Name: Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę EPA 1615 do pomiaru zakaźnych wirusów w wodzie przy użyciu hodowli komórkowej BGM i RT-qPCR. Protokół umożliwia ilościowe określenie wirusów w próbkach wody pitnej i środowiskowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Dr. Markowi Borchardtowi, Departamentowi Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Marshfield, WI, za dostarczenie serotypu 3 wirusa polio Sabin użytego w tym badaniu; Mary Jean See, Nancy Schable i Jenifer Jones z Dynamac Corporation za przygotowanie kultur BGM; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar i Larry Wymer za wkład w ogólną ocenę metody USEPA 1615; Gretchen Sullivan za pomoc techniczną; oraz lokalnym prywatnym właścicielom studni i zakładom użyteczności publicznej za umożliwienie nam pobrania próbek wody. Chociaż praca ta została zrecenzowana przez USEPA i zatwierdzona do publikacji, niekoniecznie musi odzwierciedlać oficjalną politykę Agencji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

UWAGA: Listę definicji znajduje się w sekcji materiałów uzupełniających S1. Procedury kontroli jakości (QA) powiązane z metodą USEPA Method 1615 są opisane w sekcji materiałów uzupełniających S2.
1. Procedura elucji z filtra
<ol>
	<li>Pierwsza elucja
	<ol>
		<li>Do cylindra miarowego wlać 500 ml buforowanego 1,5% ekstraktu wołowego o pH 9,0, ogrzanego do temperatury pokojowej. Otworzyć obudowę wkładu filtra i dodać taką ilość ekstraktu wołowego, aby całkowicie pokryć filtr elektropozytywny. Zamknąć pokrywę obudowy filtra, a pozostały ekstrakt wołowy przelać do sterylnego zlewka.</li>
		<li>Po 1 min czasie kontaktu powoli przepuścić roztwór ekstraktu wołowego z obudowy oraz pozostałą część ze sterylnego zlewka przez filtr, używając pojemnika ciśnieniowego lub pompy perystaltycznej. Eluat zebrać do szklanego zlewka o pojemności 2 L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Druga elucja
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki 1.1, używając dodatkowych 500 ml buforowanego 1,5% ekstraktu wołowego, jednak w kroku 1.1.2 wydłużyć czas kontaktu do 15 min.</li>
		<li>Ekstrakt wołowy z drugiej elucji dodać do zlewka o pojemności 2 L zawierającego eluat z pierwszej elucji. Do zlewka dodać sterylny magnesytrzywacz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura zagęszczania poprzez flokulację organiczną
<ol>
	<li>Sterylizować elektrodę pH typu kombinowanego za pomocą 0,525% podchlorynu sodu przez co najmniej 5 min. Opłukać elektrodę sterylną dH2O, a następnie odchlorować za pomocą 0,05 M tiosiarczanu sodu. Kalibrować pH-metr, korzystając ze wzorców pH 4 i 7.</li>
	<li>Umieścić zlewkę zawierającą eluat na mieszalniku magnetycznym. Włączyć mieszalnik i zwiększać prędkość mieszania, aż do powstania wiru.</li>
	<li>Powoli dostosować pH eluatu do wartości 3,5 ± 0,1 poprzez kroplowe dodawanie 1,2 M HCl do eluatu. Dodawać HCl kroplowo, ponieważ szybkie dodanie spowoduje inaktywację wirusa. W tym czasie eluat stanie się mętny w wyniku zaczynania się tworzyć osadu.</li>
	<li>Zmniejszyć prędkość mieszania do powolnego mieszania, a następnie kontynuować monitorowanie i utrzymywanie pH eluatu na poziomie 3,5 ± 0,1 w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Przelać zawiesinę z osadem z ekstraktu wołowego do jednej lub kilku butelek do wirowania i wirować przez 15 min przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Wyjąć butelki z wirówki i odessać lub powoli odlać supernatant, aby zapobiec utracie osadu w granulacie. Wyrzucić supernatant. 
	UWAGA: W zależności od partii ekstraktu wołowego mogą występować znaczne różnice w ilości i jakości osadu. Osad wytworzony z niektórych partii rozpuści się szybko, podczas gdy z innych rozpuszcza się z trudnością.</li>
	<li>Dodać 30 ml 0,15 M fosforanu sodu do butelki do wirowania zawierającej osad.
	<ol>
		<li>Użyć 0,15 M fosforanu sodu o pH 9,0 dla osadów z partii ekstraktu wołowego, które rozpuszczają się w ciągu 5 min. Mieszać przez 10 min po całkowitym rozpuszczeniu osadu, a następnie niezwłocznie przejść do kroku 2.7.</li>
		<li>Użyć 0,15 M fosforanu sodu o pH 7,0–7,5 dla wszystkich pozostałych osadów. Mieszać przez 10–15 min do rozpuszczenia lub w przypadku trudniejszych osadów rozbijać je sterylną szpatułką, wielokrotnie pobierając i wypuszczając roztwór pipetą podczas mieszania, wstrząsając osadem z prędkością 160 rpm na wstrząsarku orbitalnym lub stosując kombinację tych procedur. 
