Name: Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich przy użyciu ryby modelowej. To podejście dostarcza eksperymentalnych dowodów na ekologiczne role związków chemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Maedzie i Aaronowi Cooke'owi za pomoc w kręceniu i montażu tego filmu. Finansowanie zostało zapewnione przez National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

UWAGA: Krok 3 tego protokołu dotyczy tematów na kręgowcach. Procedura została opracowana w taki sposób, aby zwierzęta były traktowane w możliwie najbardziej humanitarny sposób i została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Wilmington.
1) Ekstrakcja tkanek
<ol>
	<li>Używaj tkanki, która jest w naturalnym stanie nawodnienia i nie jest ściśnięta, wysuszona lub nadmiernie mokra, ponieważ zmieni to stężenie objętościowe metabolitów wtórnych. Pokrój lub posiekaj tkankę na kawałki lub plasterki, które można włożyć do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Uwaga: W niektórych przypadkach można użyć świeżej tkanki, ale często lepiej jest pokroić lub posiekać zamrożoną tkankę, która nie jest poddawana ściskaniu podczas krojenia.</li>
	<li>Dodać kawałki tkanek do 30 ml mieszaniny dichlorometanu (DCM) i metanolu (MeOH) w proporcji 1:1 w wyskalowanej probówce wirówkowej, aż do osiągnięcia końcowej objętości 40 ml. Należy pamiętać o wykonaniu wszystkich czynności związanych z przenoszeniem rozpuszczalnika w dygestoriach z odpowiednią wentylacją.</li>
	<li>Zakryj probówkę i odwróć ją kilka razy, a następnie kilkakrotnie mieszaj podczas 4-godzinnego okresu ekstrakcji. Uwaga: W tym okresie woda łączy się z MeOH i powstała faza MeOH:woda oddziela się od fazy DCM. Tkanka jest na przemian poddawana działaniu DCM i MeOH: wody jako emulsji podczas mieszania probówek.</li>
	<li>Przenieść ekstrakt DCM do kolby okrągłodennej i odparować do sucha na wyparce obrotowej na małym ogniu (<40 °C). Używając minimalnej ilości rozpuszczalnika, przenieść wysuszony ekstrakt do 20 ml fiolki scyntylacyjnej. Wyposażyć fiolkę w adapter wyparki obrotowej i ponownie odparować do sucha na wyparce obrotowej przy użyciu małego ciepła (<40 °C). 
	Uwaga: Następny krok wymaga użycia domowego przyrządu zaciskowego, który można zmontować, przykręcając następujące elementy w kolejności sekwencyjnej na końcu pręta gwintowanego: (1) nakrętka, (2) podkładka i (3) nakrętka żołędziowa. Myjka musi być perforowana lub zamontowana w taki sposób, aby była mniejsza niż średnica wewnętrzna probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wracając do wyskalowanej probówki wirówkowej, która zawiera tkankę i ekstrakt MeOH:water, wyciśnij pożywkę ekstrakcyjną z tkanki poprzez kompresję. Przenieść ekstrakt wodny MeOH:do tej samej kolby okrągłodennej i przechowywać w stanie schłodzonym (<10 °C).</li>
	<li>Dodać MeOH do wyskalowanej probówki wirówkowej, aż odwodniona tkanka zostanie zanurzona w celu drugiej ekstrakcji trwającej od 2 do 6 godzin, a następnie przenieść nowy ekstrakt MeOH do schłodzonej kolby okrągłodennej zawierającej ekstrakt MeOH: woda. Jeśli istnieje obawa, że tkanka nie została w pełni wyekstrahowana, powtórz ekstrakcję MeOH trwającą od 2 do 6 godzin.</li>
	<li>Wysuszyć MeOH na wyparce obrotowej na małym ogniu (<40 °C). Przenieść pozostały ekstrakt wodny z kolby okrągłodennej do fiolki scyntylacyjnej zawierającej wysuszony ekstrakt niepolarny, używając minimalnej objętości MeOH do przepłukania kolby okrągłodennej.</li>
	<li>Odparować ekstrakt wodny do sucha na małym ogniu (<40 °C) na koncentratorze próżniowym. Fiolka scyntylacyjna zawiera teraz całkowity suchy surowy ekstrakt organiczny z 10 ml tkanki. Opróżnić przestrzeń nad fiolką za pomocą gazuN2, aby zapobiec utlenianiu, szczelnie zamknąć i przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C).</li>
</ol>
2) Przygotowanie posiłków
<ol>
	<li>Przygotuj liofilizowany proszek z kalmarów. 
	Uwaga: Płaszcz kałamarnicy stanowi źródło składników odżywczych, które jest porównywalne z innymi bezkręgowcami bentosowymi i będzie stosowany jako składnik w podetapach ppkt 2.2.
	<ol>
		<li>Rozmrozić zamrożone krążki płaszcza kałamarnicy w ciepłej wodzie dejonizowanej (DI), a następnie zmiksować je w blenderze wysokoobrotowym.</li>
		<li>Wylej cienką warstwę puree z kalmarów na płytką blachę do ciastek i zamroź (-20 °C), a następnie połam arkusz mrożonego puree z kalmarów na małe kawałki, które mają być liofilizowane.</li>
		<li>Liofilizować zamrożone puree z płaszcza kalmarów zgodnie z procedurami operacyjnymi liofilizatora.</li>
		<li>Sproszkowaj liofilizowane kawałki puree z płaszcza kalmarów w blenderze wysokoobrotowym, aby uzyskać proszek.</li>
		<li>W dygestorium wlej sproszkowany płaszcz kalmara do obrotowego przesiewacza mąki i przesiej w celu oddzielenia dużych kawałków tkanki od drobnego proszku.</li>
		<li>Przenieś drobno sproszkowany płaszcz kałamarnicy do zamykanego pojemnika. Opróżnić przestrzeń nad zbiornikiem za pomocą gazuN2, aby zapobiec utlenianiu i przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę spożywczą. 
	Uwaga: W przypadku przeprowadzania wielu kolejnych testów praktyczne jest przygotowanie ~100 ml mieszanki spożywczej, jednak w razie potrzeby przepis ten można przeskalować do mniejszych objętości.
	<ol>
		<li>W zlewce o pojemności 150 ml połącz mieszaninę 3 g kwasu alginowego i 5 g liofilizowanego proszku z płaszcza kalmarów ze 100 ml wody demineralizowanej. Mieszaj energicznie mikroszpatułką przez kilka minut, aż proszek zostanie całkowicie uwodniony, a mieszanina będzie jednorodna. 
