Name: Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia w zarodkach Danio rerio do badania hemostazy i gojenia ran. Technika umożliwia wizualizację procesów zapalnych oraz naprawy naczyń w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Stephenowi Wilsonowi i Lisie Wilsbacher za pomocne dyskusje. Prace te były częściowo wspierane przez NIH HL054737.

UWAGA: Procedury z użyciem danio zebranego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF.
1. Przygotowanie narzędzi
<ol>
	<li>Włóż szpilkę minucji do uchwytu kołka i clamp kołek.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie zegnij końcówkę szpilki, aby utworzyć lekki haczyk.</li>
	<li>W celu manipulacji i stabilizacji zarodka podczas urazu, zegnij koniec igły o średnicy 28 cali i średnicy 1/2 cala zamontowanej na strzykawce insulinowej za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do zranienia
<ol>
	<li>Ustaw pary hodowlane danio pręgowanego i zbieraj jaja w wodzie z jaj (60ug/ml soli akwariowych), jak pokazano wcześniej22.</li>
	<li>Dodaj 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do wody jajowej, gdy zarodki są około 8 godzin po zapłodnieniu (hpf), aby zapobiec melanizacji.</li>
	<li>Dechorionacja zarodków dwa dni po zapłodnieniu (dpf) przed eksperymentem za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. 
	UWAGA: Zarodki mogą zostać uszkodzone w dowolnym momencie po rozpoczęciu krążenia. Przedstawione tutaj dane dotyczą zarodków o zawartości 2 dpf, ale technika ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku zarodków o zawartości do 5 dpf.</li>
	<li>Znieczulić zarodki 0,02% buforowanym kwasem 3-aminobenzoesowym (Trikainą) na około 10 minut przed manipulacjami.</li>
</ol>
3. Mechaniczne uszkodzenie naczyń krwionośnych zarodków
<ol>
	<li>Przenieś znieczulone zarodki do szkiełka depresyjnego na stereomikroskopie preparacyjnym za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Używając krótkiej, płaskiej strony igły strzykawki do manipulowania zarodkiem ręką dominującą, ustaw zarodek na boku z powierzchnią brzuszną skierowaną w stronę przeciwną do igły.</li>
	<li>Umieść szpilkę minucji z końcówką skierowaną bezpośrednio na brzuszną powierzchnię ryby za otworem moczowo-płciowym. Umieść szpilkę minucji pod niewielkim kątem, tak aby zakrzywiona końcówka była w stanie przebić się przez perydermę bezpośrednio do żyły ogonowej (ryc. 1).</li>
	<li>Używając igły strzykawki do manipulowania zarodkiem, przebij żyłę ogonową szpilką do minucji, wbijając zarodek w szpilkę, aby lekko zaczepić szpilkę w żyle.</li>
	<li>Za pomocą igły strzykawki odciągnij zarodek od szpilki do drobnych drobiazgów, aby utworzyć małe rozdarcie w naczyniu. 
	UWAGA: Udana kontuzja spowoduje natychmiastowe krwawienie z żyły.</li>
</ol>
4. Analiza hemostazy
<ol>
	<li>Do tej procedury wybieraj tylko zarodki z widocznie krążącymi krwinkami.</li>
	<li>Przygotuj się do uruchomienia stopera, gdy tylko szpilka minucji zostanie wyciągnięta z naczynia.</li>
	<li>Uruchom stoper, gdy tylko będzie można uwidocznić utratę krwi z rany. Gdy utrata krwi z rany ustanie, zatrzymaj stoper i zapisz całkowity czas jako czas krwawienia. Jeśli krzepnięcie jest zahamowane, należy zanotować czas, do którego nie ma już widocznie krążących krwinek.</li>
</ol>
5. Analiza gojenia się ran
<ol>
	<li>Przenieś zwierzęta po urazie na naczynia obrazowe ze szklanym dnem w celu mikroskopii.</li>
	<li>Usuń większość wody z jajka</li>.
	<li>Przykryj zarodki 0,3-1,2% niskotopliwą agarozą rozpuszczoną w wodzie jajecznej, podgrzaną do temperatury od 42 do 45 ºC i uzupełnioną 0,02% trikainy.</li>
	<li>Ułóż zarodki na boku za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Po ostygnięciu agarozy napełnij naczynie 0,02% trikainy w wodzie jajecznej.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopii jasnego pola, epifluorescencji lub konfokalnej.</li>
	<li>Usuń zarodek z agarozy za pomocą kleszczy i przenieś z powrotem do wody jajecznej.</li>
</ol>

<ol><li>Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGore%2C+AV+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22">Cold Spring Harb Perspect Med</a>. 2 (5), a006684(2012).</li>
<li>Boatman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+hematopoiesis+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Assaying hematopoiesis using zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).</li>
<li>Ellett, F., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+organism+to+study+development+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model organism to study development of the immune system.</a> Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).</li>
<li>Lieschke, G. J., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fish immunology.</a> Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound repair.</a> Semin Immunol. , (2014).</li>
<li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-inflicted+injury+of+zebrafish+embryonic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (71), e4351(2013).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).</li>
<li>Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibrinogen+in+zebrafish+results+in+symptoms+consistent+with+human+hypofibrinogenemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia.</a> PLoS One. 8 (9), e74682(2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+zebrafish+antithrombin+III+triggers+disseminated+intravascular+coagulation+and+thrombosis%2C+revealing+insight+into+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemophilia+model+in+zebrafish%3A+analysis+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis.</a> Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+genetic+model+for+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis.</a> J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev Biol. 7, 48(2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).</li>
<li>Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fibrin+formation+and+platelet+and+endothelial+cell+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).</li>
<li>Bielczyk-Maczynska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+screen+of+identified+genome-wide+association+study+Loci+reveals+new+genes+controlling+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Danio pręgowany był z powodzeniem stosowany jako model różnych rodzajów ran, w tym urazów laserowych13-15, zakrzepicy wywołanej laserem16 i zranień nabłonka10. Opisujemy metodę mechanicznego zranienia, która jest prosta do wykonania i powoduje kontrolowane uszkodzenie w modelu in vivo , który jest wysoce podatny na mikroskopię w czasie rzeczywistym. Uraz powoduje szybką i mierzalną odpowiedź hemostatyczną oraz powtarzalny program naprawy ran, który można monitorować za pomocą mik...

Danio pręgowany był szeroko wykorzystywany do badania różnych tematów z zakresu biologii naczyniowej, w tym rozwoju naczyń, angiogenezy oraz rozwoju i patologii hematopoetycznej1-3. Zarodki rozwijają funkcjonalne krążenie, a także leukocyty i inne składniki wrodzonego układu odpornościowego do 1 dnia po zapłodnieniu (dpf) 1,4,5. Zachowanie odpowiedzi zapalnej i leukocytów na uraz sprawiło, że zarodek danio pręgowanego stał się modelem informacyjnym dla tak różnych procesów zapalnych, jak zakażenie gruźlicą, zapalenie jelit i regeneracja tkanek6-9. Zarodki danio pręgowanego wykorzystano do badania stanu zapalnego związanego z urazem, szczególnie w kontekście zranień nabłonka i odpowiedzi neutrofili10,11. Uszkodzenie zarodka powoduje wysoce konserwatywną odpowiedź komórkową komórek w miejscu uszkodzenia i wrodzonych komórek odpornościowych zrekrutowanych do reagowania na uraz i regulowania jego rozdzielczości11,12. Inne modele urazów wykorzystywały skupione impulsy laserowe do przestrzennej lokalizacji uszkodzeń określonych typów komórek, w tym neuronów, komórek mięśniowych i kardiomiocytów13-15. 
Zarodki danio pręgowanego były używane jako model do badania hemostazy i zakrzepicy w warunkach farmakologicznej i genetycznej manipulacji, wykorzystując zarówno mechaniczne, jak i indukowane laserem tworzenie skrzepliny16-19. Składniki kaskady krzepnięcia wydają się być dobrze zachowane, a transgeniki pozwoliły na szczegółowe badania odkładania się trombocytów i fibryny w miejscu krzepnięcia17,20,21. Procedura przedstawiona w niniejszej pracy uzupełnia te metody, dostarczając system do badania mechanicznych uszkodzeń naczyń prowadzących do przerwania naczynia, powstania i ustąpienia skrzepliny oraz naprawy naczynia.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Średnica końcówki 0,0125 mm, średnica pręta 0,1 mm</td></tr><tr><td>Uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszczyki z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Szklana zjeżdżalnia depresyjna</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>Wstępnie podgrzany do 42 &ordm; C</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-aminobenzoesowy (Trikaina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do obrazowania ze szklanym dnem</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Sole akwariowe Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin strzykawka z igłą 28,5 G</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) okazały się potężnym modelem do badania różnych procesów rozwojowych i chorobowych. Rozwój zewnętrzny i przezroczystość optyczna sprawiają, że zarodki te są szczególnie podatne na mikroskopię, a dostępne są liczne linie transgeniczne, które znakują określone typy komórek białkami fluorescencyjnymi, co czyni zarodek danio pręgowanego idealnym systemem do wizualizacji interakcji komórek naczyniowych, krwiotwórczych i innych podczas urazu i naprawy in vivo. Genetyka do przodu i do tyłu u danio pręgowanego jest dobrze rozwinięta, a manipulacja farmakologiczna jest możliwa. Opisujemy model mechanicznego uszkodzenia naczyń krwionośnych przy użyciu technik mikromanipulacji, który wykorzystuje kilka z tych cech do badania reakcji na uszkodzenie naczyń, w tym hemostazy i naprawy naczyń krwionośnych. Korzystając z połączenia mikroskopii wideo i timelapse, wykazaliśmy, że ta metoda uszkodzenia naczyń krwionośnych powoduje mierzalne i powtarzalne reakcje podczas hemostazy i gojenia się ran. Metoda ta zapewnia system do szczegółowego badania uszkodzeń i napraw naczyń krwionośnych w całym modelu zwierzęcym.

Mechaniczne uszkodzenie naczyń przeprowadzono na embrionach w 2 dpf (Rysunek 2A-C). Uszkodzenie prowadzi do szybkiej i powtarzalnej odpowiedzi krzepnięcia, mierzonej jako czas do zatrzymania krwawienia (Rysunek 2D). Aby ustalić, czy można zmierzyć różnice w odpowiedzi krzepnięcia, embrionom podano przeciwzakrzepowy hirudyn poprzez wstrzyknięcie do przewodu Cuviera bezpośrednio przed zranieniem (5-10 nl hirudyny o stężeniu 1 jednostki na µl rozpuszczonej w wodzie) (demons...

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest wywołanie mechanicznego uszkodzenia naczynia w embrionach zebrafish. Jest to osiągane poprzez nakłucie żyły ogonowej embrionu zebrafish za pomocą cienkiej igły. Następnie oceniana jest hemostaza poprzez pomiar czasu aktywnego wypływu krwi z rany.Następnie przeprowadza się mikroskopię time-lapse, aby zwizualizować aspekty gojenia ran, takie jak regeneracja naczyń. Wyniki pokazują, że mechaniczne uszkodzenie naczyń u zarodków danio pręgowanego może być wykorzystane do powtarzalnego pomiaru aspektów hemostazy i naprawy ran, takich jak czas krwawienia oraz czas potrzebny na przywrócenie przepływu krwi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z myszami i innymi standardowymi modelami uszkodzeń jest to, że w zarodku danio pręgowanego stan zapalny, hemostaza i naprawa mogą być łatwo wizualizowane za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym.Na początek wsuń szpilkę entomologiczną do uchwytu i zaciśnij ją za pomocą precyzyjnej pęsety. Ostrożnie zegnij końcówkę szpilki, aby utworzyć niewielki haczyk służący do manipulowania i stabilizacji embrionu podczas zadawania urazu. Użyj szczypiec z wąskim nosem, aby zegnąć końcówkę igły o rozmiarze 28 gauge i długości 1/2 cala, zamontowanej na strzykawce insulinowej.Następnie należy przygotować zarodki danio pręgowanego poprzez utworzenie par hodowlanych i zebranie ikry do wody do jaj, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Gdy zarodki osiągną wiek od 8 do 24 godzin po zapłodnieniu (HPF), do wody do jaj należy dodać PTU, aby zapobiec pigmentacji w drugim dniu po zapłodnieniu (DPF). Używając precyzyjnej pęsety, należy usunąć otoczki chorionowe z zarodków, a następnie znieczulić je, stosując końcowe stężenie 0,02% buforowanego tricainu, aby mechanicznie uszkodzić naczynia krwionośne zarodka.Za pomocą pipety transferowej przenieś znieczulone embriony na przedmiotowe szkiełko z wgłębieniem. Opierając się o mikroskop sekcyjny i trzymając w dominującej ręce krótką, płaską stronę igły strzykawki, ułóż embrion na boku tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana w stronę przeciwną do igły. Następnie ustaw szpilkę entomologiczną tak, aby jej czubek był skierowany bezpośrednio w stronę powierzchni brzusznej ryby, za otworem urogenitalnym.Trzymaj go pod niewielkim kątem, tak aby zakrzywiona końcówka mogła przebić perydermę bezpośrednio do żyłki kokonowej. Następnie użyj igły strzykawki do manipulowania zarodkiem. Wykorzystaj szpilkę precyzyjną do przebicia żyłki kokonowej, lekko wbijając zarodek w szpilkę, aby za pomocą igły strzykawki delikatnie wpiąć szpilkę w żyłkę.Odsuń zarodek od pinu precyzyjnego, aby wywołać niewielkie przerwanie naczynia. Prawidłowe uszkodzenie spowoduje natychmiastowy krwotok z żyły. Do tej procedury wybierz tylko zarodki z widocznie krążącymi komórkami krwi.Po umieszczeniu pinu do minutii wyciągnij go z naczynia i w momencie, gdy zauważysz utratę krwi z rany, uruchom stoper. Gdy krwawienie z rany ustanie, zatrzymaj stoper i zapisz całkowity czas jako czas krwawienia; jeśli krzepnięcie jest zahamowane, zapisz czas, w którym nie są już widoczne krążące komórki. Przenieś zwierzęta po urazie do szkiełek przedmiotowych z dnem szklanym do obrazowania mikroskopowego, usuń większość wody z jaj i następnie przykryj embriony niskotopliwym agarozą w stężeniu od 0,3 do 1,2%, uzupełnioną o 0,02% trica i podgrzaną do temperatury od 42 do 45 °C.Użyj pęsety, aby ułożyć zarodki na boku. Po ochłodzeniu aro wypełnij płytkę 0,02% trica w wodzie do jaj. Do wykonania obrazowania po sesji użyj mikroskopii epi-fluorescencyjnej w świetle jasnym lub mikroskopii konfokalnej.Używając pęsety, przenieś zarodki z powrotem do wody jajowej. W tym filmie przedstawiono mechaniczne uszkodzenie naczynia wykonane na zarodku 2D PF. Widoczna jest aktywna utrata krwi, po której następuje ustąpienie krwawienia; uszkodzenie prowadzi do szybkiej i niezawodnej odpowiedzi krzepnięcia, mierzonej jako czas do ustąpienia krwawienia, aby ustalić, czy można zmierzyć różnice w odpowiedzi krzepnięcia.Przeciwzakrzepowy lek odin został podany embrionom poprzez wstrzyknięcie do przewodu QVA bezpośrednio przed zranieniem. Jak pokazano tutaj, lek znacznie wydłużył czas krwawienia w porównaniu z kontrolą nośnika. W tym filmie, dzięki zastosowaniu linii transgenicznych z markerami komórek śródbłonka i erytrocytów, można zaobserwować dowody uszkodzenia naczyń oraz krzepnięcia bezpośrednio po urazie.Obrazy były pozyskiwane co pięć minut przez okres 12 godzin, ukazując różne etapy gojenia rany. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać uraz mechaniczny u embrionów rybek zebra.

mechanical-vessel-injury-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Obrażenia mechaniczne naczyń u zarodków danio rzeczki (Zebrafish)

Przedstawiona tutaj metoda obejmuje precyzyjne uszkadzanie żywych zarodków rybek danio (*zebrafish*) za pomocą wysokenergetycznych impulsów laserowych oraz późniejszą analizę tych obrażeń i ich regeneracji w czasie. Pokazujemy również, w jaki sposób można śledzić pojedyncze lub grupy genetycznie znakowanych komórek mięśni szkieletowych podczas i po uszkodzeniu indukowanym światłem laserowym.

Laserowe uszkodzenie szkieletowej muskulatury embrionów danio-ostrolepnego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest szczegółowe opracowanie nowatorskiej metody oceny segmentalnej funkcji serca u embrionalnych ryb danio pręgowanych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Analiza przemieszczenia mechanicznej deformacji mięśnia sercowego (DIAMOND) ujawnia segmentalną heterogeniczność funkcji serca u embrionalnego danio pręgowanego

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Ten protokół przedstawia metodę szczepienia magnetycznego koralika do rozwijającego się serca danio pręgowanego za pomocą mikrochirurgii, umożliwiając manipulowanie siłami mechanicznymi in vivo i wywołując mechaniczny, zależny od bodźca napływ wapnia do komórek wsierdzia.

Manipulowanie siłami mechanicznymi w rozwijającym się sercu danio pręgowanego za pomocą kulek magnetycznych

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia w zarodkach Danio rerio do badania hemostazy i gojenia ran. Technika umożliwia wizualizację procesów zapalnych oraz naprawy naczyń w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów