Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie metylacji CpG w wybranych regionach zainteresowania w genomowym DNA wyizolowanym z tkanek lub komórek. Cel ten osiąga się poprzez zaprojektowanie specyficznych dla konwersji siarczynowej starterów PCR, które pozwalają na amplifikację regionów zainteresowania z genomowego DNA poddanego konwersji siarczynowej. W drugim kroku następuje amplifikacja regionu zainteresowania po konwersji siarczynowej, a następnie z otrzymanych amplikonów generowane są biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Następnie biblioteki są sekwencjonowane, a do analizy generowane są pliki FASTQ. W ostatnim etapie odczyty z sekwencjonowania są dopasowywane do referencyjnej sekwencji docelowej przekonwertowanej pirosiarczynem, a procentowa zawartość 5mc jest obliczana. Ostatecznie sekwencjonowanie amplikonów po konwersji siarczynowej lub BS-AS może zostać przeprowadzone w celu precyzyjnego i dokładnego określenia stopnia metylacji CpG w dowolnym regionie zainteresowania u dowolnego organizmu modelowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie metodą Sangera, jest to, że BS-AS zapewnia dokładne i precyzyjne ilościowe oznaczanie metylacji CpG w sposób szybki i wysokoprzepustowy, co daje możliwość analizy wielu regionów w dużej liczbie próbek.

Po zidentyfikowaniu celu i zaprojektowaniu starterów, przygotuj mieszaninę reakcyjną w celu optymalizacji amplifikacji pojedynczego amplikonu, a następnie szczelnie zamknij płytkę PCR folią termozgrzewalną, aby zwizualizować amplikony za pomocą elektroforezy żelowej. Następnie nałóż do odpowiednich dołków 30 µL reakcji PCR lub markera wielkości, a potem prowadź elektroforezę przy napięciu 200 V przez około 45 minut. Gdy pierwszy barwnik dotrze do końca żelu, zatrzymaj reakcję, a następnie pokryj cały żel świeżo przygotowanym roztworem bromku etydyny w stężeniu 5 µg/mL.

Po pięciu minutach należy obrazować żel za pomocą transluminatora UV przy długości fali wzbudzenia 482 nanometrów. Wykorzystaj drabinę wielkości, aby określić rozmiar produktów PCR (AMPLICONS) w celu ustalenia specyficzności reakcji. Poszukaj wielu prążków poza oczekiwanym rozmiarem produktu, aby określić średnią wielkość wykrytych pików biblioteki oraz oszacować molarność.

Następnie analizuj biblioteki na chipie do elektroforezy kapilarnej do wyznaczania wielkości DNA, stosując wysokoczuły zestaw do analizy DNA zgodnie z instrukcjami producenta. W celu ilościowego oznaczenia bibliotek metodą qPCR, użyj starterów zaprojektowanych przeciwko sekwencjom adapterów w wygenerowanych bibliotekach oraz standardów o znanym stężeniu na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, stosując ustawienia kwantyfikacji absolutnej zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie, wykorzystując wielkość bibliotek oraz ilościowe oznaczenie molarne z qPCR, oblicz stężenia molarne bibliotek. Po sekwencjonowaniu zaimportuj skompresowane pliki fastQ do odpowiedniego potoku analizy sekwencjonowania, wybierz opcję importu, a następnie wybierz metodę sekwencjonowania użytą do wygenerowania odczytów, aby zachować wartości Q-score dla aplikacji do przycinania odczytów. Zaimportuj odpowiednie skompresowane pliki odczytów fastQ, a następnie w opcjach ogólnych odznacz opcję odrzucania wyników jakościowych.

Wybierz lokalizację dla zaimportowanych odczytów i kliknij finish. Następnie w sekcji NGS core tools wybierz trim sequences. Zaznacz odczyty do przycięcia, pozostawiając jedynie te, które posiadają wyniki Q 30 lub wyższe.

Następnie wybierz opcję przycinania według wyników jakości (trim using quality scores) i ustaw limit na 0,001. Aby dodatkowo wybrać tylko odczyty zawierające nie więcej niż jeden niejednoznaczny nukleotyd, zaznacz opcję przycinania niejednoznacznych nukleotydów (trim ambiguous nucleotides) i ustaw maksymalną liczbę niejednoznaczności na jeden.

