Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie określenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji niestabilnego białka w Croce Visier. Osiąga się to poprzez fuzję enzymu reporterowego wymaganego do wzrostu w określonych warunkach selektywnych z niestabilnym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie komórki typu dzikiego lub zmutowane, obie wyrażające białko fuzyjne, są hodowane na selektywnych płytkach agarowych z pożywką.

Test posiewu zapewnia wygodny wskaźnik stabilizacji białka na podstawie wzrostu komórek drożdży w celu biochemicznie potwierdzonych różnic w obfitości białek, podczas gdy typ zmutowanych komórek zawierających białko fuzyjne jest lizowany za pomocą szybkiej, nieefektywnej metody ekstrakcji białek do analizy Western blot. Wyniki pokazują, że obfitość niestabilnego białka wzrasta w komórkach z mutacją w genie niezbędnym do degradacji. Odwrotna sytuacja jest prawdziwa w przypadku degradacji kompetentnych szczepów typu dzikiego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza pulse chase i Cycl heide chase, jest to, że jest mniej pracochłonna i czasochłonna, co pozwala na szybkie i wysokoprzepustowe określenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat wymagań dotyczących degradacji szeregu niestabilnych białek. Może być również używany do identyfikacji regulatorów innych aspektów ekspresji genów, takich jak transkrypcja i translacja.

Procedury zademonstrują Sheldon Watts i Justin Crowder. Studenci w moim laboratorium: Przed testem przekształć plazmid kodujący białko fuzyjne składające się z niestabilnego białka i metabolicznego enzymu reporterowego w zmutowany szczep drożdży. Podejrzewa się, że ma wady genetyczne związane z regulacją degradacji białka jako kontrolę, przekształć również ten sam plazmid w dziki szczep drożdży.

Zaszczepić transformanty w pięciu mililitrach minimalnego podłoża, które selekcjonuje komórki, zawierające cząsteczki plazmidu. Umieść probówkę w nachylonym rotatorze i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego dnia. Zmierz gęstość optyczną kultur nocnych, a następnie wyrównaj stężenie komórek dla wszystkich komórek, rozcieńczając każdą kulturę do OD 600 0,2 za pomocą świeżych pożywek i sterylnych pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra.

Aby rozpocząć główne badanie, należy ustawić matrycę serii sześciokrotnych rozcieńczeń, najpierw przenosząc 200 mikrolitrów każdego wstępnie rozcieńczonego szczepu, zaczynając od OD 600 0,2 do wyznaczonych studzienek w pierwszej kolumnie sterylnej płytki 96-dołkowej w ramach przygotowań do kolejnych rozcieńczeń, użyć pipety wielokanałowej, aby dodać 125 mikrolitrów sterylnej wody do pustych studzienek w kolumnach drugich, trzy i cztery. Następnie przenieś 25 mikrolitrów drożdży z kolumny pierwszej do kolumny drugiej, kilka razy pipetuj w górę iw dół, aby równomiernie wymieszać komórki i przystąp do przenoszenia 25 mikrolitrów komórek z kolumny drugiej do kolumny trzeciej. Powtarzać etapy seryjnego rozcieńczania, aż studzienki w kolumnie czwartej zostaną dobrze wymieszane jako wizualna pomoc w wykrywaniu komórek.

Wydrukować szablon siatki i przykleić go taśmą po wewnętrznej stronie pokrywy szalki Petriego, zaczynając od najmniej skoncentrowanej kolumny w matrycy rozcieńczania szeregowego. Przenieś cztery mikrolitry komórek z każdej kolumny. Na 96-dołkowej płytce na kontrolnej minimalnej pożywce na płytce agarowej, która wybiera do wewnątrzkomórkowego utrzymania plazmidu Umieść kolejne cztery mikrolitry komórek z każdej kolumny na oddzielnej, minimalnej pożywce na płytce agarowej, która wybiera oba plazmidy wewnątrzkomórkowe.

Utrzymanie i ekspresja niestabilnego białka fuzyjnego. Pozostaw obie płytki do wyschnięcia na ławce przez pięć do 10 minut. Uszczelnij pokrywki za pomocą param, aby zapobiec odwodnieniu i inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do sześciu dni.

Gdy rodziny pojczyste z najszybciej rosnącej kultury po raz pierwszy staną się widoczne w najbardziej rozcieńczonym miejscu na danej płytce, wyjmij płytkę z inkubatora i udokumentuj zakres wzrostu. Robiąc zdjęcia, może być konieczne zrobienie zdjęć różnych tablic rejestracyjnych w różnych dniach lub tej samej tablicy w wielu dniach. W przypadku różnych szczepów drożdży, które wykazują szeroki zakres tempa wzrostu, tak biochemicznie potwierdzono, że gen zidentyfikowany w teście wzrostu reguluje obfitość białek, zacznij od przekształcenia dzikich i zmutowanych szczepów drożdży za pomocą plazmidu kodującego wyżej wymienione białko fuzyjne, zaszczep transformanty w pięciu mililitrach minimalnej pożywki, która selekcjonuje do utrzymania plazmidu wewnątrzkomórkowego i inkubuj probówki przez noc w rotatorze nachylonym do 30 stopni Celsjusza.

Następnego dnia zmierz gęstość optyczną w temperaturze 600 dla każdej nocnej hodowli. Gdy wszystkie szczepy osiągną OD 600 0,4 lub więcej, rozcieńczyć wszystkie kultury z powrotem do 0,2 za pomocą świeżej pożywki, tak aby końcowa objętość dla każdego szczepu wynosiła 10 mililitrów. Inkubować komórki na wytrząsarce platformowej o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż wszystkie kultury osiągną średni wzrost w fazie logarytmicznej OD 600, między 0,8 a 1,2.

Zbierz komórkę, przenosząc 2,5 całkowitej jednostki OD komórek do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut i usunąć supernatant S. Następnie dodaj jeden mililitr wody destylowanej, wiruj lub pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić podniebienie i przenieść zawiesinę komórkową do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Izolować komórki za pomocą drugiego wirowania przez 30 sekund W temperaturze pokojowej usunąć snat i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach wody destylowanej. Dodaj 100 mikrolitrów 0,2 molowego wodorotlenku sodu do zawiesiny komórek, kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uniknąć przedwczesnej lizy komórek. Nie wiruj komórek.

Ponownie odizolować komórki za pomocą trzeciego wirowania przez 30 sekund. W temperaturze pokojowej usuń supernatanty z komórek i lizuje komórki przez resus, zawieszając osad w 50 do 100 mikrolitrach jednego x lamby bufor próbki, denaturować wszystkie białka przez inkubację zawiesiny w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić lizat całego ogniwa na lodzie przez pięć minut. Aby oznaczyć obfitość białek podatnych na agregację, takich jak białka z kilkoma segmentami transbłonowymi, empirycznie określ optymalną inkubację, temperaturę i czas denaturacji, zaczynając od 70 stopni Celsjusza przez 10 minut zamiast 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Na koniec wyizolować frakcję rozpuszczalną, odwirowując lizat przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, przenieść snat do świeżej probówki i wyrzucić nierozpuszczalną frakcję granulek. Frakcja rozpuszczalna może być teraz ładowana bezpośrednio na stronę karty charakterystyki, żelowana lub przechowywana w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza podczas tworzenia testu degradacji białek opartego na wzroście drożdży. Niestabilne białko potrójnej fuzji jest połączone z dodatkowym enzymem metabolicznym, który uzupełnia tło szczepu drożdży pozbawionego tego samego genu metabolicznego.

Kiedy białko fuzyjne ulega ekspresji w drożdżach, jest podatne na jałowe zdarzenia translokacji w błonie retikulum endoplazmatycznego. Ta nieprawidłowa translokacja wyzwala degradację całego białka, w tym enzymu metabolicznego, za pośrednictwem ubikwityny, zapobiegając w ten sposób proliferacji komórek. Jednak w szczepach drożdży pozbawionych ligazy ubikwityny białko fuzyjne jest chronione przed degradacją, nawet przy średniej translokacji umożliwiającej namnażanie się komórek.

Dlatego w obecności ligazy ubikwityny istnieje zgodność między degradacją białek zachodzącą wewnątrz komórek a niezdolnością komórek drożdży do proliferacji na płytkach agarowych zubożonych w metabolity. Z drugiej strony, w kontekście wadliwej lub nieobecnej ligazy ubikwityny, proliferacja komórek wskazuje, że białko fuzyjne było chronione przed degradacją w celu zmniejszenia tła lub fałszywego wzrostu i zwiększenia rygorystyczności tego testu. Konkurencyjne inhibitory enzymu metabolicznego mogą być dodawane do pożywki wzrostowej w celu potwierdzenia wyników zaobserwowanych w teście wzrostu drożdży.

Bezpośrednie dowody na degradację białka fuzyjnego można również ustalić za pomocą western blot. W obecności lub braku ligazy ubikwityny białko fuzyjne zostanie odpowiednio zdegradowane lub oszczędzone przed zniszczeniem. Ważne jest, aby pamiętać, że procedury te informują najbardziej bezpośrednio o obfitości białka w stanie stacjonarnym.

Po przeprowadzeniu tych procedur można przeprowadzić analizy impulsów lub pościgu cykloheksymidu w celu bezpośredniej analizy kinetyki degradacji białek i obecności mutacji, które zwiększają poziomy białek w stanie badania.