		Uwaga: W razie potrzeby na tym etapie można dodać barwnik spożywczy: łatwiej jest dodać barwnik do mieszanki spożywczej, która wytworzy mieszaniny zarówno poddane działaniu środka, jak i kontrolne (maskując naturalny pigment ekstraktu w mieszaninie poddanej działaniu ekstraktu), niż próbować dopasować kolor mieszaniny poddanej działaniu ekstraktu poprzez dodanie barwnika do mieszaniny kontrolnej. Zielonkawy lub brązowawy barwnik spożywczy jest często pożądany, aby zamaskować wszelkie pigmenty w surowym ekstrakcie.</li>
		<li>Załadować dokładnie 10 ml mieszanki spożywczej do strzykawki z podziałką. Uważaj, aby podczas tego procesu nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Wyjąć z zamrażarki 20 ml fiolkę scyntylacyjną z suchym surowym ekstraktem organicznym. Dodaj kroplę lub dwie MeOH, a następnie wymieszaj ekstrakt z jednorodną mieszaniną za pomocą mikroszpatułki.</li>
		<li>Wyrzuć załadowaną strzykawkę o pojemności 10 ml z matrycą spożywczą do 20 ml fiolki scyntylacyjnej i wymieszaj mikroszpatułką w celu homogenizacji mieszaniny żywności poddanej działaniu ekstraktu. 
		Uwaga: Pomocne może być wyrzucanie strzykawki w mniejszych odstępach (tj. wysunięcie 2 ml i homogenizacja, a następnie powtarzanie do momentu, aż wszystkie 10 ml zostanie zhomogenizowane).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj granulki testowe.
	<ol>
		<li>Załadować bardzo małą objętość mieszaniny ekstraktu (~1 ml) do strzykawki i zanurzyć końcówkę strzykawki w roztworze 0,25 M CaCl2. Wysunąć zawartość strzykawki, aby utworzyć długie, przypominające spaghetti pasmo.</li>
		<li>Po kilku minutach usuń stwardniałe pasmo, posiekaj je na 4 mm granulki na szklanej desce do krojenia za pomocą żyletki, a następnie spłucz w wodzie morskiej.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.1 i 2.3.2 bez dodawania ekstraktu tkankowego w celu wytworzenia osadów kontrolnych. Należy upewnić się, że granulki kontrolne są traktowane równoważną objętością rozpuszczalnika (patrz dodanie MeOH do mieszaniny poddanej działaniu substancji w kroku 2.2.3) w celu kontroli dodania rozpuszczalnika. Jeżeli pożądana jest kontrola ujemna w celu potwierdzenia, że badane ryby można zniechęcić do karmienia, należy dodać benzoesan denatonium w stężeniu 2 mg ml-1 do mieszanki surowej żywności27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3) Testy biologiczne smakowitości
<ol>
	<li>Przeprowadzić testy żerowania z dziko odławianym wargaczem błękitnogłowym w fazie żółtej, Thalassoma bifasciatum, trzymanym w grupach po trzy w nieprzezroczystych przedziałach akwariów laboratoryjnych.</li>
	<li>Dostarczaj granulki spożywcze ze zlewki z wodą morską za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką. Uwaga: Wyszkolenie ryb w przyjmowaniu pokarmu w ten sposób może zająć kilka dni. Bodziec kondycjonujący (np. kilka stuknięć pipetą w szybę akwarium), który poprzedza dostarczenie pokarmu, może być pomocny w szkoleniu ryb, aby oczekiwały dodania granulek pokarmu.</li>
	<li>Punktowanie śrutu. Rozważ przyjęcie granulki, jeśli jest łatwo spożywane przez ryby. Rozważ odrzucenie wypluwki, jeśli nie została zjedzona po co najmniej trzech próbach przyjęcia jej do jamy ustnej przez jedną lub więcej ryb, lub jeśli po jednej takiej próbie zbliży się do wypluwki i ją zignoruje.</li>
	<li>Ocenianie próbek. Uwaga: Procedura oznaczania jest przedstawiona jako schemat blokowy na rysunku 1. Grupy ryb, które odmawiają jedzenia granulek kontrolnych na którymkolwiek etapie protokołu, nie są dalej brane pod uwagę. Istnieją dwa potencjalne wyniki pojedynczej serii testu: próbka jest akceptowana lub odrzucana.
	<ol>
		<li>Zacznij od osadu kontrolnego, aby potwierdzić, że grupa ryb jest chętna do współpracy. Zaoferuj przetworzony granul. Jeśli ryba zaakceptuje poddane działaniu środka osady, należy ocenić próbkę jako zaakceptowaną. Jeśli ryba odrzuci poddane działaniu środka osady, należy podać kolejną osadkę kontrolną w celu ustalenia, czy ryby przestały żerować. Jeśli ryby zaakceptują kolejny osad kontrolny, należy ocenić próbkę jako odrzuconą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>replikacja. Powtórzyć procedurę oznaczania z dziesięcioma niezależnymi grupami ryb dla każdego ekstraktu.</li>
</ol>
4) Ocena istotności
<ol>
	<li>Oceń znaczenie różnic w zużyciu kontrolnych i poddanych działaniu substancji peletów za pomocą zmodyfikowanej wersji dokładnego testu Fishera26. Zmodyfikować badanie w taki sposób, aby sumy brzeżne dla osadów kontrolnych i poddanych działaniu środka były ustalone, traktując je jako próbki losowe. Uwaga: Daje to p = 0,057, gdy zjedzonych zostanie 7 granulek; W związku z tym każdy ekstrakt jest uważany za odstraszający, jeśli zje się 6 lub mniej granulek, i smaczny, jeśli zje się 7 lub więcej granulek.</li>
	<li>Aby porównać względną smakowitość między grupami ekstraktów, oblicz średnią liczbę granulek spożywanych w każdej grupie. Utrzymuj próg na poziomie 6 granulek, tak aby grupa powtórzonych ekstraktów była uważana za odstraszającą, jeśli średnia liczba zjedzonych granulek + błąd standardowy (SE) ≤6. Uwaga: W reprezentatywnych wynikach przypisanie do grupy to gatunki, więc ekstrakty replikowane pochodzą od różnych osobników, a względna smakowitość może być porównana między gatunkami.</li>
</ol>