		UWAGA: Przy użyciu więcej niż jednej butelki do wirowania połączyć osady, używając mniej niż 30 ml fosforanu sodu, a następnie wykorzystać pozostałą część z 30 ml do opłukania butelek po połączeniu osadów w jednej butelce lub zlewce.</li>
		<li>Jeśli połączony osad znajduje się w butelce do wirowania z płaskim dnem, dodać do butelki mieszadło magnetyczne. Przejść do kroku 2.6.5.</li>
		<li>Jeśli połączony osad znajduje się w butelce do wirowania z dnem stożkowym, przenieść go do małej szklanej zlewki i dodać do niej mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Umieścić butelkę lub zlewkę na mieszalniku magnetycznym i mieszać do całkowitego rozpuszczenia osadu.</li>
		<li>Ponownie sterylizować elektrodę pH typu kombinowanego za pomocą 0,525% podchlorynu sodu i odchlorować za pomocą 0,05 M tiosiarczanu sodu zgodnie z opisem w kroku 2.1. Kalibrować pH-metr, korzystając ze wzorców pH 7 i 10. Powoli dostosować pH całkowicie rozpuszczonego osadu do wartości 9,0 za pomocą 1 M NaOH, a następnie mieszać przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć mieszadło magnetyczne i wirować rozpuszczony osad przez 10 min przy 4 000–10 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przelać supernatant do szklanej zlewki, nie naruszając granulatu. Dodać do zlewki mieszadło magnetyczne i wyrzucić granulat.</li>
	<li>Umieścić zlewkę na mieszalniku magnetycznym i mieszać roztwór. Dodawać kroplowo 1,2 M HCl, aby dostosować pH do poziomu 7,0–7,5.</li>
	<li>Przeprowadzić sterylizację filtracyjną supernatantu poprzez przepuszczenie go przez filtr sterylizacyjny z filtrem wstępnym, który został wstępnie potraktowany 15 ml 1,5% ekstraktu wołowego, 0,05 M glicyną o pH 7,0–7,5.</li>
	<li>Obliczenia objętości próbki do analizy (S):
	<ol>
		<li>Użyć równania 1 do obliczenia S dla wszystkich próbek badawczych z wyjątkiem laboratoryjnej wzbogaconej próby ślepej oraz laboratoryjnej próby ślepej z odczynnikiem, 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej, S=D/TSV×FCSV, opisuje obliczanie rozkładu sił." src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">        Równanie 1 
		gdzie D (objętość oryginalnej próbki wody poddanej analizie) wynosi 500 L dla wód podziemnych, TSV (całkowita objętość próbki) to objętość próbki terenowej przepuszczonej przez 5-calowy elektropozytywny filtr wkładowy otrzymanej przez laboratorium, a FCSV (końcowa objętość skoncentrowanej próbki) to objętość po filtracji w kroku 2.10. Przykład przedstawiono w sekcji S4.1 materiałów uzupełniających.</li>
		<li>Obliczyć S dla laboratoryjnej wzbogaconej próby ślepej (LFB; t.j. pozytywnej kontroli jakości z użyciem wody o czystości odczynnikowej z dodatkiem wirusa) oraz laboratoryjnej próby ślepej z odczynnikiem (LRB; t.j. negatywnej kontroli jakości z użyciem wody o czystości odczynnikowej) poprzez pomnożenie FCSV przez 0,3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podzielić FCSV na trzy podpróbki.
	<ol>
		<li>Przygotować podpróbki 1 i 2 o objętości równej 1,04 razy objętość próbki do analizy. Zamrozić te podpróbki w temperaturze -70 °C lub niższej, jeśli nie mogą zostać przeanalizowane za pomocą testu całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli (podpróbka 1, krok 4) lub przetworzone w testach molekularnych (nie pokazano) w ciągu 24 h; w przeciwnym razie przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zamrozić pozostałą objętość (podpróbka 3) w temperaturze -70 °C lub niższej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć objętość inokulum, dzieląc S przez 10.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie całkowitej liczby wirusów zdolnych do namnażania
UWAGA: Na wszystkich etapach należy dodawać roztwory ostrożnie, aby uniknąć naruszenia monowarstwy komórek.
<ol>
	<li>Zlej lub odessaj medium z naczyń testowych zawierających monowarstwę komórek BGM w 3–6 dniach po pasażowaniu, a następnie dodaj objętość zrównoważonego roztworu soli równą objętości usuniętego medium.</li>
	<li>Zlej lub odessaj zrównoważony roztwór soli z używanych naczyń testowych z hodowlą komórkową, a następnie zaszczep naczynia testowe:
	<ol>
		<li>Zaszczep 10 naczyń testowych dla każdej próbki testowej objętością podpróbki 1 równą Inoculum Volume wraz z kontrolami ilościowymi całkowitego wirusa zdolnego do namnażania (sekcja S2.4 materiałów dodatkowych).</li>
		<li>W przypadku LFB oraz Lab Fortified Sample Matrix (LFSM; t.j. próbki macierzy wodnej z dodatkiem), przygotuj rozcieńczenia 5-, 25- i 125-krotne, używając podpróbki 3 i 0,15 M fosforanu sodu o pH 7,0–7,5 jako rozcieńczalnika. Przykład procedury przygotowania rozcieńczeń podano w sekcji S3 materiałów dodatkowych. Zaszczep 10 wypłukanych naczyń testowych z hodowlą komórkową dla każdej serii rozcieńczeń, używając Inoculum Volume dla każdego naczynia testowego, dodatkowo do naczyń szczepionych nierozcieńczoną podpróbką 1 w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Dla każdej próbki testowej z kroku 3.2.1 (innej niż te zaszczepione w kroku 3.2.2), w której we wszystkich 10 powtórzeniach wystąpi CPE po 14 dniach inkubacji (patrz krok 3.3), przygotuj rozcieńczenia 5-, 25-, 125- i 625-krotne podpróbki 3. Zaszczep 10 wypłukanych naczyń testowych z hodowlą komórkową dla każdej serii rozcieńczeń, używając Inoculum Volume dla każdego naczynia testowego wraz z nowym zestawem kontroli ilościowych całkowitego wirusa zdolnego do namnażania (sekcja S2.4 materiałów dodatkowych).</li>
		<li>Rozprowadź inokulum na powierzchni monowarstw komórkowych, przechylając naczynia w przód i w tył. Inkubuj naczynia testowe w temperaturze pokojowej przez 80–120 min na mechanicznej platformie kołyszącej przy 1–5 oscylacjach/min lub poprzez kołysanie naczyń co 15–20 min, aby umożliwić adsorpcję obecnych wirusów do komórek.</li>
		<li>Dodaj uprzednio ogrzane medium do podtrzymania, a następnie inkubuj naczynia testowe w temperaturze 36,5 ± 1 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie przez pierwsze 3 dni sprawdzaj pod mikroskopem pojawienie się CPE w każdym naczyniu testowym, a następnie badaj je co 2–3 dni aż do 14. dnia. Przenieś wszystkie naczynia testowe wykazujące ≥75% CPE do zamrażarki ustawionej na temperaturę -70 °C lub niższą. Wszystkie pozostałe hodowle oraz kontrole ilościowe całkowitego wirusa zdolnego do namnażania zamroź w temperaturze -70 °C lub niższej po przebadaniu naczyń w ostatnim dniu.</li>
	<li>Rozmroź wszystkie hodowle i przefiltruj ≥15% medium z każdego naczynia testowego dodatniego pod kątem CPE przez sterylizujący filtr 0,2 μm. Jeśli określona objętość nie może przejść przez filtr z powodu zapchania, przed filtracją wiruj medium przez 10 min przy 1 500–18 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj drugi pasaż wszystkich naczyń testowych z 1go pasażu, używając wypłukanych naczyń testowych BGM.
	<ol>
		<li>Zaszczep nowe naczynia testowe objętością inokulum stanowiącą 10% rozmrożonego medium ze wszystkich ujemnych naczyń testowych oraz z przefiltrowanego medium z naczyń dodatnich.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.4–3.4.3, jednak zamroź każde naczynie testowe, które było ujemne w 1szym pasażu i stało się dodatnie w 2ndym, zgodnie z opisem w kroku 3.3. Wykonaj 3ci pasaż zgodnie z opisem pasażu 2go, używając wyłącznie ujemnych kontroli analizy oraz hodowli komórkowych, które były ujemne podczas 1go pasażu i dodatnie w 2ndym pasażu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj poszczególne naczynia testowe jako dodatnie pod kątem wirusa, gdy wykazują one CPE zarówno w 1szym, jak i 2ndym pasażu lub, w przypadku gdy CPE nie wystąpiło do czasu 2go pasażu, zarówno w 2ndym, jak i 3cim pasażu.</li>
	<li>Użyj kalkulatora Most Probable Number USEPA z domyślnymi ustawieniami programu zgodnie z Tabelą S2, aby obliczyć miana wirusa dla wszystkich próbek testowych.
	<ol>
		<li>Wprowadź do kalkulatora liczbę dodatnich powtórzeń naczyń testowych z kroku 3.6 dla każdej próbki testowej, aby wyznaczyć wartość MPN/ml (MmL) oraz górną (CLumL) i dolną (CLlmL) granicę ufności 95%/ml.</li>
		<li>Wyznacz wartość MPN/L (ML) dla odpowiadającej próbki testowej, korzystając z równania 2. 
		<img alt="Wzór na równowagę statyczną, \( M_L = \frac{M_{mL} \, S}{D} \), ilustrujący rozkład momentów." src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">        Równanie 2 
		MmL to wartość MPN/ml z kroku 3.7, S to Assay Sample Volume, a D to Volume of Original Water Sample Assayed.</li>
		<li>Oblicz górną granicę ufności/L, zastępując wartość MmL wartością CLumL. Oblicz dolną granicę ufności/L, zastępując wartość MmL wartością CLlmL. Przykład obliczeń przedstawiono w sekcji S4.2 materiałów dodatkowych.</li>
		<li>Wartości MmL równe 0 raportuj jako ≤ 1/D. Na przykład ≤ 0,002 MPN/L (≤ 1/500 L) dla próbek wód podziemnych.</li>
		<li>Oblicz wartości MPN i 95% granice ufności dla każdego Lab Fortified Blank i Lab Reagent Blank, najpierw mnożąc wartości/ml uzyskane w kalkulatorze przez S, a następnie dzieląc wynik przez 0,3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda USEPA 1615 została opracowana do użytku podczas trzeciego cyklu monitorowania nieuregulowanych zanieczyszczeń (UCMR3)17 i przeznaczona głównie do pomiaru występowania wirusa w wodach gruntowych. Ma ona wiele wspólnych kroków z metodą Reguły Gromadzenia Informacji (ICR),15,18 , ale ma dwie drobne różnice. Oba wykorzystują testy kwantowe do pomiaru wirusa, który wytwarza CPE na monowarstwach komórek BGM, przy czym kwantyfikacja opiera się na obliczeniach najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN). Metoda 1615 pozwala na zastosowanie nowszego filtra elektrododatniego do zagęszczania wirusa z różnych matryc wodnych i zmniejsza liczbę powtórzeń naczyń do badań kultur komórkowych na rozcieńczenie z 20 do 10. Obie drobne zmiany zmniejszają ogólne koszty metody. Zmniejszenie liczby powtórzeń zmniejsza nakład pracy, ale skutkuje nieco niższą granicą wykrywalności. Chociaż oczekuje się, że wody gruntowe będą miały niższe stężenie wirusa niż wody powierzchniowe,19,20 ilość badanej próbki jest pięciokrotnie większa niż w wodach powierzchniowych, co częściowo kompensuje różnice. Użycie mniejszej liczby kontrprób będzie odpowiednie dla większości wód powierzchniowych, ale niektóre będą wymagały rozcieńczenia próbki.
Metoda 1615 składa się z kilku krytycznych etapów i ograniczeń. Ekstrakty z wołowiny różnią się w zależności od partii. Każda partia powinna zostać przebadana pod kątem skuteczności wymywania wirusa i zdolności do koncentracji wirusa poprzez etapy koncentracji wtórnej, jak opisano w sekcji S2.3 materiałów uzupełniających. Metoda wykorzystuje precyzyjne wzory do obliczania ilości próbki do inokulacji na kulturach komórkowych BGM i do określania miana wirusa. Niedokładne wyniki zostaną wygenerowane, jeśli te formuły nie będą rygorystycznie przestrzegane. Do utrzymania kultur komórkowych należy stosować odpowiednią technikę aseptyczną. Niezakażone kontrole hodowli komórkowych BGM, które wykazują niepokój podczas 14-dniowego okresu inkubacji, prawdopodobnie wskazują na problemy z utrzymaniem hodowli komórkowych. Należy również zachować szczególną ostrożność podczas etapów pipetowania związanych z zaszczepianiem i dodawaniem pożywki do kolb do kultur komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Kontrole jakości opisane w materiałach uzupełniających sekcja S2 muszą być rygorystycznie przestrzegane. Sekcja S2 zawiera również porady dotyczące rozwiązywania problemów z jakością.
Podstawowym mechanizmem adsorpcji wirusa do filtrów elektrododatnich jest oddziaływanie ładunku związane z siłą ładunku dodatniego na filtrze i siłą ładunku ujemnego wirusa związaną z jego punktem izoelektrycznym i pH badanej wody21. Na elucję z filtrów wpływa również siła tych oddziaływań. Ponieważ różnią się one w zależności od typu wirusa, a nawet między szczepami tego samego typu, elucja z filtrów nie jest jednolita. Oznacza to, że każdy wynik może zaniżać rzeczywisty poziom wirusa obecnego w wodach środowiskowych. Wykorzystanie pojedynczej linii komórkowej BGM również nie docenia występowania wirusa. Zakres wirusa jelitowego, który może wytwarzać CPE w tej linii komórkowej, jest ograniczony głównie do serotypów wirusów polio i enterowirusów B , a także niektórych reowirusów14,15,22. Inne zakaźne typy wirusów nie zostaną wykryte.
Odzysk wirusa polio z wód gruntowych i odczynników spełniał kryteria akceptacji wydajności metody USEPA 1615 zarówno dla oceny działania (PE; tj. próbki wody z odczynnikami nasiennymi o mianach nieznanych analitykowi, które są wykorzystywane do oceny wydajności analityka przed rozpoczęciem badania) oraz próbki LFB (materiały uzupełniające Tabela S1). Odzysk 58% z wód gruntowych przy użyciu procedury hodowli jest podobny do tego zgłaszanego przez inne osoby korzystające z wody z kranu23,24. Średni odzysk z próbek LFB wynoszący 111% przy współczynniku zmienności (CV) wynoszącym 100% również spełniał kryteria akceptacji skuteczności metody, mimo że są one wyższe niż obserwowane dla próbek PE podczas ICR. Średni odzysk międzylaboratoryjny ICR wynosił 56% przy współczynniku zmienności (CV) 92%, podczas gdy średni odzysk wewnątrzlaboratoryjny wahał się od 36 do 85% (CV 58 do 131%; niepublikowane dane z bazy danych ICR PE). W tym badaniu zaobserwowano wyższe odzyski dla próbek LFB o niskiej liczbie nasion niż dla próbek o wyższej liczbie nasion (122 w porównaniu z 42%). W czasie, gdy planowano ICR, oczekiwano, że próbki PE otrzymujące niskie wartości nasion będą miały niższy odzysk niż te, które otrzymają nasiona o wysokiej wartości. Podobnie jak w przypadku próbek LFB, wyzdrowienie wirusa polio dla próbek ICR PE wynosiło 71% (CV 100%), 54% (CV 69%) i 44% (CV 71%) dla wartości nasion ≤300 MPN, 300–1500 MPN i >1500 MPN.
Istnieje wiele metod pomiaru zakaźnego wirusa w próbkach wody25. Metoda ta jest istotna w stosunku do innych metod pod względem stopnia standaryzacji. Standaryzacja obejmuje nie tylko kontrole jakości i wydajności, ale także wykorzystuje określone objętości i formuły, aby zapewnić, że wszystkie laboratoria analityczne wykonują metodę w identyczny sposób. Bez standaryzacji trudno jest porównywać wyniki między laboratoriami, dlatego standaryzacja jest niezbędna przy prowadzeniu badań na dużą skalę w wielu laboratoriach analitycznych. Dzięki wbudowanej standaryzacji metoda ta może zostać w przyszłości rozszerzona o dodatkowe typy wirusów i linie komórkowe. Trwają badania mające na celu dostarczenie danych do włączenia adenowirusa do metody.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Wirusy jelitowe to zróżnicowana grupa wirusów, które infekują ludzki układ jelitowy i które są przenoszone drogą fekalno-oralną. Wirusy te dostają się do wód powierzchniowych i gruntowych przez ścieki z oczyszczalni ścieków i szamba, niewłaściwie zaprojektowane lub uszkodzone szamba, zerwane przewody kanalizacyjne, przelewy kanalizacji ogólnospławnej oraz inne źródła punktowe i niepunktowe1-4. Do zakażeń i chorób ludzi spowodowanych wirusami przenoszonymi przez wodę dochodzi poprzez spożycie zanieczyszczonej lub nieodpowiednio zdezynfekowanej wody lub poprzez kontakt z wodą rekreacyjną. Objawy choroby mogą obejmować łagodne lub ciężkie zapalenie żołądka i jelit; zapalenie spojówek; Gorączka; niewydolność górnych dróg oddechowych; choroby rąk, stóp i jamy ustnej; zapalenie mięśnia sercowego; aseptyczne zapalenie opon mózgowych; Zapalenie mózgu; paraliż; sepsa5-8, a zgon9,10.
Metoda USEPA 1615 dostarcza procedurę pomiaru zakaźnych cząsteczek wirusa jelitowego w środowisku i wodach pitnych. Wody te mogą zawierać mieszaninę zakaźnych i niezakaźnych wirionów, ale tylko cząstki zakaźne stanowią potencjalne zagrożenie dla zdrowia. Zakaźne cząsteczki wirusa z czasem tracą zakaźność w wodzie środowiskowej i pitnej z powodu utraty integralności kapsydu białkowego, uszkodzenia kwasów nukleinowych w wyniku promieniowania UV ze światła słonecznego oraz uszkodzeń spowodowanych przez wszelkie środki dezynfekujące, które mogą być obecne11-13. Procedura całkowitej hodowli wirusa przewidziana w tej metodzie opiera się na wytwarzaniu efektów cytopatycznych (CPE) w linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey (BGM). Ta linia komórkowa została wybrana ze względu na jej szerokie zastosowanie w dziedzinie wirusologii środowiskowej14,15, mimo że zakres wykrywanych typów zakaźnych wirusów jest ograniczony głównie do niektórych enterowirusów15. Celem tego artykułu jest opisanie procedur metody 1615 dotyczących elucji pięciocalowych filtrów z wkładem elektrododatnim, stężenia wtórnego i pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli. Ocena ogólnej metody została opisana w Cashdollar et al.Lokal mieszkalny 16.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt wołowy, suszony proszek</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kriogeniczne</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s zrównoważony roztwór soli</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Mechaniczna platforma bujana</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Filtr sterylizujący z filtrem wstępnym</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizujący filtr strzykawkowy</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Normy</td> <td>pHSigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 lub M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, 7,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Przeciwgrzybicze</td><td>Technologie Życia</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda epa 1615. pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i rt-qpcr. ii. całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Standardowa metoda jest wymagana, gdy krajowe badania nad występowaniem wirusów w środowisku i wodach pitnych wykorzystują wiele laboratoriów analitycznych. Metoda 1615 Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (USEPA) została opracowana w celu zapewnienia takiego standardu pomiaru enterowirusa i norowirusa w tych wodach. Wirus jest zagęszczany z wody za pomocą filtra elektrododatniego, eluowany z powierzchni filtra ekstraktem wołowym, a następnie dalej zagęszczany za pomocą flokulacji organicznej. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół z metody 1615 dotyczący elucji filtra, stężenia wtórnego i pomiaru całkowitej liczby wirusów hodowlanych. Część skoncentrowanego eluatu z każdej próbki zaszczepia się na dziesięciu powtórzonych kolbach komórek nerkowych Buffalo Green Monkey. Liczba kolb wykazujących działanie cytopatyczne służy do ilościowego określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) jednostek zakaźnych na litr. Metoda wykorzystuje szereg kontroli jakości w celu poprawy jakości danych oraz zmniejszenia zmienności międzylaboratoryjnej i wewnątrzlaboratoryjnej. Laboratoria muszą spełniać określone standardy wydajności. Metoda 1615 została oceniona poprzez zbadanie odzyskiwania wirusa z wód odczynnikowych i wód gruntowych zasianych wirusem Sabin polio typu 3. Średnia liczba wyzdrowień wirusa polio przy całkowitym teście hodowlanym wyniosła 111% w wodzie klasy odczynnikowej i 58% w wodach gruntowych.

Wirusy skoncentrowano z wody gruntowej stanowiącej źródło dla trzech stacji uzdatniania wody pitnej oraz z jednej prywatnej studni, wykorzystując filtry elektropozytywne. Z stacji uzdatniania wody w dwóch różnych terminach pobrano dwa zestawy próbek, składające się z próbki terenowej i kontroli LFSM, natomiast z prywatnej studni pobrano jeden zestaw próbek. Całkowity odzysk wirusów określono na podstawie próbek LFSM z dwóch stacji oraz z prywatnej studni (dwie próbki z jednej stacji i jedna próbka z drugiej zostały wykluczone z obliczeń, ponieważ nie można było dokładnie określić wartości MPN dla materiału szczepionego w każdej z tych próbek ze względu na nieprawidłowe wyniki CPE w powtórzonych kolbach). Średni odzysk poliovirusów z próbek wód gruntowych wyniósł 58% przy współczynniku zmienności równym 79% (Rycina 2)16. W żadnej z powtórzonych terenowych próbek wód gruntowych, które nie były szczepione, nie wykryto wirusów zdolnych do namnażania.
Wydajność metody zmierzono również przy użyciu próbek LFB zmodyfikowanych z zastosowaniem dwóch różnych poziomów zaszczepienia. W celu oceny wydajności przy poziomach niższych niż „standardowy” poziom LFB wynoszący 500 MPN stosowany w metodzie USEPA 1615, wykorzystano „niski” miano poliovirusa wynoszące 300 MPN. Aby przetestować wydajność na poziomie kontroli LFSM, zastosowano „wysokie” miano poliovirusa wynoszące 1 000 MPN. Kontrole te wykazały podobne wyniki, ze średnim odzyskiem na poziomie 111% i współczynnikiem zmienności wynoszącym 100% (Rysunek 2). Wszystkie próbki LRB były negatywne, a wszystkie próbki LFB mieściły się w zakresie akceptowalności (materiały uzupełniające Tabela S1).
<img alt="Schemat filtracji wirusów; układ elucji: moduł kartridża, rurki, pojemnik ciśnieniowy, zlewka." src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Elucja z filtra. Przedstawiono schemat wykorzystania pojemnika ciśnieniowego do elucji z filtra kartridżowego. Dodatnie ciśnienie powietrza jest wykorzystywane do przepchnięcia roztworu ekstraktu wołowego z pojemnika ciśnieniowego przez obudowę kartridża zawierającą elektropozytywny filtr kartridżowy. Pojemnik ciśnieniowy można zastąpić pompą perystaltyczną, umieszczając wlot pompy w naczyniu z roztworem ekstraktu wołowego.
<img alt="Wykres słupkowy procentowego odzysku z słupkami błędów; ilustruje porównawcze dane dotyczące wydajności odzysku eksperymentalnego." src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Średni odzysk (%) poliovirusa z wody gruntowej i wody czystej klasy odczynnikowej. Przedstawiono średni procent odzysku poliovirusa z próbek wody gruntowej (<img alt="Obraz mikroskopowy równowagi statycznej; ΣFx=0; analiza wagi mechanicznej w badaniu materiałów." src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">; n=4) oraz wody czystej klasy odczynnikowej (<img alt="Obraz mikroskopowy tekstury czarnego materiału pokazujący szczegółową analizę wzoru powierzchni." src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4">; n=12). Dwanaście próbek wody czystej klasy odczynnikowej obejmowało sześć zaszczepionych 300 MPN oraz sześć zaszczepionych 1,000 MPN poliovirusa. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy.

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Ogólnym celem następującego protokołu jest pomiar poziomu zakaźnych cząsteczek wirusa w próbce wody. Osiąga się to poprzez zastosowanie zasadowego roztworu ekstrahującego do elucji ujemnie naładowanych cząsteczek wirusa z filtra elektropozytywnego, na którym skoncentrowano wirusy z wody pitnej lub środowiskowej. Gromadzenie wirusów na elektropozytywnym filtrze kartridżowym zostało opisane w pierwszej części tej serii.W drugim kroku powoli obniża się pH eluatu, co prowadzi do powstania kłaczków białek z ekstraktu oraz wirusa obecnego w próbce. Następnie kłaczki są zbierane poprzez wirowanie, rozpuszczane w buforze fosforanowym sodu i sterylizowane przez filtrowanie w celu usunięcia bakterii i pleśni. W dalszej kolejności końcowy skoncentrowany eluat zostaje zaszczepiony na komórki nerki zielonej małpy z Buffalo, a komórki są obserwowane pod kątem efektu cytopatycznego (CPE) przez 14 dni w celu wykrycia replikacji wirusa.Aby uwolnić wszelkie cząsteczki wirusa związane z komórkami, wszystkie kolby z komórkami są mrożone po 14 dniach lub gdy efekt cytopatyczny (CPE) w którejkolwiek kolbie osiągnie 75% lub więcej. Po drugim i trzecim pasażu w celu potwierdzenia, że CPE wynika z replikacji wirusa, używa się programu do obliczania najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN), aby określić najbardziej prawdopodobną liczbę cząsteczek na litr każdej analizowanej próbki. Ostatecznie całkowita ilość hodowlanych kwasowych komponentów wirusa zgodnie z metodą EPA 1615 dostarcza pomiaru poziomu zakaźnych cząsteczek wirusa w próbce wody.Niniejszy test całkowitej zawartości wirusów jest jedynie jednym z elementów metody EPA 1615. Pełna metoda służy do pomiaru występowania enterowirusów i norowirusów w wodach pitnych i środowiskowych. Uzyskane wyniki analiz wirusowych mogą następnie służyć jako dane wejściowe do oceny ryzyka związanego z ekspozycją na te wirusy w wodzie pitnej oraz w wodach rekreacyjnych.Główną zaletą tego protokołu jest zapewnienie jednolitego, standaryzowanego podejścia do pomiaru zawartości wirusów w wodzie. Metoda ta opiera się w rzeczywistości na metodzie Information Collection Rule opublikowanej w 1996 roku. Głównym problemem, z jakim mierzą się osoby rozpoczynające pracę z tą metodą, jest utrzymanie linii komórkowej BGM wolnej od kontaminacji oraz interpretacja CPE, czyli efektów cytopatycznych.Wraz z Shay Fout zaprezentujemy procedury elucji i flokulacji organicznej, a następnie technikę hodowli komórkowej. Aby przeprowadzić pierwszą elucję, należy wlać 500 mililitrów buforowanego ekstraktu wołowego o stężeniu 1,5% w temperaturze pokojowej i pH 9,0 do cylindra miarowego. Następnie należy otworzyć obudowę wkładu filtra i dodać odpowiednią ilość ekstraktu wołowego, aby całkowicie pokryć filtr elektropozytywny.Pozostałą część ekstraktu wołowego przelej do zlewki. Załóż pokrywę obudowy filtra. Po jednej minucie czasu kontaktu, używając pompy perystaltycznej i sterylnych przewodów, powoli przepuść przez filtr roztwór ekstraktu wołowego znajdujący się w obudowie wraz z pozostałą częścią z zlewki.Zebrać eluat do sterylnego 2-litrowego zlewki szklanej. Powtórzyć te kroki, wykorzystując dodatkowe 500 mililitrów buforowanego 1,5% ekstraktu wołowego, z zastąpieniem czasu kontaktu na 15 minut. Dodać ekstrakt wołowy z drugiej elucji do 2-litrowej zlewki zawierającej eluat z pierwszej elucji, a następnie dodać do naczynia sterylny mieszadło magnetyczne.Zlewkę zawierającą eluat należy umieścić na mieszadle magnetycznym. Włączyć mieszadło i zwiększać prędkość mieszania aż do powstania wiru. Powoli dostosować pH eluatu do wartości 3,5 ± 0,1 poprzez kroplowe dodawanie 1,2 molarnego kwasu solnego, HCl.Dodawaj kwas kroplami, ponieważ gwałtowne dodanie spowoduje inaktywację wirusa. W tym czasie eluat stanie się mętny w wyniku zaczynania się procesu wytrcania osadu. Zmniejsz prędkość mieszania do powolnego mieszania i kontynuuj monitorowanie oraz utrzymywanie pH eluatu na poziomie 3,5 ± 0,1 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie przelej zawiesinę z wytrąconego ekstraktu wołowego do jednej lub kilku butelek wirówkowych i wiruj przez 15 minut przy 2 500 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjmij butelki z wirówki i powoli zlej nadsącz, aby zapobiec utracie osadu. Nadsącz można odrzucić.W przypadku partii ekstraktu z wołowiny, które rozpuszczają się w ciągu 5 minut, należy dodać 30 mililitrów 0,15 M fosforanu sodu o pH 9,0 do butelki do wirowania zawierającej osad. W przypadku osadów, które nie rozpuszczają się w ciągu pięciu minut, należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym. Po całkowitym rozpuszczeniu osadu mieszać przez 10 minut.Następnie wyjmij mieszadło magnetyczne i odwiruj rozpuszczony precypitant przez 10 minut, przy prędkości od 4 000 do 10 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Ostrożnie przelej nadsącz do szklanego zlewki, nie naruszając osadu. Do zlewki włóż mieszadło magnetyczne, a osad odrzuć.Umieść zlewkę na mieszalce magnetycznej i mieszaj roztwór. Dodawaj kroplami 1,2 M HCl, aby dostosować pH do zakresu od 7,0 do 7,5. Przefiltruj supernatant w celu sterylizacji, przepuszczając go przez filtr sterylizacyjny z wbudowanym filtrem wstępnym, który został uprzednio potraktowany 15 ml buforowanego 1,5% ekstraktu wołowego o pH od 7,0 do 7,5.Należy zapoznać się z protokołem tekstowym, aby obliczyć objętość próbki do analizy (Assay Sample Volume), oznaczaną jako S, dla wszystkich próbek testowych. Następnie należy obliczyć objętość inokulum, dzieląc wartość S przez 10. Na podstawie tych obliczeń należy podzielić końcową objętość skoncentrowanej próbki, czyli próbki uzyskanej po sterylizacji przez filtr, na trzy podpróbki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Zaszczep 10 naczyń testowych zawierających monowarstwę komórek BGM dla każdej próbki testowej, wykorzystując objętość podpróbki pierwszej równą Objętości Inokulum, wraz z całkowitymi kontrolami testu miareczkowania wirusów zdolnych do namnażania. Dla Lab Fortified Blank oraz Lab Fortified Sample Matrix przygotuj rozcieńczenia 5-, 25- i 125-krotne, stosując podpróbkę trzecią i 0,15 M fosforan sodu o pH 7,0 do 7,5 jako rozcieńczalnik. Oprócz naczyń zaszczepionych nierozcieńczoną podpróbką pierwszą, zaszczep 10 wypłukanych naczyń z kulturą komórkową dla każdej serii rozcieńczeń, stosując Objętość Inokulum w każdym naczyniu testowym.Rozprowadź inokulum po powierzchni monowarstw komórek, przechylając naczynia w przód i w tył. Inkubuj naczynia testowe w temperaturze pokojowej przez 80-120 minut na mechanicznej platformie kołyszącej przy częstotliwości od jednej do pięciu oscylacji na minutę lub poprzez ręczne kołysanie naczyń co 15 do 20 minut, aby umożliwić adsorpcję obecnego wirusa do komórek. Następnie dodaj do naczyń testowych uprzednio ogrzane podłoże utrzymujące, a następnie inkubuj je w temperaturze 36,5 ± 1°C.Przez pierwsze trzy dni obserwuj pojawienie się efektów cytopatycznych w każdym naczyniu testowym za pomocą mikroskopu, a następnie badaj je co dwa do trzech dni aż do 14. dnia. Wszystkie naczynia testowe, w których efekty cytopatyczne przekraczają 75%, przenieś do zamrażarki ustawionej na temperaturę równą lub niższą niż -70 °C. Po zbadaniu naczyń w ostatnim dniu zamroź wszystkie pozostałe kultury oraz kontrole całkowitej ilości wirusa zdolnego do namnażania w temperaturze równej lub niższej niż -70 °C.Następnie rozmrozić wszystkie kultury i przefiltrować więcej niż 15% medium z każdego naczynia testowego z dodatnim efektem CPE, używając sterylizującego filtra o porach 0,2 mikrona. Kolejnym krokiem jest wykonanie drugiego pasażu wszystkich naczyń testowych z pierwszego pasażu przy użyciu przemytych naczyń testowych z komórkami nerek BGM. W tym celu zaszczepić nowe naczynia testowe objętością szczepionki stanowiącą 10% rozmrożonego medium ze wszystkich negatywnych naczyń testowych, a także z przefiltrowanego medium z naczyń dodatnich.Powtórz kroki wykonane podczas pierwszego pasażu, zamrażając każde naczynie testowe, które dało wynik negatywny w pierwszym pasażu, a pozytywny w drugim. Następnie przeprowadź trzeci pasaż zgodnie z opisem dla drugiego pasażu, wykorzystując wyłącznie negatywne kontrole testu oraz hodowle komórkowe, które były negatywne podczas pierwszego pasażu i pozytywne w drugim. Naczynia testowe uznaje się za pozytywne pod kątem obecności wirusa, jeśli wykazują one efekty cytopatyczne zarówno w pierwszym, jak i drugim pasażu lub, w przypadku braku efektu cytopatycznego aż do drugiego pasażu, zarówno w drugim, jak i trzecim pasażu.Użyj kalkulatora liczby najbardziej prawdopodobnej (Most Probable Number Calculator) Agencji Ochrony Środowiska USA (U.S. Environmental Protection Agency) z domyślnymi ustawieniami programu, zgodnie z protokołem tekstowym, aby obliczyć miana wirusa dla wszystkich próbek testowych. Następnie wykorzystaj uzyskane wartości dla liczby najbardziej prawdopodobnej jednostek zakaźnych na mililitr, wraz z górną i dolną granicą ufności na mililitr, aby obliczyć liczbę najbardziej prawdopodobną jednostek zakaźnych na litr oraz odpowiadające im granice ufności, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono średni procent odzysku dla poliwirusa z próbek wody gruntowej oraz wody czystością reagentowej.Średnia odzyskowalność Poliovirusa z próbek wód gruntowych wyniosła średnio 58% przy współczynniku zmienności wynoszącym 79%. W żadnej z powtórzonych, niezaszczepionych próbek wód gruntowych pobranych w terenie nie wykryto wirusa zdolnego do namnażania. Wydajność metody zmierzono również przy użyciu wzbogaconych próbek kontrolnych (Lab Fortified Blank), zmodyfikowanych poprzez zastosowanie dwóch różnych poziomów zaszczepienia. Dwanaście próbek wody czystej (reagent-grade water) obejmowało sześć próbek zaszczepionych 300 MPN jednostek zakaźnych oraz sześć próbek zaszczepionych 1 000 MPN jednostek zakaźnych Poliovirusa.Kontrole te wykazały podobne wyniki, przy średnim odzysku na poziomie 111% i współczynniku zmienności wynoszącym 100%. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie technik aseptycznych oraz dobrych praktyk laboratoryjnych w celu zapobiegania kontaminacji próbek. Należy również pamiętać, że podczas pracy z patogenami wirusowymi należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak używanie rękawiczek, przy każdym wykonywaniu tej procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak rozcieńczać wirusy i stosować filtry elektropozytywne oraz jak przeprowadzać flokulację organiczną i testy na kulturach komórkowych.Oprócz tej procedury można również przeprowadzić analizy molekularne w celu identyfikacji i wykrycia dodatkowych typów wirusów.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Metoda EPA 1615. Oznaczanie występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie metodą hodowlania i RT-qPCR. II. Oznaczanie całkowitego wirusa hodowlowego

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Wprowadzamy VacuSIP, prostą, nieinwazyjną i niezawodną metodę czystego i dokładnego punktowego pobierania próbek wody. System został opracowany i oceniony pod kątem jednoczesnego zbierania wody wdychanej i wydychanej przez dozowniki zawiesiny bentosowej in situ, w celu czystego pomiaru usuwania i wydalania cząstek stałych i rozpuszczonych związków.

VacuSIP, ulepszona metoda InEx do pomiaru in situ cząstek stałych i rozpuszczonych związków przetwarzanych przez aktywne podajniki zawiesiny

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Projekt mikrodziałki do badań nad znacznikiem 15N jest opisany tak, aby pomieścić wiele wydarzeń związanych z pobieraniem próbek roślin i gleby w sezonie. Przedstawiono procedury pobierania i przetwarzania próbek gleby i roślin, w tym protokoły mielenia i ważenia, dla analizy 15N.

Projektowanie mikrowykresów oraz przygotowanie próbek roślin i gleby do analizy 15azotu

Poznaj metodę EPA 1615 do pomiaru zakaźnych wirusów w wodzie przy użyciu hodowli komórkowej BGM i RT-qPCR. Protokół umożliwia ilościowe określenie wirusów w próbkach wody pitnej i środowiskowej.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego (Wideo) | JoVE Journal

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Przeglądaj więcej filmów