Name: Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj precyzyjne pomiary izotopów cynku w narządach myszy metodą chromatografii jonowej i spektrometrii masowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy transportu cynku oraz diagnozować choroby związane z jego nieprawidłowym gospodarowaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FM dziękuje za finansowanie z ANR poprzez chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, INSU poprzez grant PNP, Institut Universitaire de France, a także program Labex UniverEarth na Sorbonie Paris Cité (ANR-10-LABX-0023 i ANR-11-IDEX-0005-02). Dziękujemy również za dofinansowanie z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach programu ramowego Wspólnoty Europejskiej H2020/umowy o grant ERBN #637503 (Pristine).

UWAGA: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) na Université Paris Diderot.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przegotować 1 l kwasów (HNO3, HBr) w celu oczyszczenia ich z zanieczyszczeń.</li>
	<li>Zlewki i łącznik końcówki należy czyścić w gorącej (~ 100 °C) stężonej kąpieli kwasowejHNO3 przez co najmniej dwa dni.</li>
	<li>Myj końcówki pipet w zimnej kąpieli 3 N HNO3 przez kilka dni i spłucz pojedynczo trzy razy wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Znieczulij myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Oceń znieczulenie metodą szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Pobrać krew przez nakłucie serca w obecności heparyny w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Oddzielić osocze od komórek krwi przez odwirowanie (10 min, 1 500 x g) i przenieść osocze do polipropylenowych fiolek kriogenicznych za pomocą polipropylenowych końcówek.</li>
	<li>Usuń pozostałą krew z narządów, przecinając żyłę wątrobową i wstrzykując DPBS przez serce. Oceń śmierć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Zbierz narządy za pomocą sterylnych narzędzi ze stali nierdzewnej, uwolnij je od otaczającego tłuszczu, jeśli taki istnieje, i zamroź je w polipropylenowych fiolkach kriogenicznych.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie chemiczne
<ol>
	<li>Najpierw rozpuścić próbki w mieszaninie ~ 1 ml stężonego (30%)H2O2i ~ 1 ml stężonego (~ 15 M) HNO3. Wykonaj wszystkie te czynności wewnątrz dygestorium.
	<ol>
		<li>Umieść cały interesujący nas narząd w zlewce teflonowej o pojemności 15 ml. Następnie dodaćH2O2/HNO3 do zlewki5. Pozostawić zlewkę otwartą przez kilka minut, aby uniknąć rozprysków spowodowanych reakcją utleniania materii organicznej i uwalniania CO2 .</li>
		<li>Na koniec umieścić zlewkę na płycie grzewczej o temperaturze około 100 °C na kilka godzin lub do momentu, gdy roztwór będzie idealnie klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otworzyć zlewkę i osuszyć roztwór na płycie grzejnej w temperaturze około 100 °C.</li>
	<li>Gdy próbka wyschnie, dodać do próbek 1 ml 1,5 N HBr; zamknąć zlewkę i pozostawić ją do rozpuszczenia na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez kilka godzin.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj kolumny o pojemności 500 μl.
	<ol>
		<li>Dodaj 500 μl żywicy siatkowej AG1X8 200-400 do kolumny i umieść ją na stojaku kolumny, a pod nią znajduje się zlewka na śmieci. Żywicę przemyć na przemian: 5 ml wody o mocy 18,2 MΩ ⋅ cm, 5 ml 0,5 N HNO3, 5 ml wody, 5 ml 0,5 N HNO3, a następnie 5 ml wody. Kondycjonować żywicę w 5 ml 1,5 N HBr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij zlewki z płyty grzejnej i umieść je w kąpieli ultradźwiękowej na około 30 minut, a następnie pozwól zlewkom ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Po schłodzeniu zlewki i umyciu żywicy otwórz zlewkę. Umieścić łącznik końcówki w strzykawce, dodać końcówkę do pipety; Odpipetować 1 ml próbki i naładować ją na żywicę (bardzo powoli, aby nie mieszać żywicy).</li>
	<li>Gdy cała ciecz przejdzie przez kolumnę, dodać 5 ml 1,5 N HBr.</li>
	<li>Po przepuszczeniu 5 ml 1,5 N HBr przez kolumnę, zastąpić zlewkę na śmieci czystą zlewką o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodawać jednorazowo 5 ml 0,5 N HNO3 po 2,5 ml. Na tym etapie Zn jest eluowany z żywicy.</li>
	<li>Gdy 5 ml HNO3 przejdzie przez kolumnę, wyjąć zlewkę i umieścić ją na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z uchwytu kolumny; wyrzuć żywicę (użyj nowej żywicy do każdej próbki).</li>
	<li>Po wyschnięciu próbki powtórzyć protokół z tą samą objętością kwasów w mniejszej kolumnie (100 μl), a następnie umieścić ją na gorącej płycie do momentu wysuszenia. Próbka jest teraz gotowa do spektrometrii mas.</li>
</ol>
4. Pomiar spektrometrii mas
<ol>
	<li>Analiza składu izotopowego Zn na spektrometrze mas z wieloma kolektorami sprzężonymi indukcyjnie (MC-ICP-MS).
	<ol>
		<li>Należy użyć parametrów maszyny podsumowanych w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić kubki Faradaya tak, aby zbierały o masie (m/z) 62Ni, 63Cu, 64Zn, 65Cu, 66Zn, 67Zn i 68Zn.</li>
	<li>Przygotować roztwór zawierający 500 ppb Zn w 0,1 M HNO3 do analizy izotopowej.</li>
	<li>Przeanalizować roztwór Zn o stężeniu 500 ppb, używając komory rozpylania połączonej z nebulizatorem teflonowym o stężeniu 100 μl/min. Dla każdej próbki należy zmierzyć 30 skanów (1 blok po 30 cykli), w których czas integracji każdego skanu wynosi 8,389 sek.</li>
	<li>Skorygować tło, odejmując natężenia zera w szczycie od roztworu próby ślepej (0,1 M roztworu HNO3 użytego do ponownego rozpuszczenia próbek).</li>
	<li>Kontrolować i korygować możliwe zakłócenia izobaryczne 64Ni poprzez pomiar intensywności piku 62Ni. Załóżmy, że stosunek 64Ni/62Ni jest naturalny (0,2548), skoryguj tę wartość z instrumentalnego odchylenia masy, a następnie usuń 64Ni z masy 64 jako: 
	Rozdział 64Znreal= 64Znzmierzone - 64Ni = 64Znzmierzone - (64Ni/62Ni)naturalne x 62Nizmierzone.</li>
	<li>Skorygować instrumentalne odchylenie masy, biorąc w nawias każdą z próbek roztworem wzorcowym 500 ppb standardu JMC Lyon Zn (lub innego dostępnego wzorca, takiego jak IRMM-3702). Przeprowadzić bracketing wzorcowy, dzieląc stosunek 66Zn/64Zn próbki przez średnią stosunku 66Zn/64Zn dwóch wzorców zmierzonych przed i po próbce minus 1 i pomnożonych przez 1 000 (patrz równanie 1). Typowa precyzja zewnętrzna w standardzie JMC Lyon Zn wynosi 0,05 permil/amu (2 odchylenia standardowe, 2 s.d.).</li>
</ol>

<ol><li>Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+analysis+of+copper+and+zinc+isotopic+compositions+by+plasma-source+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Geology%22%5BJournal%5D)">Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry.</a> Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).</li>
<li>Marechal, C. N., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+fractionation+of+copper+and+zinc+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).</li>
<li>Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+discrimination+of+zinc+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Isotopic discrimination of zinc in higher plants.</a> New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).</li>
<li>Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotopic+fractionation%3A+why+organic+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Zinc isotopic fractionation: why organic matters.</a> Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).</li>
<li>Moynier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+fractionation+and+transport+mechanisms+of+Zn+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Geology%22%5BJournal%5D)">Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants.</a> Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).</li>
<li>Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+composition+of+zinc%2C+copper%2C+and+iron+in+lunar+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).</li>
<li>Moynier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+fractionation+of+zinc+in+tektites%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Planet.+Sci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotopic fractionation of zinc in tektites.</a> Earth Planet. Sci. Lett. 277 (3-4), 482-489 (2009).</li>
<li>Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotope+fractionation+during+magmatic+differentiation+and+the+isotopic+composition+of+the+bulk+Earth%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Planet.+Sci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth.</a> Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).</li>
<li>Moeller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+new+certified+materials+ERM-AE633+and+ERM-AE6447+for+copper+and+IRMM+3702+for+zinc+isotope+amount+ratio+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Geostd.+Geoan.+Res%22%5BJournal%5D)">Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination.</a> Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).</li>
<li>Bigeleisen, J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+equilibrium+constants+for+isotopic+exchange+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions.</a> J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).</li>
<li>Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn+and+Cu+isotopic+variations+in+chondrites+and+iron+meteorites%3A+Early+solar+nebula+reservoirs+and+parent-body+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).</li>
<li>Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Search+for+70Zn+Anomalies+in+Meteorites%5BTitle%5D)+AND+%22Astrophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites.</a> Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).</li>
<li>Paniello, R., Day, J., Moynier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn+isotope+evidence+for+the+origin+of+the+Moon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zn isotope evidence for the origin of the Moon.</a> Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).</li>
<li>Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotope+variations+in+deep-sea+carbonates+from+the+eastern+equatorial+Pacific+over+the+last+175+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+and+Planetary+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka.</a> Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).</li>
<li>Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+of+natural+Zn+isotopes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice.</a> Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).</li>
<li>Balter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bodily+variability+of+zinc+natural+isotope+abundance+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Com.+Mass.+Spec%22%5BJournal%5D)">Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep.</a> Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).</li>
<li>Balter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Cu%2C+Fe%2C+and+Zn+isotopic+patterns+in+organs+and+body+fluids+of+mice+and+sheep%2C+with+emphasis+on+cellular+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation.</a> Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).</li>
<li>Urgast, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotope+ratio+imaging+of+rat+brain+thin+sections+from+stable+isotope+tracer+by+LA-MC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS.</a> Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).</li>
<li>Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+measurements+of+iron+isotopes+by+SIMS%3A+MC-ICP-MS+intercalibration+and+application+to+a+magnetite+crystal+from+the+Gunflint+chert%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Geol%22%5BJournal%5D)">In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert.</a> Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).</li>
<li>Fietzke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boron+isotope+ratio+determination+in+carbonates+via+LA-MC-ICP-MS+using+soda-lime+glass+standards+as+reference+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Atom.+Spec%22%5BJournal%5D)">Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material.</a> J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powtarzalność pomiarów jest oceniana poprzez powtórzone analizy tych samych próbek przeprowadzone podczas różnych sesji analitycznych. Na przykład6, odtworzyliśmy tę samą skałę ziemską 7 razy i uzyskaliśmy wyniki przedstawione w Tabeli 2.
Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z teorii frakcjonowania izotopowego10 i zmierzonymi w dowolnym materiale Układu Słonecznego (np. meteoryt11-13, rośliny3-5, osady głębinowe14...

Pomiar składu stabilnego izotopu o wysokiej precyzji (lepiej niż 100 ppm/jednostkę masy atomowej) jest możliwy dopiero od około 15 lat dzięki rozwojowi spektrometrów masowych z wieloma kolektorami plazmy i od tego czasu jest głównie stosowany w naukach o Ziemi i planetach. Zastosowania w medycynie są nowatorskie i mają duży potencjał jako biomarkery chorób, które modyfikują metabolizm (np. choroba Alzheimera). W artykule przedstawiono metodę pomiaru z dużą precyzją naturalnych stabilnych proporcji izotopów w różnych narządach myszy. To samo miałoby zastosowanie do próbek pobranych przez ludzi. Metoda polega na rozpuszczeniu narządów, chemicznym oczyszczeniu z pozostałych atomów, a następnie analizie stosunku izotopów na spektrometrze masowym.
Jakość pomiarów izotopowych Zn zależy od jakości chemicznego oczyszczania (czystość Zn, niska ślepa próba w porównaniu do ilości Zn obecnej w próbce, wysoka wydajność chemiczna procedury) oraz od kontroli błędu instrumentalnego. Wysoka czystość końcowej frakcji Zn jest potrzebna do usunięcia zarówno zakłóceń izobarycznych, jak i nieizobarycznych, które tworzą efekt matrycy. Nuklidy izobaryczne wytwarzają bezpośrednie zakłócenia (np. 64Ni). Interferencje nieizobaryczne generują tzw. efekt "matrycy" i zmieniają precyzję analityczną pomiarów poprzez zmianę warunków jonizacji w stosunku do wzorca czystego, do którego porównuje się próbki do1. Niska ślepa próba (< 10 ng) wskazuje, że nie ma zanieczyszczenia próbek zewnętrznym Zn, który mógłby zniekształcić mierzony skład izotopowy. Ponieważ izotopy Zn mogą być frakcjonowane podczas chromatografii jonowymiennej2, zebranie wszystkich atomów Zn zapewnia, że nie zachodzi frakcjonowanie izotopowe, co oznacza, że procedura chemiczna powinna mieć pełną wydajność. Wreszcie, korekta instrumentalnego frakcjonowania izotopowego podczas pomiaru spektrometrii mas odbywa się za pomocą metody "standardowego bracketingu".
Dlatego główne trudności w uzyskaniu precyzyjnych pomiarów to kontrolowanie zewnętrznego zanieczyszczenia (np. niska ślepa próba), wytwarzanie pełnego oczyszczania chemicznego, które jest czyste od jakichkolwiek innych atomów lub cząsteczek, oraz korygowanie instrumentalnego frakcjonowania izotopowego na spektrometrze masowym. W tym artykule opiszemy nasz protokół analityczny do oddzielenia Zn od narządów myszy, a także pomiary spektrometrii mas.
Ekstrakcja odbywa się przy użyciu małej ilości rozcieńczonych kwasów (pożywki HBr/HNO3) na mikrokolumnach (0,5 μl i 0,1 μl) żywicy anionowymiennej. Charakteryzuje się pełną wydajnością, a pomiary mają odtwarzalność zewnętrzną lepszą niż 50 ppm przy stosunku 66Zn/64Zn. Kolejną zaletą metody jest to, że jest bardzo szybka. Metoda jest więc bardzo dobrze przystosowana do nauk medycznych, w których trzeba analizować dużą liczbę próbek w porównaniu z naukami o Ziemi, gdzie te metody analityczne zostały opracowane.

<table><tbody><tr><td>Wielokolekcyjny spektrometr mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica anionowymienna AG1 X8 200-400</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1443-MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki teflonowe</td><td>Savillex&nbsp;</td><td>200-015-12</td><td></td></tr><tr><td>Własne kolumny teflonowe z teflonu</td><td></td><td></td><td></td> termokurczliwego</tr></tbody></table>

precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Przedstawiamy procedurę do precyzyjnego pomiaru proporcji izotopów w narządach myszy. składa się z 5 stabilnych izotopów (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn i 70Zn), które są naturalnie frakcjonowane między narządami myszy. Najpierw pokazujemy, jak rozpuścić różne narządy, aby uwolnić atomy Zn; ten etap jest realizowany przez mieszaninę HNO3 i H2O2. Następnie oczyszczamy atomy ze wszystkich innych pierwiastków, w szczególności z zakłóceń izobarycznych (np. Ni), za pomocą chromatografii anionowymiennej w rozcieńczonym środowisku HBr/HNO3. Te pierwsze dwa etapy są wykonywane w czystym laboratorium przy użyciu chemikaliów o wysokiej czystości. Na koniec, proporcje izotopów są mierzone za pomocą spektrometru mas z wieloma kolektorami sprzężonymi indukcyjnie plazmą, w niskiej rozdzielczości. Próbki są wstrzykiwane za pomocą komory rozpylania, a frakcjonowanie izotopowe indukowane przez spektrometr mas jest korygowane poprzez porównanie stosunku próbek do stosunku wzorca (standardowa technika braketingu). Ta pełna typowa procedura daje stosunek izotopów o odtwarzalności 50 ppm (2 s.d.).

W 1,5 N HBr główny gatunek cynku (ZnBr3-) tworzy bardzo silne kompleksy z żywicą anionowymienną, podczas gdy większość pozostałych pierwiastków nie oddziałuje z żywicą. Cynk jest następnie odzyskiwany poprzez zmianę medium na rozcieńczony HNO3, co zmienia specjację Zn na Zn2+, który zostaje uwolniony z żywicy6,7.
Stosunki izotopowe są zazwyczaj wyrażane jako odchylenia na 1 000 części względem standardu:
<img alt="Wzór na stosunek iz...

Prezentujemy technikę pomiaru z dużą precyzją proporcji izotopów w narządach myszy.

Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest precyzyjny pomiar stosunków izotopów cynku w narządach myszy. Jest to osiągane poprzez uprzednie rozpuszczenie poszczególnych organów w kwasach w celu uwolnienia wszystkich atomów do roztworu, a następnie usunięcie zanieczyszczeń; wysuszony materiał jest ponownie zawieszany w bromku wodoru. Następnie stosuje się chromatografię jonowymienną w celu oczyszczenia cynku z pozostałych pierwiastków próbki przy użyciu przygotowanej kolumny grawitacyjnej. Cynk jest eluowany z żywicy za pomocą kwasu azotowego.Ostatnim krokiem jest pomiar stosunków izotopów cynku przy użyciu spektrometru mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie z wielokanałowym detektorem. Ostatecznie skład izotopowy jest wykorzystywany do diagnozowania chorób modyfikujących równowagę cynku w organizmie poprzez pomiar rozkładu równowagowego izotopów cynku w różnych narządach. Zatem metoda ta została opracowana, aby dostarczyć wglądu w naturalny rozkład i mechanizmy transportu cynku między narządami myszy.Metodę tę można zastosować u każdego zwierzęcia i docelowo wykorzystać do diagnozowania chorób zmieniających równowagę poziomu cynku między organami, takich jak choroba Alzheimera. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania materiałów i próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym; prace nad oczyszczaniem chemicznym należy prowadzić w dygestorium, przygotowując mieszaninę około 1 ml 30% nadtlenku wodoru oraz około 1 ml stężonego kwasu azotowego. Cały badany organ należy umieścić w teflonowym zlewce o pojemności 15 ml.Następnie przenieś mieszaninę do zlewki. Pozostaw zlewkę otwarta przez kilka minut, aby uniknąć rozprysków spowodowanych reakcją utleniania materii organicznej i wydzielaniem dwutlenku węgla. Na koniec umieść zlewkę na płycie grzewczej w temperaturze około 100 °C na kilka godzin lub do momentu, aż roztwór stanie się całkowicie klarowny.Następnie należy otworzyć zlew i odparować roztwór na płycie grzejnej w temperaturze około 100 °C. Po wysuszeniu próbki do niej dodaje się 1 ml bromku wodoru. Należy zamknąć zlew i pozostawić go na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez kilka godzin w celu rozpuszczenia.W międzyczasie należy przygotować kolumny 500 µL. Do kolumny należy dodać 500 µL żywicy Ag one x 8 200 400 mesh, a następnie umieścić ją w statywie do kolumn nad zlewkiem na odpady. Żywicę należy przemyć, naprzemiennie stosując 5 mL wody o rezystywności 18,2 MΩ·cm oraz 5 mL 0,5 N kwasu azotowego (dwukrotnie), a następnie przemyć 5 mL wody.Na koniec zakondycjonuj żywicę pięcioma mililitrami bromku wodoru. Następnie zdejmij zlewkę z płyty grzejnej i umieść ją w kąpieli ultradźwiękowej. Pozostaw zlewkę przez około 30 minut, aby ostygła do temperatury pokojowej. Gdy zlewka ostygnie, a żywica zostanie przemyta, otwórz zlewkę.Załóż adapter do końcówek na strzykawkę i zamocuj końcówkę do pipety. Następnie pobierz pipetą 1 ml próbki i wprowadź ją na żywicę bardzo powoli, aby nie zaburzyć jej struktury. Po przejściu całego płynu przez kolumnę dodaj 5 ml bromku wodoru.Pozwól bromkowodorowi przepłynąć przez kolumnę, a następnie zastąp zlew odbiorczy czystym zlewkiem o pojemności 15 ml. Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu azotowego, partiami po 2,5 ml. Na tym etapie cynk zostanie wypłukany z żywicy.Gdy kwas azotowy przepłynie przez kolumnę, należy wyjąć zlew i umieścić go na płycie grzewczej w temperaturze 100 °C do całkowitego wysuszenia. Należy wyjąć kolumnę z uchwytu i usunąć żywicę. Po wysuszeniu próbki należy powtórzyć protokół z użyciem tej samej objętości kwasów na mniejszej kolumnie 100 µL, a następnie umieścić ją na płycie grzewczej do wysuszenia.Próbka jest teraz gotowa do spektrometrii mas. Przeanalizuj skład izotopowy cynku za pomocą wielodetektorowego spektrometru mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie. Skonfiguruj urządzenie, korzystając z parametrów podsumowanych w protokole tekstowym.Ustaw puchary Faradaya tak, aby zbierały sygnały dla stosunków masy do ładunku niklu 62, miedzi 63, cynku 64, miedzi 65, cynku 66, cynku 67 oraz cynku 68. Następnie przeanalizuj roztwór cynku o stężeniu 500 ppb w 0,1 M kwasie azotowym, wykorzystując komorę rozpylania połączoną z teflonowym nebulizatorem o wydajności 100 µL/min. Dla każdej próbki wykonaj 30 skanów, przy czym czas całkowania każdego skanu wynosi 8,389 s.Skoryguj tło poprzez odjęcie intensywności zerowych w szczycie od kontroli z roztworem ślepym oraz skoryguj ewentualną interferencję izobaryczną niklu 64. Poprzez pomiar intensywności piku niklu 62 przyjmij, że stosunek niklu 64 do niklu 62 jest naturalny. Skoryguj tę wartość o instrumentalny błąd masy, a następnie usuń nikiel 64 z masy 64 zgodnie z opisem w protokole tekstowym; skoryguj instrumentalny błąd masy, otaczając każdą z próbek roztworem standardowym JMC Leon Zinc o stężeniu 500 ppb. Pokazano.Poniżej przedstawiono typowe wyniki uzyskane tą metodą w formie wykresu trzech izotopów Delta Zinc 68 względem Delta Zinc 66. W przypadku różnych organów wszystkie punkty układają się wzdłuż linii o nachyleniu dwa. Wskazuje to, że frakcjonowanie izotopowe jest zależne od masy, a organy myszy są izotopowo odrębne.Co ciekawe, erytrocyty i kości są wzbogacone w delta Zinc 66 w porównaniu z surowicą, mózgiem i wątrobą. To frakcjonowanie jest dobrze wyjaśnione przez równowagowy rozkład izotopów pomiędzy różnymi środowiskami wiązań cynku w różnych organach. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić wysokoprecyzyjne pomiary izotopowe cynku w organach myszy.Należy pamiętać, że główną trudnością jest uniknięcie zanieczyszczenia próbki zewnętrznym cynkiem, dlatego niezbędne jest prowadzenie prac w czystym laboratorium oraz stosowanie odczynników chemicznych o wysokiej czystości.

high-precision-zinc-isotopic-measurements-applied-to-mouse-organs

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Precyzyjne pomiary izotopowe cynku zastosowane do narządów myszy

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Tutaj opisujemy protokół znakowania radioaktywnego i testowania in vivo pochodnych chelatu tetrazyny tridentate 99mTc(I) do wstępnego celowania i chemii bioortogonalnej.

Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mTc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Hodowlane pierwotne lub ustalone linie komórkowe są powszechnie używane do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych i mechanistycznych jako wstępne podejście przed użyciem modeli zwierzęcych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować ekstrakty z całych komórek i frakcje subkomórkowe do badań (Zn) i innych pierwiastków śladowych za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji.

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej 68Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

Poznaj precyzyjne pomiary izotopów cynku w narządach myszy metodą chromatografii jonowej i spektrometrii masowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy transportu cynku oraz diagnozować choroby związane z jego nieprawidłowym gospodarowaniem.

Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

Przeglądaj więcej filmów