<ol><li>Paul, V. J., ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaul%2C+VJ+%22Ecological+roles+of+marine+natural+products%22">Ecological roles of marine natural products</a>. , Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).</li>
<li>Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate chemical defenses.</a> Chemical Reviews. 93 (5), 1911(1993).</li>
<li>Hay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+chemical+ecology%3A+what%27s+known+and+what%27s+next%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Marine chemical ecology: what's known and what's next.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44 (5), 476-476 (1996).</li>
<li>McClintock, J. B., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcClintock%2C+JB+%22Marine+Chemical+Ecology%22">Marine Chemical Ecology</a>. , CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).</li>
<li>Amsler, C. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmsler%2C+CD+%22Algal+Chemical+Ecology%22">Algal Chemical Ecology</a>. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Hay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+chemical+ecology%3A+Chemical+signals+and+cues+structure+marine+populations%2C+communities%2C+and+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems.</a> Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).</li>
<li>Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+ecology+of+sponges+on+Caribbean+reefs%3A+Natural+products+shape+natural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems.</a> BioScience. 61 (11), 888(2011).</li>
<li>Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipredatory+Defensive+Roles+of+Natural+Products+from+Marine+Invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Marine+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates.</a> Handbook of Marine Natural Products. , 677-710 (2012).</li>
<li>Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+Chemical+Ecology%3A+A+Science+Born+of+Scuba.+%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Discoveries%3A+The+Revolution+of+Science+through+Scuba%22%5BJournal%5D)">Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. </a> Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).</li>
<li>Randall, J. E., Hartman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sponge-feeding+fishes+of+the+West+Indies%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Sponge-feeding fishes of the West Indies.</a> Marine Biology. 1, 216-225 (1968).</li>
<li>Bakus, G. J., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+in+sponges+and+holothurians+%E2%80%94+geographic+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern.</a> Science. 185, 951-953 (1974).</li>
<li>Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+predatory+reef+fish.+1.+Chemical+deterrency%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency.</a> Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).</li>
<li>Schulte, B. A., Bakus, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+deterrence+in+marine+sponges+%E2%80%94+laboratory+versus+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies.</a> Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).</li>
<li>Jackson, J. B. C., Buss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathy+and+spatial+competition+among+coral+reef+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).</li>
<li>Bakus, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+defense+mechanisms+on+the+great+barrier+reef%5BTitle%5D)+AND+%22Australia.+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical defense mechanisms on the great barrier reef.</a> Australia. Science. 211, 497-499 (1981).</li>
<li>Gemballa, S., Schermutzki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+haplosclerid+sponges+preferred%3A+a+field+study+on+the+diet+of+the+dotted+sea+slug+Peltodoris+atromaculata+%28doridoidea%3A+nudibranchia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia).</a> Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).</li>
<li>Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+species+traits+to+environmental+variables+in+Indonesian+coral+reef+sponge+assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+and+Freshwater+Research%22%5BJournal%5D)">Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages.</a> Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).</li>
<li>Mollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+promoting+marine+invasions%3A+a+chemolecological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).</li>
<li>Randall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+habits+of+reef+fishes+of+the+West+Indies%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Tropical+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Food habits of reef fishes of the West Indies.</a> Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).</li>
<li>O'Neal, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reappraisal+of+the+chemical+and+physical+defenses+of+Caribbean+gorgonian+corals+against+predatory+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes.</a> Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).</li>
<li>Hines, D. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+antipredatory+defensive+strategies+of+Caribbean+non-scleractinian+zoantharians+%28Cnidaria%29%3A+is+the+sting+the+only+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing.</a> Marine Biology. 159 (2), 389-398 (2012).</li>
<li>Walters, K. D., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+trade-off+between+wound-healing+and+chemical+defenses+among+Caribbean+reef+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges.</a> Integrative and Comparative Biology. 45 (2), 352-358 (2005).</li>
<li>Leong, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+resource+trade-off+between+growth+and+chemical+defenses+among+Caribbean+coral+reef+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges.</a> Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).</li>
<li>Leong, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+reproductive+patterns+among+7+Caribbean+sponge+species+does+not+reveal+a+resource+trade-off+with+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401 (1-2), 80-84 (2011).</li>
<li>Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sponge+Communities+on+Caribbean+Coral+Reefs+Are+Structured+by+Factors+That+Are+Top-Down%2C+Not+Bottom-Up%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up.</a> PLoS ONE. 8 (5), e62573(2013).</li>
<li>Loh, T. -L., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+defenses+and+resource+trade-offs+structure+sponge+communities+on+Caribbean+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).</li>
<li>Miller, A. M., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+coral+reef+fish+learn+to+avoid+unpalatable+prey+using+visual+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues.</a> Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).</li>
<li>Pawlik, J. R., Fenical, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+re-evaluation+of+the+ichthyodeterrent+role+of+prostaglandins+in+the+Caribbean+gorgonian+coral%2C+Plexaura+homomalla%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla.</a> Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).</li>
<li>Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+properties+of+secondary+metabolites+from+the+Caribbean+gorgonian+coral+Erythropodium+caribaeorum%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum.</a> Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).</li>
<li>Pawlik, J. R., Fenical, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+defense+of+Pterogorgia+anceps%2C+a+Caribbean+gorgonian+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral.</a> Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).</li>
<li>Chanas, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+skeleton+of+a+sponge+provide+a+defense+against+predatory+reef+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish.</a> Oecologia. 107 (2), 225-231 (1996).</li>
<li>Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+defense+of+the+Caribbean+sponge+Agelas+clathrodes+%28Schmidt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt).</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208 (1-2), 185-196 (1997).</li>
<li>Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+defense+of+the+Caribbean+reef+sponge+Axinella+corrugata+against+predatory+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes.</a> Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).</li>
<li>Chanas, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+predatory+reef+fish+II.+Spicules%2C+tissue+toughness%2C+and+nutritional+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality.</a> Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).</li>
<li>Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphitoxin%2C+a+new+high+molecular+weight+antifeedant+pyridinium+salt+from+the+Caribbean+sponge+Amphimedon+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa.</a> Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).</li>
<li>Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).</li>
<li>Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antifeedant+triterpene+glycosides+from+the+Caribbean+sponge+Erylus+Formosus%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Letters%22%5BJournal%5D)">New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus.</a> Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).</li>
<li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
<li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li>
<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana w niniejszym dokumencie procedura zapewnia stosunkowo prosty, ekologicznie istotny protokół laboratoryjny do oceny przeciwdrapieżnej obrony chemicznej organizmów morskich. Poniżej dokonujemy przeglądu ważnych kryteriów, które są spełnione przez ten zestaw metod:
(1) Odpowiedni drapieżnik. W tym teście żerowania wykorzystuje wargacza błękitnogłowego, Thalassoma bifasciatum, jedną z najliczniejszych ryb na rafach koralowych na Karaibach. Bluehead jest ogólnym mięsożercą...

Ekologia chemiczna opracowana dzięki współpracy chemików i ekologów. Podczas gdy subdyscyplina lądowej ekologii chemicznej istnieje już od jakiegoś czasu, morska ekologia chemiczna ma zaledwie kilka dekad, ale dostarczyła ważnych informacji na temat ekologii ewolucyjnej i struktury społeczności organizmów morskich1-8. Korzystając z nowych technologii nurkowania z akwalungiem i spektroskopii NMR, chemicy organiczni szybko stworzyli dużą liczbę publikacji opisujących nowe metabolity z bentosowych bezkręgowców morskich i glonów w latach siedemdziesiątych iosiemdziesiątych XX wieku. Zakładając, że metabolity wtórne muszą służyć jakiemuś celowi, wiele z tych publikacji przypisywało ekologicznie ważne właściwości nowym związkom bez dowodów empirycznych. Mniej więcej w tym samym czasie ekolodzy wykorzystali również pojawienie się nurkowania z akwalungiem i opisali rozmieszczenie i liczebność zwierząt i roślin bentosowych, znanych wcześniej ze stosunkowo nieskutecznych metod pobierania próbek, takich jak pogłębianie. Założeniem tych badaczy było to, że wszystko, co jest siedzące i miękkie, musi być chemicznie bronione, aby uniknąć konsumpcji przezdrapieżniki. Starając się wprowadzić empiryzm do tego, co skądinąd było opisową pracą na temat liczebności gatunków, niektórzy ekolodzy zaczęli ekstrapolować obronę chemiczną napodstawie testów toksyczności. Większość testów toksyczności obejmowała narażenie całych ryb lub innych organizmów na wodne zawiesiny surowych ekstraktów organicznych z tkanek bezkręgowców, a następnie określenie stężeń suchej masy ekstraktów odpowiedzialnych za zabicie połowy badanych organizmów. Jednak testy toksyczności nie naśladują sposobu, w jaki potencjalne drapieżniki postrzegają zdobycz w warunkach naturalnych, a późniejsze badania nie wykazały związku między toksycznością a smakowitością12-13. Zaskakujące jest to, że w publikacjach w prestiżowych czasopismach stosowano techniki mające niewielkie lub żadne znaczenie ekologiczne14-15 i że badania te są nadal szeroko cytowane. Jeszcze bardziej niepokojące jest to, że badania oparte na danych dotyczących toksyczności są nadal publikowane16-18. Opisana w niniejszym dokumencie metoda testu biologicznego została opracowana pod koniec lat 80. XX wieku, aby zapewnić ekologom morskim podejście do oceny ochrony chemicznej przed drapieżnikami. Metoda wymaga, aby modelowy drapieżnik pobierał próbki surowego ekstraktu organicznego z organizmu docelowego w naturalnym stężeniu w matrycy pokarmowej porównywalnej pod względem odżywczym, dostarczając danych dotyczących smakowitości, które są bardziej znaczące ekologicznie niż dane dotyczące toksyczności.
Ogólne podejście do oceny aktywności przeciwdrapieżnej tkanek organizmów morskich obejmuje cztery ważne kryteria: (1) odpowiedni ogólny drapieżnik musi być użyty w testach żywieniowych, (2) organiczne metabolity wszystkich polarności muszą być wyczerpująco wyekstrahowane z tkanki organizmu docelowego, (3) metabolity muszą być zmieszane z odpowiednim pod względem odżywczym eksperymentalnym pokarmem o tym samym stężeniu objętościowym, jakie występuje w organizmie, z którego pochodzą. zostały wyodrębnione, oraz (4) projekt eksperymentalny i podejście statystyczne muszą dostarczyć miarodajnej metryki wskazującej na względną niesmak.
Procedura opisana poniżej została zaprojektowana specjalnie do oceny obrony chemicznej przeciwdrapieżnych u karaibskich bezkręgowców morskich. Używamy wargacza błękitnogłowego, Thalassoma bifasciatum, jako modelowej ryby drapieżnej, ponieważ gatunek ten jest powszechny na karaibskich rafach koralowych i jest znany z pobierania próbek z szerokiego asortymentu bezkręgowców bentosowych19. Tkanka z organizmu docelowego jest najpierw ekstrahowana, następnie łączona z mieszanką pokarmową, a na końcu oferowana grupom T. bifasciatum w celu zaobserwowania, czy odrzucają pokarmy poddane działaniu ekstraktu. Dane testowe uzyskane przy użyciu tej metody dostarczyły ważnych informacji na temat chemii obronnej organizmów morskich12,20-21, kompromisów dotyczących historii życia22-24 i ekologii społeczności25-26.

