Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji
24 lutego 2015
Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie metylacji CPG w docelowych regionach zainteresowania z genomowego DNA, wyizolowanego z tkanki lub komórek będących przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez pierwsze zaprojektowanie starterów PCR specyficznych dla siarczynów w celu amplifikacji obszarów zainteresowania z genomowego DNA przekształconego przez bisiarczyny. W drugim kroku amplifikowany jest obszar zainteresowania przekształcony w bi-siarczyn, a z konspektów amplikonów generowane są biblioteki sekwencjonowania nowej generacji lub NGS.
Następnie biblioteki są sekwencjonowane i generowane są pliki FASTQ do analizy. W ostatnim kroku odczyty sekwencjonowania są dopasowywane do referencyjnej sekwencji docelowej przekształconej przez bi-siarczyn, a pięć procent mc oblicza się ostatecznie za pomocą sekwencjonowania amplikonów siarczynów lub BS można przeprowadzić w celu precyzyjnego i dokładnego ilościowego określenia metylacji CPG w dowolnym regionie zainteresowania z dowolnego organizmu modelowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie Sangera, jest to, że BS A S zapewnia dokładną i precyzyjną kwantyfikację metylacji CPG w szybki sposób o wysokiej przepustowości, zapewniając możliwość oznaczania wielu regionów w dużej liczbie próbek.
Po zidentyfikowaniu celu i zaprojektowaniu startera, zmontuj reakcję w celu optymalizacji amplifikacji docelowej pojedynczego amplikonu, a następnie uszczelnij płytkę PCR folią zgrzewaną, aby uwidocznić amplikony za pomocą elektroforezy stronicowej. Następnie załaduj odpowiednie studzienki 30 mikrolitrami reakcji PCR lub drabiny, a następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez około 45 minut. Gdy pierwszy barwnik dotrze do końca żelu, należy zatrzymać reakcję, a następnie pokryć cały żel pięcioma mikrogramami na mililitr świeżo przygotowanego bromku AUM.
Po pięciu minutach zobrazuj żel za pomocą transluminatora UV o długości fali wzbudzenia 482 nanometrów. Użyj drabinki, aby zwymiarować amplikony PCR, aby określić swoistość reakcji. Poszukaj wielu pasm innych niż oczekiwany rozmiar amplikonu, aby określić średni rozmiar wykrytych pików biblioteki i oszacowanie molowości.
Następnie uruchom biblioteki na chipie do wymiarowania DNA do elektroforezy kapilarnej z testem DNA o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta. Aby określić ilościowo biblioteki za pomocą QPCR. Używaj starterów zaprojektowanych dla sekwencji adapterów w wygenerowanych bibliotekach i standardach o znanym stężeniu na instrumencie czasu rzeczywistego, używając bezwzględnych ustawień kwantyfikacji zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie użyj rozmiaru bibliotek i ilościowej ilości molowców z QPCR, aby obliczyć stężenia molowe bibliotek. Po sekwencjonowaniu zaimportuj spakowane szybkie pliki Q do odpowiedniego potoku analizy sekwencjonowania, wybierz opcję importuj, a następnie wybierz metodę sekwencjonowania używaną do generowania odczytów, aby zachować wyniki Q dla aplikacji do przycinania odczytu. Zaimportuj odpowiednie spakowane pliki szybkiego odczytu Q, a następnie w obszarze Opcje ogólne usuń zaznaczenie opcji Odrzuć wyniki jakości.
Wybierz lokalizację importowanych odczytów i kliknij przycisk Zakończ. Następnie w obszarze Narzędzia podstawowe NGS wybierz sekwencje przycinania. Zaznacz odczyty, które mają zostać przycięte, zachowując tylko te odczyty, które zawierają wyniki większe lub równe Q 30.
Następnie wybierz przycinanie za pomocą wyników jakości i ustaw limit na 0,001. Aby dalej wybierać tylko stroiki zawierające mniej lub równe jednemu niejednoznacznemu nukleotydowi. Wybierz opcję Przytnij niejednoznaczne nukleotydy i ustaw maksymalną liczbę niejednoznaczności na jeden.
Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać przycięte odczyty, i kliknij przycisk Zakończ, aby zmapować przyciętą res do odniesienia do genu in silico przez konwersję siarczynów. W obszarze Narzędzia podstawowe NGS wybierz pozycję odczyty mapy. Aby się odwołać, wybierz przycięte odczyty, które mają zostać zmapowane, a następnie kliknij przycisk Dalej.
Następnie w obszarze Maskowanie odwołań wybierz przekonwertowaną sekwencję odwołań i wybierz opcję Brak maskowania. Kliknij przycisk Dalej, a następnie przypisz wynik trzy dla niezgodności, wstawień i usunięć. Przypisz wynik jeden dla minimalnego ułamka mapy długości odczytu do odwołania i przypisz wynik 0,9 dla minimalnego ułamka tożsamości między mapą, odczytem i odwołaniem w obszarze obsługi dopasowań niespecyficznych, wybierz, zignoruj i kliknij przycisk Dalej w obszarze opcji wyjściowych.
Następnie wybierz pozycję Utwórz autonomiczne mapowania odczytu. Następnie w obszarze Obsługa wyników kliknij przycisk Zapisz. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać mapowanie odczytu, a następnie kliknij przycisk Zakończ, aby uruchomić wariant wywołujący zmapowane odczyty.
W obszarze analiza ponownego sekwencjonowania wybierz wykrywanie wariantu niskiej częstotliwości i wybierz mapowanie odczytu, które ma być analizowane. Kliknij Dalej, a następnie w polu Parametr wariantu niskiej częstotliwości wprowadź 0,01% i kliknij Dalej. W obszarze filtry ogólne ustaw minimalne pokrycie na 1000, aby upewnić się, że sekwencja znajduje się na głębokości większej lub równej 1000 x.
Na koniec kliknij przycisk Dalej, a następnie w obszarze Opcje wyjściowe wybierz opcję Utwórz tabelę z adnotacjami i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik tabeli wariantów, kliknij przycisk Zakończ i użyj częstości wariantów w miejscach CPG z adnotacjami w regionie zainteresowania z pliku tabeli wariantów, aby obliczyć częstość metylacji cytozyny w cytozynie referencyjnej w kontekście CG przez sekwencjonowanie amplikonów siarczynowych, odczyty prawidłowo wyrównane do przekonwertowanej sekwencji referencyjnej będą podobne do zilustrowanych na rysunku. Dinukleotydy CPG można wyraźnie zidentyfikować, a stany metylacji można oszacować, obserwując wywołania zasad w miejscach CPG. W zmapowanych odczytach 0% metylacji spowoduje zmapowane odczyty zawierające tyminę zmapowaną do miejsc CPG.
100% kontrola metylacji spowoduje zmapowanie odczytów zawierających cytozyny zmapowane do miejsc CPG. W tym eksperymencie RNA i DNA zostały wspólnie wyizolowane z myszy, móżdżku i siatkówki. Ekspresję opsyny selektywnie wyrażaną w tkance siatkówki mierzono następnie za pomocą QPCR zgodnie z oczekiwaniami
.RNA opsyny wykryto tylko w siatkówce po ilościowym określeniu poziomów metylacji CPG w regionie promotora opsyny za pomocą sekwencjonowania amplifikacji bisiarczynów. Jednak skumulowane poziomy metylacji w całym regionie promotora były większe niż 80% w móżdżku w porównaniu do mniej niż 15% w siatkówce. Kwantyfikacja metylacji B SAS korzysta z kwantyfikacji metylacji specyficznej dla miejsca, umożliwiając porównanie poziomów metylacji na podstawie specyficznej dla CPG w dowolnym regionie genomu.
Rzeczywiście, w tym eksperymencie stwierdzono, że poziomy metylacji CPG w promotorze opsyny są znacznie wyższe w próbkach móżdżku w porównaniu z próbkami siatkówki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo metylację CPG w docelowych regionach zainteresowania z genomowego DNA, wyizolowanego z tkanek lub komórek.
Przegląd
Sekwencja amplikonów bisulfitowych (BSAS) to technika stosowana do ilościowego określania metylacji cytozyny w określonych regionach genomu. Ta metoda łączy konwersję bisulfitową z amplifikacją PCR i sekwencjonowaniem nowej generacji, aby osiągnąć precyzyjne ilościowe określenie metylacji.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Genomika
- Biologia molekularna
- Epigenetyka
Tło
- BSAS pozwala na analizę wzorców metylacji DNA.
- Jest szczególnie przydatny do badania regulacji i ekspresji genów.
- Metoda zapewnia możliwość przetwarzania dużej liczby próbek.
- Oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie Sangera.
Cel badania
- Dokładne ilościowe określenie metylacji CPG w docelowych regionach genomu.
- Poprawa rozumienia regulacji epigenetycznej w różnych kontekstach biologicznych.
- Ułatwienie analizy metylacji w różnych organizmach modelowych.
Zastosowane metody
- Projektowanie specyficznych primerów PCR do amplifikacji docelowej.
- Amplifikacja przekonwertowanego bisulfitem DNA genomowego.
- Generacja bibliotek NGS z amplikonów PCR.
- Sekwencja i analiza wynikowych plików FASTQ.
Główne wyniki
- Skuteczna ilościowa ocena poziomów metylacji CPG w różnych tkankach.
- Wykazane różnice w wzorcach metylacji między móżdżkiem a siatkówką.
- Dostarczenie wglądu w regulację ekspresji opsin na podstawie stanu metylacji.
- Walidacja dokładności i precyzji BSAS w analizie metylacji.
Konkluzje
- BSAS jest mocną metodą do ilościowego określania metylacji DNA.
- Technika zwiększa możliwości badania modyfikacji epigenetycznych.
- Ma potencjał do zastosowań w różnych dziedzinach badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeted DNA methylation analysis via bisulfite amplicon sequencing (BSAS) addresses the need for high-throughput, quantitative epigenomic profiling in early discovery. It enables precise interrogation of epigenetic regulation in disease-relevant genomic regions, supporting target validation and mechanistic de-risking. The method provides base-specific methylation quantitation that informs hypothesis testing and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of epigenetic mechanisms in target gene promoters or CpG islands.
- Scientific Value: Provides absolute cytosine methylation quantitation with base specificity for functional target validation.
- Operational Value: Supports rapid analysis of up to 96 samples and 10 kb of targeted regions per run.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative methylation data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Produces NGS-ready libraries from amplicons for scalable, multiplexed epigenetic screening.
- Operational Value: Facilitates confirmation of regions identified in genome-wide methylation studies through targeted validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system analysis by comparing methylation patterns across tissues or disease models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment through site-specific methylation quantification.
- Operational Value: Provides predictive confidence in epigenetic mechanism de-risking prior to lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
BSAS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling epigenetic data integration at key decision points.
- Discovery Biology: Supports interrogation of epigenetic regulation in target validation workflows.
- Screening: Delivers quantitative, high-throughput methylation readouts for compound or condition comparison.
- Analytics: Generates variant frequency data at CpG sites for precise methylation level calculation.
- Translational Research: Connects discovery epigenetics to preclinical continuity via tissue-specific methylation profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for targeted epigenetic analysis across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in epigenetic mechanism validation and reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of methylation quantification across sample sets.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through epigenetic de-risking and capital efficiency in target selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on epigenetic validation of disease-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bisulfite conversion, PCR primer design, and NGS library preparation.
- Depends on access to benchtop next-generation sequencing and capillary electrophoresis for library quantification.
- Necessitates cross-team standardization of bioinformatics pipelines for read trimming, mapping, and variant calling.
- Involves adaptation considerations for different DNA sources and genomic regions of interest.
- Limited by the need for prior knowledge of target regions to design specific primers.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Bisulfite Specific PCR Optimization
2:33
Next Generation Sequencing (NGS) Library Preparation, Library Quality Control, and Methylation Quantification Data Analysis
6:29
Results: Representative Methylation Quantification
8:14
Conclusion
