorophore w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie membrany przy użyciu urządzenia Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowania Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metodologia pozwala na szybkie określenie i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek w komórkach drożdży. Eksperymenty te podkreślają użyteczność i moc drożdży jako modelowego organizmu eukariotycznego (kilka doskonałych przeglądów biologii drożdży i kompilacji protokołów obchodzenia się, przechowywania i manipulowania komórkami drożdży (np. 41-44) jest dostępnych dla badaczy nowych w organizmie). Techniki te mogą być z łatwością stosowane do badania ...

Selektywna degradacja białek jest niezbędna dla życia eukariotycznego, a zmieniona degradacja białek przyczynia się do wielu schorzeń, w tym kilku rodzajów raka, chorób neurodegeneracyjnych, chorób sercowo-naczyniowych i mukowiscydozy1-5. Układ ubikwityna-proteasom (UPS), który katalizuje selektywną degradację białek, jest nowym celem terapeutycznym dla tych schorzeń6-10. Ligazy ubikwityny kowalencyjnie przyłączają polimery 76-aminokwasu ubikwityny do białek11. Białka, które zostały oznaczone łańcuchami poliubikwityny, są rozpoznawane i proteolizowane przez proteasom12 ~2,5 megadaltonu 26S. Badania rozpoczęte na modelowym organizmie eukariotycznym Saccharomyces cerevisiae (pączkujące drożdże) miały fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów degradacji białek w komórkach eukariotycznych. Pierwszym zademonstrowanym fizjologicznym substratem UPS był drożdżowy represor transkrypcyjny MATα213,14, a wiele wysoce konserwatywnych składników UPS zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych lub scharakteryzowanych w drożdżach (np. 15-26). Odkrycia dokonane w tym wszechstronnym i genetycznie podatnym organizmie modelowym prawdopodobnie nadal dostarczą ważnych informacji na temat konserwatywnych mechanizmów degradacji za pośrednictwem ubikwityny.
Rozpoznawanie i degradacja większości substratów UPS wymaga skoordynowanego działania wielu białek. Dlatego ważnym celem w scharakteryzowaniu regulowanej degradacji danego niestabilnego białka jest określenie wymagań genetycznych dla proteolizy. Klasyczne podejścia (np. eksperymenty z pościgiem impulsowym i cykloheksymidem27) do monitorowania degradacji białek w komórkach ssaków lub drożdży są pracochłonne i czasochłonne. Chociaż tego typu metodologie zapewniają bardzo czułe środki do wykrywania degradacji białek, nie nadają się do szybkiej analizy degradacji białek ani do badań przesiewowych na dużą skalę w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu przedstawiono test oparty na wzroście drożdży do szybkiej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji niestabilnych białek.
W metodzie analizy degradacji białek opartej na wzroście drożdży, niestabilne białko będące przedmiotem zainteresowania (lub sygnał degradacji) jest łączone w ramce z białkiem, które jest wymagane do wzrostu drożdży w określonych okolicznościach. Rezultatem jest sztuczny substrat, który może służyć jako potężne narzędzie do określania genetycznych wymagań degradacji niestabilnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla wygody, najczęściej stosowane szczepy drożdży laboratoryjnych zawierają panel mutacji w genach kodujących enzymy metaboliczne biorące udział w biosyntezie poszczególnych aminokwasów lub zasad azotowych (np. 20,28-30). Enzymy te są niezbędne do proliferacji komórkowej przy braku egzogennie dostarczanych metabolitów, w syntezie których enzymy uczestniczą. Takie enzymy metaboliczne mogą zatem funkcjonować jako reportery oparte na wzroście dla degradacji niestabilnych białek, z którymi są połączone. Genetyczne wymagania dotyczące degradacji białek można łatwo wyjaśnić, ponieważ mutacje, które zapobiegają proteolizie, pozwolą komórkom zawierającym reporter degradacji rosnąć w selektywnych warunkach.
Przewaga wzrostu jest pośrednią wskazówką, że dana mutacja zwiększa obfitość interesującego nas białka. Wymagana jest jednak bezpośrednia analiza biochemiczna, aby potwierdzić, że mutacja umożliwia wzrost poprzez zwiększony poziom białka, a nie poprzez przyczyny pośrednie lub sztuczne. Wpływ mutacji na obfitość białka może być potwierdzony przez analizę western blot poziomów białka w stanie stacjonarnym w komórkach, które są nosicielami danej mutacji i nie są jej nosicielami. Przedstawiono również metodę szybkiej i efektywnej ekstrakcji białek drożdży (sekwencyjna inkubacja komórek drożdży z wodorotlenkiem sodu i buforem próbki) w postaci nadającej się do analizy metodą western blot31. Łącznie eksperymenty te ułatwiają szybką identyfikację potencjalnych regulatorów degradacji białek.

<table><tbody><tr><td>Pożądane szczepy drożdży, plazmidy, pożywka wzorcowa i składniki</td><td></td><td></td> buforowe <td>Szczepy drożdży z pożądanymi mutacjami mogą być generowane w laboratorium badacza. Drożdże typu dzikiego i różne mutanty są również dostępne na rynku (np. firmy GE Healthcare). Plazmidy kodujące białka fuzyjne mogą być generowane w laboratorium badacza.</td></tr><tr><td>3-amino-1H-1,2,4-triazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Kompetycyjny inhibitor enzymu His3. Może być włączony do pożywki w celu zwiększenia rygorystyczności testu wzrostu przy użyciu konstruktów reporterowych His3.</td></tr><tr><td>Endoglikozydaza H (forma rekombinowana z Streptomyces plicatus)Roche</td><td></td> <td>11088726001</td><td>Może być stosowana do oceny N-glikozylacji białek; zgodna ze stężeniami SDS i beta-merkaptoetanolu znajdującymi się w 1x buforze próbki Laemmli.</td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Inkubator z regulacją temperatury (np. Inkubator Heratherm model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>New Brunswick Wymienny bęben do rur 18 mm (rolka rurowa)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Wałek rurowy jest zalecany do utrzymywania przez noc kultur starterowych drożdży komórek drożdży w zawiesinie. Wytrząsarka platformowa lub rolka rurowa mogą być używane do utrzymywania większych kultur w zawiesinie.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Bęben rolkowy 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Do użytku z wałkiem rurowym</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Sterylne 96-dołkowe płytki mikrotestowe z płaskim dnem z pokrywką pakowaną pojedynczo</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Dostępne od różnych producentów &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Pipetatory jednokanałowe i wielokanałowe są używane na różnych etapach protokołu. Podczas gdy pipety wielokanałowe zmniejszają obciążenie pipetowania na kilku etapach, pipety jednokanałowe mogą być używane w całym protokole. Dostępne od różnych producentów.</td></tr><tr><td>Wirówka 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor sprzedawany z urządzeniem zawiera probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 i 2,0 ml. Rotor można zamienić na taki, który mieści stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50 ml.</td></tr><tr><td>System obrazowania płytek (np. Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Do obrazowania płytek można stosować różne systemy, w tym zaawansowane systemy obrazowania, skanery komputerowe i telefony z aparatem fotograficznym.</td></tr><tr><td>Rotor kątowy F-35-6-30 z pokrywą i adapterami do wirówki model 5430/R, 15/50 ml probówki stożkowe, 6-miejscowe</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml rurka z sitodrukiem 17 x 20 mm stożkowa, polipropylenowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Elastyczna probówka 1,5 ml, PCR czysta, Naturalne probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Dostępne w różnych rozmiarach producenci</td></tr><tr><td>Analogowy podgrzewacz Dri-Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Wrząca łaźnia wodna z płytą grzejną może być również używana do denaturacji białek</td></tr><tr><td>SDS-PAGE i aparatury transferowej, zasilaczy i sprzętu do obrazowania lub ciemni dla SDS-PAGE i transferu do membrany</td><td></td><td></td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i aplikacji</td></tr><tr><td>System obrazowania Western blot (np. skaner Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowanie Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Różni się w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>Membrany transferowe EMD Millipore Immobilon PVDF</td><td>IPFL00010 Fisher Scientific</td><td></td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Kinaza fosfoglicerynianowa (Pgk1) Przeciwciało monoklonalne, mysz (klon 22C5D8))Life</td> <td>Technologies</td><td>459250</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe (np. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr></tbody></table>

oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulowana degradacja białek jest kluczowa dla praktycznie każdej funkcji komórkowej. Wiele z tego, co wiemy o mechanizmach molekularnych i wymaganiach genetycznych dotyczących degradacji białek eukariotycznych, zostało początkowo ustalone u Saccharomyces cerevisiae. Klasyczne analizy degradacji białek opierały się na metodologiach biochemicznej pogoni za impulsem i cykloheksymidu. Chociaż techniki te zapewniają czułe środki do obserwacji degradacji białek, są pracochłonne, czasochłonne i mało wydajne. Podejścia te nie są podatne na szybkie lub zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu opisano test oparty na wzroście drożdży w celu łatwej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. W tym teście enzym reporterowy wymagany do wzrostu w określonych warunkach selektywnych jest łączony z niestabilnym białkiem. Komórki pozbawione endogennego enzymu reporterowego, ale wykazujące ekspresję białka fuzyjnego, mogą rosnąć w warunkach selektywnych tylko wtedy, gdy białko fuzyjne jest ustabilizowane (tj. gdy degradacja białka jest zagrożona). W opisanym tutaj teście wzrostu seryjne rozcieńczenia komórek drożdży typu dzikiego i zmutowanych zawierających plazmid kodujący białko fuzyjne są wykrywane na pożywce selektywnej i nieselektywnej. Wzrost w warunkach selektywnych jest zgodny z upośledzeniem degradacji przez daną mutację. Zwiększona zasobność w białko powinna być potwierdzona biochemicznie. Przedstawiono również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży w postaci odpowiedniej do elektroforezy i western blot. Oparty na wzroście odczyt stabilności białek, w połączeniu z prostym protokołem ekstrakcji białek do analizy biochemicznej, ułatwia szybką identyfikację wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. Techniki te można zaadaptować do monitorowania degradacji różnych krótkożyciowych białek. W przedstawionym przykładzie enzym His3, który jest niezbędny do biosyntezy histydyny, został połączony z Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 jest przeznaczony do degradacji po nieprawidłowym zaangażowaniu translokonu retikulum endoplazmatycznego. Komórki zawierające Deg1-Sec62-His3 były w stanie rosnąć w selektywnych warunkach, gdy białko było ustabilizowane.

Aby zilustrować tę metodologię, enzym His3 został połączony z końcem karboksylowym modelowego substratu degradacji związanej z retikulum endoplazmatycznym (ERAD), Deg1-Sec62 (Rysunek 2A), w celu utworzenia Deg1-Sec62-His3 (Rysunek 3). Deg1-Sec62 jest reprezentatywnym członkiem nowej klasy substratów ERAD, które są kierowane do degradacji po trwałym, aberrantnym powiązaniu z translokonem – kanałem odpowiedzialnym głównie za transport białek przez błonę ER32...

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie określenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji niestabilnego białka w Croce Visier. Osiąga się to poprzez fuzję enzymu reporterowego wymaganego do wzrostu w określonych warunkach selektywnych z niestabilnym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie komórki typu dzikiego lub zmutowane, obie wyrażające białko fuzyjne, są hodowane na selektywnych płytkach agarowych z pożywką.Test posiewu zapewnia wygodny wskaźnik stabilizacji białka na podstawie wzrostu komórek drożdży w celu biochemicznie potwierdzonych różnic w obfitości białek, podczas gdy typ zmutowanych komórek zawierających białko fuzyjne jest lizowany za pomocą szybkiej, nieefektywnej metody ekstrakcji białek do analizy Western blot. Wyniki pokazują, że obfitość niestabilnego białka wzrasta w komórkach z mutacją w genie niezbędnym do degradacji. Odwrotna sytuacja jest prawdziwa w przypadku degradacji kompetentnych szczepów typu