Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Ogólnym celem tej procedury jest wyjaśnienie profili ekspresji białek w guzach płynnych i litych. Osiąga się to poprzez wzbogacenie komórek rakowych z próbek krwi lub tkanek pobranych od pacjenta. W drugim etapie białka są izolowane z komórek rakowych, a następnie mieszane ze specyficznym dla nowotworu wzorcem kwantyfikacji susac.

W ostatnim etapie mieszanka białkowa jest trawiona. Ostatecznie spektrometria mas służy do pokazania profili ekspresji białek z guzów płynnych i litych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii i patologii, takie jak: w jaki sposób można zidentyfikować cele leków i mechanizmy oporności na terapię?

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odkrywanie biomarkerów, może być również stosowana w innych systemach, takich jak badanie różnorodnych, stałych i płynnych nowotworów. Demonstracją procedury będzie dr Hannibal Berger Institute for Pathology i dr Christophe Lanz z mojego laboratorium Aby przygotować płynne komórki nowotworowe do sortowania fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej, zacznij od podania przez Ali jednego mililitra ludzkiej próbki komórek jednojądrzastych zawieszonej w PBS plus 2% FBS dla kontroli ujemnej i jednego mililitra dla każdego barwnika fluorescencyjnego użytego w końcowym barwieniu. Następnie inkubuj komórki z odpowiednimi przeciwciałami do wyizolowania populacji komórek białaczkowych i do kontroli kompensacji na lodzie.

Po 30 minutach przemyj komórki dwukrotnie PBS plus 2%FCS. Następnie dodaj plamę żywotności komórek do odpowiednich probówek i posortuj komórki zgodnie ze schematem. Pobieranie próbek w IMDM plus 10% FCS w celu zebrania guzów litych za pomocą mikrodysekcji laserowej.

Najpierw użyj mikrotomu, aby wyciąć odcinki o grubości od pięciu do 10 mikrometrów z próbek zatopionych w parafinie utrwalonej w forminie. Następnie zamontuj sekcje na szkiełkach membranowych pokrytych folią i po godzinie wysusz próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usunąć i ponownie uwodnić sekcje przez kolejne jednominutowe inkubacje w absolutnym etanolu ksylenowym, 70% etanolu i wodzie.

Następnie barwić skrawki hematyną przez 20 sekund. Opłucz je wodą z kranu i zbierz interesujące komórki za pomocą systemu mikrodysekcji laserowej, aby wyekstrahować białko z posortowanych płynnych komórek nowotworowych. Odwiruj próbkę trzy razy, myjąc komórki w 500 mikrolitrach zimnego PBS podczas kolejnych dwóch wirowań.

Następnie inkubuj komórki w 40 mikrolitrach buforu do lizy na jeden razy 10 do sześciu komórek. Po 15 minutach odwirować lizat i przenieść klarowny lizat zawierający supernatant do nowej probówki reakcyjnej w celu wyekstrahowania białka z mikrowypreparowanych komórek guza stałego. Inkubować próbkę tkanki z 60 mikrolitrami buforu do lizy tkanek w temperaturze 72 stopni Celsjusza.

Po 15 minutach zebrać płyn przez krótkie odwirowanie i przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej. Następnie sonikować lizat na lodzie przez trzy minuty, a następnie inkubować z 15 mikrolitrami, które zawierają 20% siarczanu ESAL sodu w temperaturze 99 stopni Celsjusza w bloku grzewczym z mieszaniem 600 obr./min. Po godzinie odwiruj lizat i przenieś S natin do nowej probówki.

Następnie określ stężenia białek oczyszczonego wzorca komórkowego i super SLAC, a następnie wymieszaj równe ilości kawałków komórek nowotworowych z super standardem SLAC, a następnie litem. Wykonaj bufor siarczanowy odsalu w 25% objętości próbki i środek redukujący w 10% objętości próbki. Następnie podgrzej powstały roztwór w bloku grzewczym przez 10 minut w temperaturze 72 stopni Celsjusza.

Aby zmierzyć stężenie białka w lizacie guza litego na czytniku płytkowym, należy zmieszać standardową serię roztworów do rozcieńczania albuminy surowicy bydlęcej, lizat i odpowiedni wzorzec super SLAC z dostępnym na rynku testem białkowym i płytką 96-dołkową. Po jednej minucie wstrząsania inkubować próbkę przez odpowiedni okres czasu i mierzyć absorbancję zgodnie ze wskazówkami producenta. Następnie zmieszać równe ilości oczyszczonego lizatu i wzorca super SLAC z 200 mikrolitrami mocznika w jednostce filtrującej i odwirować próbki przez 30 minut.

Do analizy lizatów komórek nowotworowych za pomocą chromatografii cieczowej i analizy spektrometrii mas. Rozpocznij od rozpuszczenia interesujących peptydów w 30 mikrolitrach buforu ładującego przez pięć minut w kąpieli sonizacyjnej. Następnie odwirować białko i przenieść przezroczysty supernatant do fiolki z automatycznym próbnikiem do próbników ze spektrometrią mas

Następnie wstrzyknij pięć mikrolitrów próbki na analizę do nano lc, automatów systemu ms MS, próbnika oraz koncentratu i odsolenia peptydów online w odwróconej fazie C 18 montowanej i wentylowanej kolumnie. Na koniec oddziel peptydy na mikrokolumnie z odwróconą fazą C 18 w kolumnie natryskiwanej nanos we własnym tempie. Stosując 90-minutowy gradient od pięciu do 35% nitrylu acetylowego w porównaniu z 0,1% wodnym kwasem mrówkowym przy 300 nanolitrach na minutę, użyj źródła jonów w sprayu nano do przeniesienia i analizy peptydów.

Korzystając z 15 najpopularniejszych metod akwizycji zależnych od danych, do analizy peptydów można używać różnych typów spektrometrów masowych. Profilowanie proteomiczne guzów płynnych i litych od pacjentów jest obiecującym podejściem do odkrywania nowych biomarkerów diagnostycznych i predykcyjnych. Na przykład, ten pierwszy rysunek pokazuje przykładową strategię bramkowania do izolowania barwników CD one 17, komórek białaczkowych z płynnej próbki guza.

Podczas gdy w tym przypadku sekcja o grubości od 5 do 10 mikrometrów zamontowana na szkiełkach membranowych pokrytych folią, jak właśnie pokazano. Jak pokazano, obszar zainteresowania został następnie wybrany ręcznie i wycięty przez mikropreparację laserową, nienadzorowana analiza skupień profili ekspresji białek w płynnych i stałych próbkach guza może być następnie przeprowadzona za pomocą spektrometrii mas, co pozwala na wyraźne oddzielenie różnych jednostek nowotworowych zgodnie z ich odrębnymi profilami ekspresji białka. Dane te mogą ostatecznie przyczynić się do ustanowienia klinicznie istotnych biomarkerów.

Implementacja strategii wzbogacania modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja lub wentylacja UIC, może być również przeprowadzona w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób można zidentyfikować rozregulowane wzorce kinaz po ich opracowaniu? Technika ta utorowała naukowcom z dziedziny patologii i onkologii drogę do zbadania określonych biomarkerów i szlaków sygnałowych w różnych jednostkach nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować białka z nowotworów jako subpopulacji w celu analizy ich wzorców ekspresji białek i stanów sygnalizacyjnych za pomocą spektrometrii mas.