Następnie należy wybrać lokalizację zapisu przyciętych odczytów i kliknąć przycisk zakończenia, aby zmapować przycięte odczyty do referencyjnego genu przekonwertowanego *in silico* za pomocą siarczynów. W sekcji NGS core tools należy wybrać opcję map reads. W polu reference należy wskazać przycięte odczyty do zmapowania i kliknąć next.

Następnie w sekcji maskowania referencji (reference masking) należy wybrać przekonwertowaną sekwencję referencyjną i zaznaczyć opcję braku maskowania (no masking). Kliknij następny (next), a następnie przypisz wartość trzy dla niedopasowań (mismatches), insercji (insertions) i delecji (deletions). Przypisz wartość jeden dla minimalnej frakcji długości odczytu zmapowanej do referencji (minimum fraction of read length map to the reference), a w sekcji obsługi niedokładnych dopasowań (nonspecific match handling) przypisz wartość 0,9 dla minimalnej frakcji tożsamości między mapą, odczytem a referencją (minimum fraction of identity between the map, read and reference), wybierz zignoruj (ignore) i kliknij Następny (Next) w opcjach wyjściowych (output options).

Następnie wybierz opcję Create standalone read mappings. Następnie w sekcji result handling kliknij save. Wybierz lokalizację zapisu mapowania odczytów i kliknij finish, aby uruchomić wywoływanie wariantów (variant calling) dla zmapowanych odczytów.

W analizie ponownego sekwencjonowania (re-sequencing analysis) zaznacz detekcję wariantów o niskiej częstotliwości (low frequency variant detection) i wybierz mapowanie odczytów do analizy. Kliknij następny, a następnie w parametrach wariantów o niskiej częstotliwości wprowadź 0,01% i kliknij następny. W filtrach ogólnych ustaw minimalne pokrycie na 1000, aby zapewnić głębokość sekwencjonowania większą lub równą 1000 x.

Na koniec kliknij „next”, a następnie w opcjach wyjściowych (output options) wybierz „create annotated table” i wskaż lokalizację zapisu pliku z tabelą wariantów, kliknij „finish” i wykorzystaj częstotliwości wariantów w adnotowanych miejscach CPG w obszarze zainteresowania z pliku tabeli wariantów, aby obliczyć częstotliwość metylacji cytozyny w referencyjnej cytozynie w kontekście CG; odczyty z sekwencjonowania amplikonów siarczynowych prawidłowo dopasowane do skonwertowanej sekwencji referencyjnej będą przypominać te przedstawione na rycinie. Dinukleotydy CPG można wyraźnie zidentyfikować, a stany metylacji można oszacować, obserwując odczyty zasad w miejscach CPG. W zmapowanych odczytach 0% metylacji spowoduje, że zmapowane odczyty będą zawierać tyminę zmapowaną do miejsc CPG.

Kontrole 100% metylacji będą skutkować zmapowanymi odczytami zawierającymi cytosyny zmapowane do miejsc CPG. W tym eksperymencie RNA i DNA zostały współizolowane z móżdżku i siatkówki myszy. Następnie, zgodnie z oczekiwaniami, zmierzono za pomocą QPCR ekspresję opsyn wykazującą selektywną ekspresję w tkance siatkówki.

RNA opsyny wykryto wyłącznie w siatkówce po ilościowym oznaczeniu poziomu metylacji CpG w regionie promotora opsyny za pomocą sekwencjonowania amplikonów po konwersji pirosiarczynowej. Jednak skumulowany poziom metylacji w obrębie regionu promotora wynosił ponad 80% w móżdżku, w porównaniu do mniej niż 15% w siatkówce. Ilościowe oznaczenie metylacji metodą BSAS pozwala na analizę metylacji w konkretnych miejscach, co umożliwia porównanie poziomu metylacji dla poszczególnych sekwencji CpG w dowolnym regionie genomu.

Rzeczywiście, w tym eksperymencie stwierdzono, że poziomy metylacji CpG w obrębie promotora opsyny były znacząco wyższe w próbkach z móżdżku w porównaniu do próbek z siatkówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić metylację CpG w wybranych regionach zainteresowania w genomicznym DNA wyizolowanym z tkanek lub komórek.