<table><tbody><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Płyn przenoszący ciepło Cryocool</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>Do koncentratora próżniowego</td></tr><tr><td>Kwas alginowy Sól sodowa o wysokiej lepkości</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>Pierścienie płaszcza kałamarnicy</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Można kupić w sklepie spożywczym</td></tr><tr><td>Benzoesan denatonium</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka wirówkowa z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Żarówki gumowe do pipet Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Czerwone żarówki do podawania peletów</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna 250 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do fiolki scyntylacyjnej do rotavap</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie motorowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z podziałką 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z podziałką 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Morska ekologia chemiczna to młoda dyscyplina, która wyłoniła się ze współpracy chemików produktów naturalnych i ekologów morskich w latach 80. w celu zbadania funkcji ekologicznych metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich. Rezultatem był postęp w protokołach, które coraz bardziej udoskonalały ekologiczne znaczenie podejścia eksperymentalnego. W tym miejscu przedstawiamy najnowszą wersję laboratoryjnego testu biologicznego żywiącego się rybami, który umożliwia badaczom ocenę aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich. Metabolity organiczne o wszystkich polarnościach są wyczerpująco ekstrahowane z tkanki organizmu docelowego i odtwarzane w naturalnych stężeniach w odpowiedniej pod względem odżywczym matrycy żywnościowej. Eksperymentalne granulki pokarmowe są prezentowane ogólnemu drapieżnikowi w laboratoryjnych testach żywieniowych w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej ekstraktu. Opisana w niniejszym dokumencie procedura wykorzystuje błękitnogłowego, Thalassoma bifasciatum, do badania smakowitości karaibskich bezkręgowców morskich; Konstrukcję można jednak łatwo dostosować do innych systemów. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu laboratoryjnego są ważnym wstępem do eksperymentów terenowych, które opierają się na reakcjach żywieniowych pełnego zestawu potencjalnych drapieżników. Ponadto ten test biologiczny może być wykorzystany do kierowania izolacją metabolitów odstraszających karmienie poprzez frakcjonowanie sterowane testem biologicznym. Ten test biologiczny pogłębił naszą wiedzę na temat czynników kontrolujących rozmieszczenie i liczebność bezkręgowców morskich na karaibskich rafach koralowych i może dostarczyć informacji na temat badań w różnych dziedzinach badań, w tym farmakologii, biotechnologii i ekologii ewolucyjnej.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy wyniki tego bioanalizy dla sześciu gatunków pospolitych gąbek karaibskich (Rysunek 2). Dane te zostały pierwotnie opublikowane w 1995 roku przez Pawlika et al.12 i demonstrują skuteczność tego podejścia w badaniu różnic w strategiach obrony chemicznej wśród współwystępujących taksonów. Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę zjedzonych granulek pokarmowych + błąd standardowy (SE) dla każdego gatunku. W analizach z zastosowaniem surowych ekstrakt...

Ten test biologiczny wykorzystuje model drapieżnej ryby do oceny obecności metabolitów odstraszających od karmienia z organicznych ekstraktów tkanek organizmów morskich w naturalnych stężeniach przy użyciu porównywalnej pod względem odżywczym matrycy pokarmowej.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena aktywności antydrapieżnej metabolitów wtórnych pochodzących z tkanek organizmów morskich. Witam, jestem dr Joseph Pollock z University of North Carolina Wilmington, a towarzyszy mi student studiów magisterskich Michael Marty, który pełnił rolę lidera zespołu przy opracowywaniu tego filmu na temat przeprowadzania biotestów w celu zbadania obron chemicznych w tkankach organizmów morskich. Opracowanie metod, które za chwilę Państwo zobaczycie, rozpoczęliśmy pod koniec lat 80.W tamtym czasie chemicy zajmujący się produktami naturalnymi przypisywali ekologiczne role metabolitom wtórnym bez żadnych dowodów eksperymentalnych. Jednocześnie ekolodzy ekstrapolowali role obronne na podstawie testów toksyczności, które nie miały znaczenia ekologicznego. Przedstawiamy tutaj podejście zaprojektowane w celu oceny aktywności antydrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich.Podejście to spełnia cztery istotne kryteria dla bioanaliz żywieniowych. Po pierwsze, wykorzystujemy odpowiedniego drapieżnika generalistycznego. Po drugie, przeprowadzamy wyczerpującą ekstrakcję metabolitów organicznych o wszystkich polarnościach z tkanek.Po trzecie, wprowadziliśmy te metabolity do pokarmu eksperymentalnego w tym samym stężeniu objętościowym, w jakim występują one w organizmie. Po czwarte, nasz projekt doświadczalny i podejście statystyczne dostarczają istotnej metryki wskazującej na względną niesmaczność. W tych eksperymentach żywieniowych wykorzystujemy rybę *Thomanassus macrophlebus*, modelową rybę drapieżną odpowiednią do testów z wykorzystaniem tkanek karaibskich bezkręgowców morskich, ponieważ gatunek ten jest powszechny na karaibskich rafach koralowych i znany jest z próbkowania szerokiego asortymentu bezkręgowców bentosowych.Teraz Michael szczegółowo opisze protokół. Najpierw należy wyekstrahować tkankę. Do skalibrowanej probówki do wirowania dodaj mieszaninę dichlorometanu i metanolu w stosunku jeden do jednego, aż do uzyskania objętości końcowej 30 ml.Następnie wytnąć fragmenty tkanki z organizmu docelowego. Można to zrobić z tkanki świeżej lub zamrożonej. W naszych badaniach wykorzystujemy gąbki, dlatego w tym filmie zaprezentowana zostanie pomarańczowa gąbka słoniowa, alus, plet roadies.Może być konieczne wycięcie bardzo małych fragmentów tkanki, aby uzyskać odpowiednią objętość. Korzystając z metody wypierania objętościowego, można pobrać dokładnie 10 mililitrów tkanki, zamknąć probówkę zakrętką, odwrócić ją, a następnie mieszać przez cztery godziny; w tym czasie woda łączy się z metanolem, a powstała faza wodno-metanolowa oddziela się od fazy dichlorometanu. Tkanka jest naprzemiennie wystawiona na działanie każdego z mediów ekstrakcyjnych podczas mieszania zawartości probówek.Po upływie tego czasu ekstrakcji widoczne będą dwie wyraźne fazy. Polarna faza metanolu i wody znajdzie się nad niepolarną fazą dichlorometanu. Za pomocą pipety Pasteura przenieś ekstrakt z dichlorometanu z konicznego probówki do kolby okrągłodennej; koniczna probówka powinna zostać przechowywana w lodówce.W kolejnych kilku krokach podłącz kolbę okrągłogłębną do rotacyjnego odparowacza i wykonuj wszystkie etapy wymagające użycia tego urządzenia. Upewnij się, że temperatura łaźni wodnej pozostaje poniżej 40 °C. Zgodnie z podstawowymi procedurami obsługi rotacyjnego odparowacza, odparuj dichlorometan z kolby okrągłogłębnej, a następnie resuspenduj wysuszony ekstrakt niepolarny, używając bardzo niewielkiej ilości dichlorometanu.Może być pomocne zastosowanie mieszania lub wirowania w celu usunięcia wyschniętego materiału ze ścianek kolby okrągłej. Następnie przenieś ekstrakt w chloroformie z kolby okrągłej do 20 ml fiolki scyntylacyjnej. Zamiast nakładać korek na fiolkę scyntylacyjną, podłącz do niej adapter do ewaporatora rotacyjnego i ponownie odparuj do suchości na ewaporatorze rotacyjnym. Fiolka scyntylacyjna z wysuszonym ekstraktem niepolarnym może być przechowywana w lodówce podczas kolejnych kilku etapów.Wracając do skalowanej probówki wirówkowej zawierającej tkankę i ekstrakt z wody z metanolem, użyjemy wykonanego własnoręcznie urządzenia, które poprzez kompresję wyciska medium ekstrakcyjne z tkanki, ściskając ją. Następnie przenieś ekstrakt z wody z metanolem do kolby okrągłobtained i przechowuj go w lodówce w niskiej temperaturze. Dolej do skalowanej probówki wirówkowej metanol, aż tkanka zostanie całkowicie zanurzona, w celu przeprowadzenia drugiej ekstrakcji trwającej od dwóch do sześciu godzin.Po zakończeniu drugiej ekstrakcji metanolem wyjmij schłodzoną kolbę okrągłodenną z lodówki, skompresuj zawartość graduowanej probówki do wirowania i przenieś ten nowy ekstrakt metanolowy do pierwotnej kolby okrągłodennej, w której znajduje się wcześniejszy ekstrakt wodno-metanolowy. Na tym etapie, jeśli istnieje obawa, że tkanka nie została w pełni ekstrahowana, można powtórzyć dwu- lub sześciogodzinny etap ekstrakcji metanolem. Podłącz kolbę okrągłodenną do rotawapora i odparuj metanol w taki sam sposób jak wcześniej.Należy pamiętać, aby utrzymać temperaturę kąpieli wodnej poniżej 40°C. Kolba okrągło-denna zawiera ekstrakt wodny, który musi zostać połączony z wysuszonym ekstraktem niepolarnym w 20 ml fiolce scyntylacyjnej. W związku z tym należy przenieść zawartość kolby okrągło-dennej do 20 ml fiolki scyntylacyjnej.W razie potrzeby przepłucz kolbę okrągłodendną niewielką ilością metanolu, aby zebrać cały pozostały ekstrakt. Fiolka scyntylacyjna zawiera teraz wysuszony ekstrakt niepolarny oraz ekstrakt polarny. Jednakże ekstrakt polarny pozostaje zawieszony w niewielkiej objętości cieczy.Używając koncentratora próżniowego przy niskiej temperaturze, odparuj ekstrakt wodny do suchości. Fiolka scyntylacyjna zawiera teraz suchy, surowy ekstrakt organiczny z 10 mililitrów tkanki; przedmuchaj fiolkę azotem i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Aby przetestować smakowość tych ekstraktów tkankowych, należy je najpierw zrekonstytuować w macierzy pokarmowej, która jest porównywalna pod względem wartości odżywczych z organizmem docelowym.Pierścienie płaszcza kalmara stanowią odpowiednie źródło białka do analiz biologicznych tkanek bezkręgowców i mogą być łatwo przygotowane w formie liofilizowanego proszku. Aby rozpocząć tę analizę biologiczną, należy umieścić zamrożone pierścienie płaszcza kalmara w ciepłej wodzie dejonizowanej. Po rozmrożeniu należy odlać część wody, a następnie przełożyć pierścienie do blendera.Mieszaj dokładnie na wysokich obrotach, aż płaszcz kalmara stanie się lepką cieczą. Jeśli materiał jest zbyt gęsty, aby można go było zmiksować, dodaj wodę. Wlej cienką warstwę upłynnionego płaszcza kalmara na płytką blachę do pieczenia i rozprowadź go równomiernie.Umieść blachę w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Płaty zamrożonych kałamarnic należy rozbić na mniejsze kawałki, aby ułatwić proces liofilizacji. Mniejsze fragmenty są korzystniejsze, ponieważ wysychają szybciej.W liofilizatorze. Umieść połamane kawałki zamrożonej mątwy w komorze i postępuj zgodnie z procedurami obsługi liofilizatora. Po liofilizacji kawałki mątwy należy sproszkować.Można to przeprowadzić za pomocą blendera. Umieść wysuszone kawałki kalmara w blenderze i uruchom urządzenie na wysokich obrotach, aż materiał przybierze postać jednorodnego proszku. Kolejny krok powinien zostać przeprowadzony w dygestorium, aby ograniczyć wdychanie cząsteczek pyłu z kalmara.Wsyp liofilizowany proszek z mątwy do obrotowego sita mącznego. Pod sitem ustaw pojemnik, aby zebrać przesiewany proszek. Obracaj korbą, aby przesiać liofilizowany materiał z mątwy.Duże pasma tkanki łącznej, których nie udało się odpowiednio rozbić w poprzednich krokach, zostaną zatrzymane w sicie, co pozwoli uzyskać drobniejszy proszek. Jeśli jest to konieczne, używając lejka, przenieść liofilizowany proszek z kałamarnicy do szczelnego pojemnika, przedmuchać suchym azotem i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Po przygotowaniu liofilizowanego proszku z płaszcza kałamarnicy można przystąpić do przygotowania partii mieszaniny pożywki do testu. W przypadku przeprowadzania wielu kolejnych testów w tym samym dniu praktyczne jest przygotowanie większej partii mieszaniny pożywki.W niniejszym materiale prezentujemy proces przygotowania mieszaniny o objętości 100 ml. Za pomocą czystej łódeczki ważkiej odważamy trzy gramy kwasu alginowego oraz pięć gramów liofilizowanego proszku z płaszcza kałamarnicy. Składniki sypkie umieszczamy w zlewce o pojemności 150 ml przed dodaniem wody. Delikatnie mieszamy suche składniki za pomocą mikroszpatułki, aby pomóc w ich połączeniu.Dodaj 100 mililitrów wody dejonizowanej i energicznie wymieszaj. Pełna hydratacja proszku może zająć kilka minut. Przed przejściem do kolejnego kroku upewnij się, że otrzymano jednorodną mieszaninę.Jeśli zdecydujesz się zabarwić macierz żywnościową na jeden jednolity kolor, dodaj barwnik na tym etapie. Napełnij strzykawkę pomiarową dokładnie 10 mililitrami mieszaniny żywnościowej. Na tym etapie precyzja objętościowa jest kluczowa, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.Wyjmij z zamrażarki 20 mililitrową fiolkę scyntylacyjną z suchym surowym ekstraktem organicznym i dodaj jedną lub dwie krople metanolu. Nie dodawaj zbyt dużo metanolu. Zapobiegnie to zestaleniu się matrycy żywnościowej.Używając mikrospatułki i minimalnej ilości rozpuszczalnika, resuspenduj ekstrakt do postaci homogenicznej mieszaniny. Pamiętaj o zeskrobaniu ścianek fiolki, aby upewnić się, że cały ekstrakt został resuspendowany. Wstrzyknij 10 mililitrów matrycy żywnościowej do 20 mililitrowej fiolki scyntylacyjnej z resuspendowanym, zhomogenizowanym ekstraktem.Mieszaj tę mieszaninę mikroszpatułką do uzyskania jednorodności. Pobierz bardzo małą objętość mieszaniny ekstraktu. Jeden mililitr w strzykawce jest wystarczający.Zanurz końcówkę strzykawki w 0,25 molarnym roztworze chlorku wapnia i wypchnij zawartość strzykawki, aby utworzyć długą nić przypominającą spaghetti. Nić stwardnieje w tym roztworze. Po kilku minutach wyjmij stwardniałą nić i ułóż ją na szklanej desce do krojenia.Za pomocą żyletki posiekaj pasmo na pellety o długości czterech milimetrów. Zbierz pellety poddane działaniu ekstraktu i opłucz je w wodzie morskiej. W ten sam sposób przygotuj pellety kontrolne.Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, pomijając dodanie ekstraktu z tkanki. Może być konieczne dodanie barwnika spożywczego, aby dopasować kolor granulek kontrolnych i traktowanych. W celu przygotowania kontroli negatywnej, której ryby z pewnością nie będą chciały zjeść.Dodaj proszek deton i benzoesan do mieszaniny surowej żywności w stężeniu 2 mg/ml, zgodnie z opisem Millera i Pollocka z 2013 roku. Próby żywieniowe przeprowadzono z wykorzystaniem dzikich osobników blue head RAs thala w fazie żółtej; ryby trzymano w grupach po trzy w przedziałach o nieprzezroczystych ściankach w akwarium laboratoryjnym. Odpowiednim narzędziem do podawania peletu jest pipeta szklana z gumową gruszką.Granulaty uznaje się za zaakceptowane, jeśli są one chętnie spożywane przez ryby. Granulaty uznaje się za odrzucone, jeśli nie zostaną zjedzone po co najmniej trzech próbach pobrania ich do jamy gębowej przez jedną lub więcej ryb, bądź jeśli granulaty zostaną zignorowane po jednej takiej próbie.W testach nie należy uwzględniać grup ryb, które nie wykazują współpracy i odmawiają zjadania peletu kontrolnego. Poniższy schemat przedstawia procedurę testową, w której każdy przypadek rozpoczyna się od podania peletu kontrolnego w celu potwierdzenia współpracy grupy ryb. Następnie należy podać pelet z preparatem.Jeśli ryby przyjmują potraktowany granulat, próbkę tę ocenia się jako zaakceptowaną. Jeśli ryby odrzucą potraktowany granulat, należy podać kolejny granulat kontrolny, aby potwierdzić, czy ryby przestały żerować. Jeśli ryby przyjmą kolejny granulat kontrolny, próbkę ocenia się jako odrzuconą.Każdą próbkę należy przetestować na 10 niezależnych grupach ryb. Poniżej przedstawiono przykładowy przebieg tego testu żerowania. Najpierw podaje się granulat kontrolny, który ryby akceptują.Po drugie, podaje się pellet traktowany. W tym przypadku ryby odrzucają pellet traktowany. W związku z tym należy następnie podać pellet kontrolny.Ryby akceptują kolejną próbę kontrolną, a próbkę można uznać za odrzuconą. Każda próba musi zostać przeprowadzona z 10 niezależnymi grupami ryb. Istotność różnic w spożyciu peletu kontrolnego w porównaniu z peletem badanym należy ocenić za pomocą zmodyfikowanej wersji dokładnego testu Fishera, zgodnie z opracowaniem Low i Pollock z 2014 roku.Test został zmodyfikowany tak, aby sumy brzegowe dla granulek kontrolnych i traktowanych były stałe, traktując je obie jako próby losowe. Przy zjedzeniu siedmiu granulek daje to wartość P równą 0,057. W związku z tym każdy ekstrakt jest uznawany za odstraszający, jeśli zjedzono sześć lub mniej granulek, a w przeciwnym razie za smaczny.Jeśli zjedzono siedem lub więcej granulatów. Podczas porównywania smakowitości między grupami ekstraktów należy użyć średniej liczby zjedzonych granulatów, co zostanie przedstawione w reprezentatywnych wynikach. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy wyniki tego testu biologicznego dla sześciu gatunków pospolitych gąbek karaibskich.Dane te zostały pierwotnie opublikowane przez Pollocka i współpracowników w 1995 roku i demonstrują skuteczność tego podejścia w wyjaśnianiu różnic w strategiach obrony chemicznej między współwystępującymi taksonami. Każda kategoria na osi Y reprezentuje ekstrakty z jednego gatunku gąbki. Pobrano, poddano ekstrakcji i przetestowano kilka osobników każdego gatunku, co oznaczono liczbą w nawiasach następującą po nazwie gatunku.Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę zjedzonych granulek pokarmowych wraz z błędem standardowym dla każdego gatunku. W testach z zastosowaniem surowego ekstraktu organicznego z alus, pleth, pheon, compressor oraz lycine called foris prawie żadne granulki nie zostały zjedzone. Z kolei granulki sporządzone z ekstraktu z Cali spongy of Vais.Geo Osa i Michel lavis zostały łatwo skonsumowane w teście. W przypadku pierwszych trzech gatunków zjedzono mniej niż sześć peletek, zatem można je uznać za istotnie odstraszające. Z kolei drugie trzy gatunki nie różniły się istotnie od grup kontrolnych i mogą być uznane za smaczne.Wykazane właśnie metody stanowią potężne podejście do badania chemicznych mechanizmów obrony przed drapieżnikami w połączeniu z manipulacyjnymi eksperymentami i badaniami terenowymi. Wyniki tych testów biologicznych pomogły mojej grupie badawczej zrozumieć czynniki kontrolujące rozmieszczenie i liczebność bezkręgowców morskich na rafach koralowych Karaibów. Co istotne, metoda ta zaspokaja potrzebę zapewnienia relewantności ekologicznej w ekologii chemicznej, wykraczając poza standardowe ramy tej dyscypliny.Wyniki tych testów biologicznych mogą być pomocne w badaniach w różnych dziedzinach nauki, w tym w farmakologii, biotechnologii i ekologii ewolucyjnej.

a-fish-feeding-laboratory-bioassay-to-assess-antipredatory-activity

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Laboratorium do badania bioaktywności związków wtórnych pochodzenia morskich organizmów o działaniu antydrapieżczym na podstawie karmienia ryb

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Przedstawiono technikę laboratoryjnego szacowania efektywności transferu troficznego netto kongenerów polichlorowanego bifenylu (PCB) do ryb rybożernych z ich ofiary. Aby zmaksymalizować zastosowanie wyników laboratoryjnych w terenie, ryby rybożerne powinny być karmione rybami drapieżnymi, które są zwykle spożywane na polu.

Laboratoryjne oszacowanie efektywności transferu troficznego netto kongenerów PCB do pstrąga jeziorowego (Salvelinus namaycush) z jego ofiary

Ta praca opisuje nowy protokół oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały, przy użyciu morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Metoda ta pozwala na określenie LC50, czyli śmiertelności, stężenia, które powoduje 50% spadek zdolności hodowli bakterii, po 6 godzinach ekspozycji.

Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Zdrowie dzikich ryb może być używane jako wskaźnik zdrowia ekosystemu wodnego. Oceny stanu zdrowia ryb oparte na sekcji zwłok dostarczają dokumentacji widocznych zmian lub nieprawidłowości, danych wykorzystywanych do obliczania wskaźników stanu, a także możliwości pobrania tkanek do oceny mikroskopowej, ekspresji genów i innych bardziej szczegółowych analiz.

Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i charakterystyki struktury, siły węchowej i reakcji behawioralnej domniemanych związków feromonów minogów morskich.

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Ta praca ma na celu ocenę i przegląd procedury biologicznego testu śmiertelności Artemia salina, również identyfikowanej jako test śmiertelności krewetek solankowych. Ta prosta i tania metoda dostarcza informacji na temat ogólnej toksyczności (traktowanej jako wstępna ocena toksyczności) próbek, a mianowicie produktów naturalnych.

Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

Poznaj metodę oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich przy użyciu ryby modelowej. To podejście dostarcza eksperymentalnych dowodów na ekologiczne role związków chemicznych.

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich (Wideo) | JoVE Journal

Laboratoryjny test biologiczny żywiący się rybami w celu oceny aktywności przeciwdrapieżnej metabolitów wtórnych z tkanek organizmów morskich

Przeglądaj więcej filmów