Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów fluorescencyjnych w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluorem czwórką lub konwencjonalnych przeciwciał. Osiąga się to poprzez pierwsze podanie fluoru w bliskiej podczerwieni, czterech znakowanych przeciwciał specyficznych dla antygenu i konwencjonalnych przeciwciał myszom z dodatnimi, jak i ujemnymi ksenoprzeszczepami zarówno antygenowymi, jak i ujemnymi. Drugim krokiem jest wykonanie obrazowania in vivo.

Po zobrazowaniu myszy są poświęcane w celu usunięcia ksenoprzeszczepów, które są przetwarzane do analiz ex vivo. Ostatecznie cytometria przepływowa ex vivo i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do walidacji wyników obrazowania in vivo. Przewagą tej metody nad istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie jądrowe, jest to, że zastosowanie barwnika fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni pozwala na kompleksowe porównanie obrazowania multimodalnego in vitro, in vivo i ex vivo za pomocą jednej sondy do cytometrii przepływowej, mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania nowotworów, takie jak lokalizacja przerzutów podczas operacji i monitorowanie skuteczności terapii przeciwnowotworowych. Znakowanie przeciwciał siłą fluoru pozwala na dokładne ilościowe określenie ex vivo przeciwciał związanych z komórkami. Pozwala nam to rozróżnić, czy konkretne pojedyncze osoby, które widzimy in vivo, są spowodowane przeciwciałami, związanymi z antygenami powierzchniowymi komórek, czy niespecyficzne ze względu na tak zwany efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji.

Siedem do dziewięciu dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, kiedy guzy powinny mieć około ośmiu milimetrów średnicy. Przygotowany do obrazowania myszy najpierw nałóż maść okulistyczną i zainicjuj system obrazowania. Następnie umieść znieczulone myszy na podgrzanej scenie z guzami skierowanymi do kamery.

Utrzymuj od 1 do 2% fluoru ISO przez cały czas procedury obrazowania, korzystając z kolektora izofluorowego umieszczonego w komorze obrazowania. Monitoruj częstość oddechów. Jeśli którykolwiek z nich jest zbyt szybki, znieczulenie jest zbyt lekkie, a jeśli jest powolne lub nieregularne, znieczulenie jest zbyt głębokie.

Następnie zobrazuj myszy po uzyskaniu obrazu bazowego. Wstrzyknąć myszom 50 mikrogramów LOR sześciu 80 znakowanych konstruktów przeciwciał. Zrób to w objętości 200 mikrolitrów soli fizjologicznej do żyły ogonowej.

Po obrazowaniu należy poddać mysz eutanazji i przymocować ją do bloku styropianowego i oczyścić 70% etanolem. Następnie rozetnij skórę, aby odsłonić guzy. Usuń guzy skalpelem i utrzymuj guzy w stanie nienaruszonym.

Po usunięciu przetnij guzy na pół i przenieś jedną połowę do naczynia z roztworem P-B-S-A-E-B-S-F na ICE w celu analizy faksowej, a drugą połowę przenieś do dwukrotnie zimnego, 4% PFA do immunohistochemii. Po 24 godzinach w utrwalaczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś guzy do PBS z 30% sacharozą i utrzymuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż całkowicie zanurzą się w roztworze. Następnie pokrój guzy w kostkę na kawałki, które zmieszczą się w foremkach kriogenicznych.

Wypełnij foremki związkiem OCT i przenieś kawałki guza do foremek. Tkanka musi być całkowicie zanurzona w OCT. Następnie przenieś formy kriogeniczne do suchego lodu, a gdy całkowicie się zamrozą, przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą mogły zostać przetworzone.

Aby przygotować komórki, przenieś połowę guza do komórki, sitko w sitku. Pokrój go na trzy do czterech części, a następnie wyjmij tłok z dwumililitrowej strzykawki i użyj tłoka, aby rozgnieść tkankę o sitko. Zebrać roztwór, który przepływa przez sitko Po rozgnieceniu tkanek przepłukać sitko PBS.

Następnie przenieś zebraną zawiesinę do nowej probówki i wiruj ją z prędkością 500 G przez pięć minut. Zawieszamy osad komórkowy w 10 mililitrach PBS z 0,2% BSA. Następnie policz komórki, podnieś od jednej do 5 milionów komórek chłoniaka do pięciomililitrowej rurki faksowej i odkręć probówkę do 500 G i odrzuć supernatant.

Następnie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS z 0,2% BSA. W tym momencie możliwe jest zablokowanie FCR za pomocą przeciwciała do wiązania FC gamma R. Odczekaj 10 minut i przemyj komórki raz PBS z 0,2% BSA. Teraz dodaj przeciwciało monoklonalne anty CD 45, aby zidentyfikować leukocyty.

Inkubować komórki przez 20 minut w ciemności z tym przeciwciałem, a następnie użyć dwóch płukań, aby je usunąć tuż przed analizą faksową. Barwić komórki jodkiem propidyny przez 15 minut na lodzie, aby zidentyfikować martwe komórki. Następnie umyj je do czysta zwykłym PBS.

Następnie Resus zawiesza ogniwa w 150 mikrolitrach PBS i postępuje zgodnie z faktami. Myszom wstrzyknięto 50 mikrogramów nanociała i przeciwciała monoklonalnego w celu oceny swoistości fluorescencyjnie znakowanych konstruktów. Do obrazowania in vivo.

Wszystkie obrazowania wykonano sześć godzin po wstrzyknięciu. Analiza cytometryczna zawiesin komórek nowotworowych wykazała specyficzne znakowanie komórek nowotworowych dodatnich antygenowo z obydwoma koniugatami AF 60. Nie stwierdzono niespecyficznego znakowania komórek antygenowo-ujemnych żadnym z konstruktów.

Guza. Sekcje kriogeniczne wykazały silne i prawie jednorodne znakowanie komórek antygenowo-dodatnich za pomocą nanociała. Jednak przeciwciało monoklonalne dawało znacznie słabszy w jednorodnym zabarwieniu zgodnie z oczekiwanym antygenem.

Guzy ujemne nie wykazywały barwienia antygenu przeciwciała, guzy ujemne wykazywały niespecyficzne rozproszone barwienie w przestrzeni śródmiąższowej po wstrzyknięciu konwencjonalnego przeciwciała. Było to bardzo podobne do sceny barwienia antygenu. Dodatnie guzy po wstrzyknięciu konwencjonalnego przeciwciała Po opanowaniu.

Część obrazowania w tej technologii można wykonać w ciągu jednego dnia Po wykonaniu tej procedury. Inne metody, takie jak znakowanie radiowe nanociał, można przeprowadzić w celu zbadania biodystrybucji wstrzykniętych koniugatów w różnych tkankach lub innych pytań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić multimodalną walidację ex vivo swojego doświadczenia z obrazowaniem fluorescencyjnym in vivo w bliskiej podczerwieni za pomocą sondy znakowanej fluorem cztery.

W ten sposób uzyskujemy technikę oceny nowych konstruktów przeciwciał do przedklinicznego obrazowania molekularnego.