Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego
17 lutego 2015
Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.
Ogólnym celem poniższej procedury jest stworzenie mechanicznego uszkodzenia naczynia w zarodkach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez nakłucie żyły rozdętej zarodka danio pręgowanego za pomocą szpilki do minucji. Następnie hemostazę ocenia się, mierząc czas, w którym krew aktywnie wypływa z rany.
Następnie przeprowadzana jest mikroskopia poklatkowa w celu wizualizacji aspektów gojenia się ran, takich jak naprawa naczyń. Wyniki pokazują, że mechaniczne uszkodzenie naczyń krwionośnych w zarodkach danio pręgowanego może być wykorzystane do powtarzalnego pomiaru aspektów hemostazy i gojenia się ran, takich jak czas krwawienia i czas potrzebny do przywrócenia przepływu krwi. Główną przewagą tej techniki nad mysimi i innymi standardowymi modelami urazów jest to, że w zarodku danio pręgowanego stan zapalny, hemostaza i naprawa mogą być łatwo uwidocznione za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym.
Aby rozpocząć, włóż szpilkę do drobiazgów do uchwytu na szpilki i zaciśnij szpilkę za pomocą drobnych kleszczyków. Ostrożnie zegnij końcówkę szpilki, aby utworzyć lekki haczyk do manipulowania i stabilizowania zarodka podczas urazu. Użyj szczypiec półcalowych z igłami, aby zgiąć koniec półcalowej igły o rozmiarze 28 zamontowanej na strzykawce insulinowej.
Następnie przygotuj zarodki danio pręgowanego, ustawiając pary lęgowe i zbierając jaja w wodzie z jajami, jak pokazano wcześniej. Gdy zarodki osiągną osiem do 24 godzin po zapłodnieniu lub HPF, dodaj PTU do wody jajecznej, aby zapobiec melonowi po dwóch dniach. Po zapłodnieniu lub DPF użyj cienkich kleszczyków do usunięcia powłoki zarodków, znieczul zarodki przy użyciu końcowego stężenia 0,02% buforowanej triki, aby mechanicznie uszkodzić zarodkowe naczynia krwionośne.
Użyj pipety transferowej, aby umieścić znieczulone zarodki na szkiełku depresyjnym. Opierając się na mikroskopie preparacyjnym z krótką, płaską stroną igły strzykawkowej w ręce dominującej, ustaw zarodek na boku z powierzchnią brzuszną skierowaną w stronę przeciwną do igły. Teraz umieść szpilkę minucji z końcówką skierowaną bezpośrednio na brzuszną powierzchnię ryby za otworem moczowo-płciowym.
Trzymaj go pod niewielkim kątem, aby zakrzywiona końcówka była w stanie przebić się przez perydermę bezpośrednio do żyły rozpieszczonej. Następnie za pomocą igły strzykawkowej manipuluje zarodkiem. Użyj szpilki do minucji, aby przekłuć żyłę rozpieszczoną, wkłuwając zarodek w szpilkę, aby lekko zaczepić szpilkę w żyle za pomocą igły strzykawki.
Odciągnij zarodek od szpilki do drobiazgów, aby utworzyć małe rozdarcie w naczyniu. Udana kontuzja spowoduje natychmiastowe krwawienie z żyły. Do tej procedury wybieraj tylko zarodki z widocznie krążącymi krwinkami.
Mając szpilkę do drobiazgów na miejscu, wyciągnij ją z naczynia, a gdy tylko będzie można zobaczyć utratę krwi z rany, uruchom minutnik Gdy utrata krwi z rany ustaje, zatrzymaj minutnik i zapisz całkowity czas jako czas krwawienia, jeśli krzepnięcie jest zahamowane, zapisz czas, w którym nie ma już widocznie krążących komórek. Przenieś zwierzęta po urazie do naczyń obrazowych ze szklanym dnem w celu mikroskopii i usuń większość wody z jaj, a następnie za pomocą 0,3 do 1,2% niskotopliwych aeros uzupełnionych 0,02% trica i podgrzanych do temperatury od 42 do 45 stopni Celsjusza. Przykryj zarodki.
Użyj kleszczy, aby ułożyć zarodki na bokach. Po ostygnięciu aro napełnij naczynie 0,02% trica w wodzie jajecznej. Użyj fluorescencji epi w jasnym polu lub mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy po obrazowaniu.
Użyj kleszczy, aby przenieść zarodki z powrotem do wody z jaj. Ten film pokazuje mechaniczne uszkodzenie naczynia, które zostało wykonane na zarodku PF 2D. Można zaobserwować aktywną utratę krwi, po której następuje ustanie krwawienia, co skutkuje szybką i niezawodną reakcją krzepnięcia, mierzoną czasem do ustania krwawienia, w celu określenia, czy można zmierzyć różnice w odpowiedzi krzepnięcia.
Antykoagulant odyny podawano zarodkom przez wstrzyknięcie do przewodu QVA bezpośrednio przed zranieniem. Jak pokazano tutaj, lek znacznie wydłużył czas krwawienia w porównaniu z kontrolą pojazdu. Na tym filmie dowody uszkodzenia naczyń krwionośnych i krzepnięcia można zobaczyć natychmiast po urazie przy użyciu linii transgenicznych dla markerów śródbłonka i czerwonych krwinek.
Obrazy były rejestrowane co pięć minut przez okres 12 godzin, pokazując różne etapy gojenia się rany. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak spowodować uraz mechaniczny u zarodków zebry.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę wywoływania mechanicznego uszkodzenia naczynia w embrionach rybek danio-zebrafish. Ten model uszkodzenia stanowi platformę do badania hemostazy, stanu zapalnego związanego z urazem oraz gojenia ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
- Hemostaza
Wstęp
- Zarodki rybek zebrafish stanowią cenny model do badania uszkodzeń naczyniowych.
- Mikroskopia w czasie rzeczywistym umożliwia szczegółową obserwację procesów biologicznych.
- Zrozumienie hemostazy i gojenia ran jest kluczowe dla badań medycznych.
- Mechaniczne uszkodzenie naczynia można wywołać w sposób kontrolowany.
Cel badania
- Aby stworzyć powtarzalny model mechanicznego uszkodzenia naczynia.
- Aby ocenić hemostazę i stan zapalny w embrionach rybek danio.
- Aby zwizualizować procesy gojenia ran za pomocą mikroskopii poklatkowej.
Zastosowane metody
- Nakłuwanie żyły ogonowej embrionów danio pręgowanego za pomocą mikroigły.
- Pomiar czasu trwania aktywnego krwawienia z rany.
- Przeprowadzenie mikroskopii poklatkowej w celu obserwacji naprawy naczynia.
- Analiza czasu krwawienia oraz przywrócenia przepływu krwi.
Główne wyniki
- Model ten umożliwia powtarzalny pomiar hemostazy.
- Mikroskopia poklatkowa pozwala na skuteczną wizualizację gojenia ran.
- Procesy zapalne i naprawcze mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym.
- Technika ta oferuje liczne zalety w porównaniu do tradycyjnych modeli zwierzęcych.
Wnioski
- Model zarodka danio-ostrobramkowego jest skuteczny w badaniu uszkodzeń naczyniowych.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym dostarcza informacji na temat hemostazy i naprawy tkanek.
- Metoda ta może zwiększyć zrozumienie procesów związanych z urazami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mechaniczne uszkodzenie naczyń w embrionach danio-ostrobramkowego stanowi powtarzalną platformę do obrazowania w czasie rzeczywistym, służącą do badania hemostazy i naprawy naczyniowej w kontekście całego organizmu. Model ten wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad zakrzepicą i gojeniem ran, umożliwiając ilościowy pomiar dynamiki krwawienia i regeneracji naczyń. Przezroczystość optyczna oraz podatność genetyczna pozwalają na bezpośrednią wizualizację odpowiedzi komórkowych, co zwiększa pewność prognostyczną w programach wczesnego odkrywania leków.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w szlakach hemostazy poprzez kontrolowane uszkodzenie naczyniowe i monitorowanie tworzenia się skrzepu w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez pomiar czasu krwawienia oraz kinetyki naprawy naczyń w embrionach podatnych na modyfikacje genetyczne.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia prekliniczne ograniczanie ryzyka związanego z przeciwzakrzepowymi lub prohemostatycznymi związkami dzięki powtarzalnym i mierzalnym odczytom fenotypowym.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na generowanie ustandaryzowanych, powtarzalnych modeli uszkodzeń, odpowiednich do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków wpływających na krzepliwość krwi lub integralność naczyniową.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, w tym czas krwawienia oraz czas do przywrócenia przepływu krwi, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność i ponowne wykorzystanie: Jest kompatybilny z mikroskopią poklatkową oraz transgenicznymi liniami reporterowymi, co pozwala na wielokrotne zastosowanie w kampaniach przesiewowych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje procesy uszkodzeń naczyniowych u ludzi, wspierając translacyjne odkrywanie biomarkerów w zakresie hemostazy i zakrzepicy.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając obserwację stanu zapalnego, stabilizacji skrzepu i regeneracji śródbłonka w czasie rzeczywistym.
- Decyzje w oparciu o analizę ryzyka: Dostarcza wglądu w mechanizmy, które pomagają w podejmowaniu decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnej fazie opracowywania terapii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w obszarach terapeutycznych hematologii i naczyniowo-krążenia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników krzepnięcia i mechanizmów naprawy naczyniowej poprzez kontrolowane uszkodzenia oraz obrazowanie w czasie rzeczywistym.
- Przesiew: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów służących do oceny wpływu związków na hemostazę i gojenie ran.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty czasowe (czas krwawienia, powrót przepływu), które wspierają analizę porównawczą w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi dzięki konserwowanej biologii naczyniowej i wizualizacji procesów naprawczych w czasie rzeczywistym.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku dla wielu projektów z zakresu zakrzepicy, stanów zapalnych i biologii naczyniowej dzięki swojej adaptacyjności oraz kompatybilności z technikami obrazowania.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanizmu hemostazy dzięki bezpośredniej obserwacji.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom indukowania urazu oraz mierzalnym punktom końcowym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne ograniczanie ryzyka w przypadku związków o potencjalnym działaniu szkodliwym dla układu naczyniowego lub hematologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając danych mechanistycznych na temat wiązania z celem oraz modulacji szlaku sygnałowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio przeżebrodym, mikrochirurgii oraz technik obrazowania żywych organizmów.
- Zależne od narzędzi mikroprzepływowych lub systemów immobilizacji oraz wysokorozdzielczych systemów mikroskopowych (pola jasnego, fluorescencyjnych, konfokalnych).
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w zakresie etapowania embrionów, spójności urazów i pomiaru punktów końcowych.
- Kwestie adaptacyjne obejmują wybór linii transgenicznych do znakowania śródbłonka lub linii krwiotwórczych oraz protokoły dawkowania przeciwkrzepliwości.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozmiar embrionów ograniczający przepustowość oraz konieczność ścisłej kontroli temperatury podczas obrazowania.