dzikiego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza pulse chase i Cycl heide chase, jest to, że jest mniej pracochłonna i czasochłonna, co pozwala na szybkie i wysokoprzepustowe określenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat wymagań dotyczących degradacji szeregu niestabilnych białek. Może być również używany do identyfikacji regulatorów innych aspektów ekspresji genów, takich jak transkrypcja i translacja.Procedury zademonstrują Sheldon Watts i Justin Crowder. Studenci w moim laboratorium: Przed testem przekształć plazmid kodujący białko fuzyjne składające się z niestabilnego białka i metabolicznego enzymu reporterowego w zmutowany szczep drożdży. Podejrzewa się, że ma wady genetyczne związane z regulacją degradacji białka jako kontrolę, przekształć również ten sam plazmid w dziki szczep drożdży.Zaszczepić transformanty w pięciu mililitrach minimalnego podłoża, które selekcjonuje komórki, zawierające cząsteczki plazmidu. Umieść probówkę w nachylonym rotatorze i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego dnia. Zmierz gęstość optyczną kultur nocnych, a następnie wyrównaj stężenie komórek dla wszystkich komórek, rozcieńczając każdą kulturę do OD 600 0,2 za pomocą świeżych pożywek i sterylnych pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra.Aby rozpocząć główne badanie, należy ustawić matrycę serii sześciokrotnych rozcieńczeń, najpierw przenosząc 200 mikrolitrów każdego wstępnie rozcieńczonego szczepu, zaczynając od OD 600 0,2 do wyznaczonych studzienek w pierwszej kolumnie sterylnej płytki 96-dołkowej w ramach przygotowań do kolejnych rozcieńczeń, użyć pipety wielokanałowej, aby dodać 125 mikrolitrów sterylnej wody do pustych studzienek w kolumnach drugich, trzy i cztery. Następnie przenieś 25 mikrolitrów drożdży z kolumny pierwszej do kolumny drugiej, kilka razy pipetuj w górę iw dół, aby równomiernie wymieszać komórki i przystąp do przenoszenia 25 mikrolitrów komórek z kolumny drugiej do kolumny trzeciej. Powtarzać etapy seryjnego rozcieńczania, aż studzienki w kolumnie czwartej zostaną dobrze wymieszane jako wizualna pomoc w wykrywaniu komórek.Wydrukować szablon siatki i przykleić go taśmą po wewnętrznej stronie pokrywy szalki Petriego, zaczynając od najmniej skoncentrowanej kolumny w matrycy rozcieńczania szeregowego. Przenieś cztery mikrolitry komórek z każdej kolumny. Na 96-dołkowej płytce na kontrolnej minimalnej pożywce na płytce agarowej, która wybiera do wewnątrzkomórkowego utrzymania plazmidu Umieść kolejne cztery mikrolitry komórek z każdej kolumny na oddzielnej, minimalnej pożywce na płytce agarowej, która wybiera oba plazmidy wewnątrzkomórkowe.Utrzymanie i ekspresja niestabilnego białka fuzyjnego. Pozostaw obie płytki do wyschnięcia na ławce przez pięć do 10 minut. Uszczelnij pokrywki za pomocą param, aby zapobiec odwodnieniu i inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do sześciu dni.Gdy rodziny pojczyste z najszybciej rosnącej kultury po raz pierwszy staną się widoczne w najbardziej rozcieńczonym miejscu na danej płytce, wyjmij płytkę z inkubatora i udokumentuj zakres wzrostu. Robiąc zdjęcia, może być konieczne zrobienie zdjęć różnych tablic rejestracyjnych w różnych dniach lub tej samej tablicy w wielu dniach. W przypadku różnych szczepów drożdży, które wykazują szeroki zakres tempa wzrostu, tak biochemicznie potwierdzono, że gen zidentyfikowany w teście wzrostu reguluje obfitość białek, zacznij od przekształcenia dzikich i zmutowanych szczepów drożdży za pomocą plazmidu kodującego wyżej wymienione białko fuzyjne, zaszczep transformanty w pięciu mililitrach minimalnej pożywki, która selekcjonuje do utrzymania plazmidu wewnątrzkomórkowego i inkubuj probówki przez noc w rotatorze nachylonym do 30 stopni Celsjusza.Następnego dnia zmierz gęstość optyczną w temperaturze 600 dla każdej nocnej hodowli. Gdy wszystkie szczepy osiągną OD 600 0,4 lub więcej, rozcieńczyć wszystkie kultury z powrotem do 0,2 za pomocą świeżej pożywki, tak aby końcowa objętość dla każdego szczepu wynosiła 10 mililitrów. Inkubować komórki na wytrząsarce platformowej o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż wszystkie kultury osiągną średni wzrost w fazie logarytmicznej OD 600, między 0,8 a 1,2.Zbierz komórkę, przenosząc 2,5 całkowitej jednostki OD komórek do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut i usunąć supernatant S. Następnie dodaj jeden mililitr wody destylowanej, wiruj lub pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić podniebienie i przenieść zawiesinę komórkową do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Izolować komórki za pomocą drugiego wirowania przez 30 sekund W temperaturze pokojowej usunąć snat i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach wody destylowanej. Dodaj 100 mikrolitrów 0,2 molowego wodorotlenku sodu do zawiesiny komórek, kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uniknąć przedwczesnej lizy komórek. Nie wiruj komórek.Ponownie odizolować komórki za pomocą trzeciego wirowania przez 30 sekund. W temperaturze pokojowej usuń supernatanty z komórek i lizuje komórki przez resus, zawieszając osad w 50 do 100 mikrolitrach jednego x lamby bufor próbki, denaturować wszystkie białka przez inkubację zawiesiny w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić lizat całego ogniwa na lodzie przez pięć minut. Aby oznaczyć obfitość białek podatnych na agregację, takich jak białka z kilkoma segmentami transbłonowymi, empirycznie określ optymalną inkubację, temperaturę i czas denaturacji, zaczynając od 70 stopni Celsjusza przez 10 minut zamiast 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Na koniec wyizolować frakcję rozpuszczalną, odwirowując lizat przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, przenieść snat do świeżej probówki i wyrzucić nierozpuszczalną frakcję granulek. Frakcja rozpuszczalna może być teraz ładowana bezpośrednio na stronę karty charakterystyki, żelowana lub przechowywana w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza podczas tworzenia testu degradacji białek opartego na wzroście drożdży. Niestabilne białko potrójnej fuzji jest połączone z dodatkowym enzymem metabolicznym, który uzupełnia tło szczepu drożdży pozbawionego tego samego genu metabolicznego.Kiedy białko fuzyjne ulega ekspresji w drożdżach, jest podatne na jałowe zdarzenia translokacji w błonie retikulum endoplazmatycznego. Ta nieprawidłowa translokacja wyzwala degradację całego białka, w tym enzymu metabolicznego, za pośrednictwem ubikwityny, zapobiegając w ten sposób proliferacji komórek. Jednak w szczepach drożdży pozbawionych ligazy ubikwityny białko fuzyjne jest chronione przed degradacją, nawet przy średniej translokacji umożliwiającej namnażanie się komórek.Dlatego w obecności ligazy ubikwityny istnieje zgodność między degradacją białek zachodzącą wewnątrz komórek a niezdolnością komórek drożdży do proliferacji na płytkach agarowych zubożonych w metabolity. Z drugiej strony, w kontekście wadliwej lub nieobecnej ligazy ubikwityny, proliferacja komórek wskazuje, że białko fuzyjne było chronione przed degradacją w celu zmniejszenia tła lub fałszywego wzrostu i zwiększenia rygorystyczności tego testu. Konkurencyjne inhibitory enzymu metabolicznego mogą być dodawane do pożywki wzrostowej w celu potwierdzenia wyników zaobserwowanych w teście wzrostu drożdży.Bezpośrednie dowody na degradację białka fuzyjnego można również ustalić za pomocą western blot. W obecności lub braku ligazy ubikwityny białko fuzyjne zostanie odpowiednio zdegradowane lub oszczędzone przed zniszczeniem. Ważne jest, aby pamiętać, że procedury te informują najbardziej bezpośrednio o obfitości białka w stanie stacjonarnym.Po przeprowadzeniu tych procedur można przeprowadzić analizy impulsów lub pościgu cykloheksymidu w celu bezpośredniej analizy kinetyki degradacji białek i obecności mutacji, które zwiększają poziomy białek w stanie badania.

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie oparte na wzroście i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dla degradacji białek w Saccharomyces cerevisiae

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Obfitość białek odzwierciedla tempo zarówno syntezy białek, jak i ich degradacji. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, po którym następuje western blot, do analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące).

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj metodę oznaczania wzrostowego i ekstrakcji białek do analizy degradacji w Saccharomyces cerevisiae. Technika umożliwia szybkie określenie wymagań genetycznych dla stabilności białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów