Name: Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Naucz się ukierunkowanej analizy metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji BSAS. Ta metoda umożliwia precyzyjną ilościową ocenę metylacji CPG w wybranych regionach genomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Colleen Van Kirk za próbki siatkówki i móżdżku myszy oraz Peterowi Gregory'emu za wygenerowanie rysunku. Autorzy dziękują również dr Allison Gillaspy i Laboratorium Biologii Molekularnej i Cytometrii za dostęp do MiSeq. Praca ta była wspierana przez granty NIH DA029405, EY021716 i AG026607 oraz Fundację Donalda W. Reynoldsa.

<ol><li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+separation+of+purines%2C+pyrimidines%2C+and+nucleosides+by+paper+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li>
<li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+roles+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li>
<li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance%3A+myths+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li>
<li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice.+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).</li>
<li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+epigenome%3A+its+origins%2C+contributions+to+tumorigenesis%2C+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li>
<li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li>
<li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li>
<li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li>
<li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+%2F+edited+by+Frederick+M.+Ausubel+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li>
<li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS%2FAS+imprinted+region%3A+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li>
<li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParrish%2C+RR+%22Current+Protocols+In+Neuroscience+%2F+editorial+board%2C+Jacqueline+N.+Crawley+...+%5Bet+al.%5D%22">Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]</a>. 7 (Unit 7 24), (2012).</li>
<li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li>
<li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li>
<li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li>
<li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33(2013).</li>
<li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology%3A+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li>
<li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39(2011).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72(2013).</li>
<li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BSAS pozwala na ukierunkowaną, dokładną kwantyfikację metylacji DNA z wysoką przepustowością zarówno w liczbie próbek, jak i liczbie celów. Dodatkowo, ta generacja biblioteki wykorzystująca znakowanie za pośrednictwem transposomów wymaga mniejszej ilości wejściowego DNA, jest szybsza i zawiera mniej kroków niż tradycyjne techniki ścinania i późniejszej ligacji adaptera. Te ulepszenia w stosunku do istniejących metod pozwalają na precyzyjną analizę metylacji DNA na poziomie podstawowym dowolnego celu będącego przedmiotem zainteresowania. Co więcej, BSAS zapewnia nową metodę potwierdzania regionów będących przedmiotem zainteresowania (regiony metylacji różnicowej (DMR), wyspy CpG, regiony regulacyjne), które zostały zidentyfikowane przy użyciu podejść wodorosiarczynu całego genomu22 lub wychwytywania23 . Stosowanie ortogonalnych podejść potwierdzających i bardziej precyzyjnych ilościowo metod poprawia rygor analityczny badań epigenomicznych. Wysoka głębokość odczytu osiągnięta za pomocą BSAS pozwala na dokładne określenie ilościowe w wąskim przedziale ufności, co skutkuje precyzyjnym oznaczaniem ilościowym16. Dodatkowo, możliwość przeprowadzenia wielu próbek w jednym eksperymencie może zwiększyć wielkość próby w celu potwierdzenia metod całego genomu, co zwiększy moc statystyczną; Jest to słabość wielu obecnych badań epigenetycznych. Co ważne, BSAS zapewnia kwantyfikację metylacji CpG specyficzną dla zasady, co pozwala na generowanie testowalnych hipotez do badań epigenetycznych. Hipotezy, takie jak zwiększona metylacja w określonym elemencie odpowiedzi, spowodują zmniejszone wiązanie określonego czynnika transkrypcyjnego. BSAS, w połączeniu ze sparowanymi danymi dotyczącymi ekspresji mRNA, zapewnia metodę uzyskiwania zarówno regulacji epigenetycznej, jak i ekspresji mRNA w pojedynczym fragmencie tkanki lub populacji komórek. Sparowane pomiary regulacji i ekspresji również zwiększają rygor naukowy i wpływ ustaleń.
Krytyczne kroki w ramach protokołu BSAS obejmują projektowanie starterów, optymalizację amplikonów i generowanie bibliotek/kontrolę jakości. Błąd systematyczny PCR jest wprowadzany, jeśli startery nie są prawidłowo zaprojektowane i amplifikują się z różną wydajnością8. Stosowanie wzorców metylacji, takich jak enzymatycznie generowane wzorce metylacji 100% i 0% cytozyny, może być wykorzystane do określenia stopnia, jeśli w ogóle, błędu kwantyfikacji metylacji i stanowi właściwą kontrolę metodologiczną przy ilościowym określaniu metylacji16. Podobnie należy zachować ostrożność podczas optymalizacji reakcji PCR w celu wytworzenia pojedynczego amplikonu wysokiej jakości. Jeśli amplikon nie jest obecny, zgodnie z sugerowanymi wytycznymi wyszczególnionymi w protokole, kroki optymalizacyjne obejmują zwiększenie liczby cykli PCR lub ilości wejściowej bsDNA. Jeśli istnieje wiele produktów PCR, w tym dimery starterów, kroki optymalizacji obejmują zmniejszenie ilości wejściowej bsDNA, zmniejszenie stężeń molowych startera PCR, zwiększenie temperatury wyżarzania lub zmniejszenie liczby cyklu PCR. Jedna lub kombinacja tych procedur optymalizacyjnych daje wyniki wystarczające do wygenerowania pojedynczego wzmacniacza wysokiej jakości. Alternatywnie, przeprojektowanie podkładów jest dobrym podejściem w przypadku zestawów podkładów, które nie dają ani jednego amplikonu. W tych regionach, w których przeprojektowanie nie jest odpowiednie lub możliwe, mogą działać zdegenerowane zestawy starterów, w tym zarówno cytozyna, jak i tymina w miejscach CpG w starterach do przodu oraz adenina i guanina w miejscach CpG w starterach odwrotnych. Jednak te zestawy starterów wymagają dalszej optymalizacji, aby upewnić się, że nie występuje błąd systematyczny PCR, co wykracza poza zakres tego protokołu. Wysokiej jakości biblioteki są niezwykle ważne dla osiągnięcia sukcesu. Upewnij się, że przeprowadzane są pomiary jakości w celu określenia rozmiaru, jakości i ilości bibliotek przed sekwencjonowaniem. Reakcje sekwencjonowania są podatne na niepowodzenia przy wprowadzaniu bibliotek o niskiej jakości. Błąd systematyczny w ilościowym oznaczaniu metylacji można złagodzić, upewniając się, że częstości metylacji są obecne zarówno w odczytach sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu. Ponadto wyniki jakości baz zgodnych z lokalizacjami CpG powinny wynosić ≥Q30, aby uzyskać wysoką pewność ilościową. Podczas gdy inni wykazywali wcześniej niewielkie lub żadne odchylenie w reakcjach znakowania DNA19 przekształconego w wodorosiarczyn, zapewnienie opisanych powyżej wskaźników pozwala na potwierdzenie kwantyfikacji metylacji o niskim odchyleniu.
BSAS obecnie mierzy metylację w miejscach CpG, jednak przyszłe rozszerzenia tej metody pozwolą na sparowane pomiary CpG 5-hmC z dodaniem etapów eksperymentalnych rozróżniających 5-mC i 5-hmC, takich jak wprowadzenie perrutenianu potasu przed konwersją wodorosiarczynu24. Zwiększy to wpływ narzędzia BSAS, umożliwiając sparowaną metylację, zarówno 5-mC, jak i 5-hmC, oraz dane dotyczące ekspresji w celu określenia regulacyjnych ról ekspresji genów metylacji DNA. Przygotowanie amplikonów PCR za pośrednictwem biblioteki za pośrednictwem transposomów powoduje zmniejszenie głębokości sekwencjonowania na końcach amplifikowanych regionów. W związku z tym regiony o dużym zainteresowaniu powinny być zaprojektowane tak, aby znajdowały się w środku amplikonów. Jednakże, ponieważ BSAS generuje sekwencjonowanie o głębokości odczytu >1,000 X, dokładność ilościowa pomiarów 5 mC w pobliżu końców amplifikowanych obszarów pozostaje wysoka.

Minęło ponad pół wieku od pierwszego doniesienia o naturalnie występujących modyfikacjach DNA w postaci metylacji cytozyny1. Metylacja cytozyny to zmodyfikowana zasada nukleotydowa cytozyny, w którejpiąty węgiel na pierścieniu zasadowym ma grupę metylową (5-mC), najczęściej występującą w motywie dinukleotydowym CpG w genomach ssaków. Funkcjonalna obecność 5-mC w promotorach genów jest na ogół związana z represją transkrypcji, podczas gdy brak jest związany z aktywnością transkrypcyjną2.
Ogromny postęp został osiągnięty w naszym zrozumieniu roli metylacji DNA w rozwoju3, transgeneracyjnym rozprzestrzenianiu profili epigenetycznych4, patogenezie raka5,6 i wielu innych obszarach badawczych. Wiele z tych postępów nastąpiło w ciągu ostatnich kilku lat, gdy opracowano nowe metodologie profilowania metylacji DNA7. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) istnieje obecnie wiele metod profilowania metylacji DNA w całym genomie lub dużych regionach genomu8. Podejścia te otwierają możliwość badań odkrywczych, które określają ilościowo wzorce metylacji DNA i różnice w metylacji DNA. Oprócz tych podejść generujących hipotezy, istnieje znaczne zapotrzebowanie na metody ilościowego testowania metylacji DNA w oparciu o hipotezy.
Pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji i bezpośrednie sekwencjonowanie Sangera DNA przekształconego w wodorosiarczyn były najczęściej stosowanymi metodami analizy docelowych regionów (tj. regionu promotorowego pojedynczego genu lub wyspy CpG)9-12. Wszystkie te metody opierają się na konwersji wodorosiarczynów, chemicznej reakcji deaminacji, w której niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają nienaruszone13,14. Amplifikacja PCR DNA przekształconego w wodorosiarczyn powoduje zastąpienie uracylu tyminą15, co pozwala na odczytanie metylacji różnicowej jako różnicy zasad. Chociaż są one bardzo przydatne, ograniczenia tych metod obejmują niską dokładność ilościową, krótki czas odczytu i niską przepustowość próbki. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy metodę, którą nazwaliśmy sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS)16. Celem tej metody jest możliwość analizy docelowych regionów genomowych będących przedmiotem zainteresowania w dużej liczbie próbek z dużą dokładnością ilościową.
BSAS wykorzystuje elementy istniejących metod (konwersja wodorosiarczynu i specyficzna dla regionu amplifikacja PCR) i łączy je z prostą konstrukcją biblioteki nowej generacji (za pośrednictwem transposomów)17 i laboratoryjnym NGS18 (Rysunek 1). Podejście to zapewnia bardziej ilościową i bardziej przepustową metodę badania metylacji cytozyny w dowolnym regionie zainteresowania. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy metodę i opisujemy podejścia do rozwiązywania problemów i sprawdzania jakości procesu BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Nano</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - Oczyszczanie PCR</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech płytka PCR 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td> folia termozgrzewalna <td>z półspódniczką</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Folia termozgrzewalna</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0,1-10 &#956; l</td><td>Końcówki Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956; l Końcówki</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &#956; l</td><td>Końcówki Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XT</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index Kit</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 indeksy</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq Desktop Sequencer</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq Zestaw odczynników v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 cykli</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Uniwersalny zestaw qPCR</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT PicoGreen</td> Life <td>Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen Quant-iT</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy system do PCR ProFlex</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% żel DNA TBE</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10-dołkowy</td></tr><tr><td>system buforowy Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 l)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample</td><td>Buffer Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus Technologie żywotności drabinki DNA</td><td></td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Technologie życia bromku etydyny</td><td></td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384-dołkowy blok</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 wielomodowy Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Oprogramowanie do rurociągu metylacji</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS chlorowodorek</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płyta z pełną spódnicą, standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolutna pieczęć qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Zestaw do metylacji-błyskawicy</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq Polimeraza DNA</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

ukierunkowana analiza metylacji dna za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Rola procesów epigenetycznych w kontroli ekspresji genów jest znana od wielu lat. Metylacja DNA na resztach cytozyny jest szczególnie interesująca w badaniach epigenetycznych, ponieważ wykazano, że jest ona zarówno długotrwałym, jak i dynamicznym regulatorem ekspresji genów. Wysiłki mające na celu zbadanie zmian epigenetycznych w zdrowiu i chorobie są utrudnione przez brak metod o wysokiej przepustowości i dokładności ilościowej. Wraz z pojawieniem się i popularyzacją technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), narzędzia te są obecnie stosowane w epigenomice jako dodatek do istniejących metodologii genomicznych i transkryptomicznych. Do badań epigenetycznych metylacji cytozyny, w których zidentyfikowano obszary zainteresowania, takie jak określone promotory genów lub wyspy CpG, i istnieje potrzeba zbadania znacznej liczby próbek z dużą dokładnością ilościową, opracowaliśmy metodę zwaną sekwencjonowaniem amplikonów wodorosiarczynowych (BSAS). Metoda ta łączy konwersję wodorosiarczynu z ukierunkowaną amplifikacją obszarów zainteresowania, budową biblioteki za pośrednictwem transposomów i laboratoryjnym NGS. BSAS oferuje szybką i wydajną metodę analizy do 10 kb docelowych regionów w maksymalnie 96 próbkach jednocześnie, która może być wykonywana przez większość grup badawczych posiadających podstawowe umiejętności w zakresie biologii molekularnej. Wyniki zapewniają bezwzględną ilościową ocenę metylacji cytozyny ze swoistością zasadową. BSAS można zastosować do dowolnego regionu genomu z dowolnego źródła DNA. Metoda ta jest przydatna do testowania hipotez w docelowych regionach zainteresowania, a także do potwierdzania regionów zidentyfikowanych w analizach metylacji całego genomu, takich jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów całego genomu, sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji i sekwencjonowanie immunoprecypitacji metylowanego DNA.

BSAS prawidłowo dopasowane do przekonwertowanej sekwencji referencyjnej będą przypominać Rysunek 5. Dinukleotydy CpG można wyraźnie zidentyfikować, a stan metylacji można oszacować poprzez obserwację odczytów zasad w miejscach CpG w zmapowanych odczytach. Na przykład, w przypadku kontroli metylacji, 0% metylacji spowoduje, że wszystkie odczyty zmapowane do miejsc CpG będą zawierać T (Rysunek 5A). Kontrole 100% metylacji spowodują, że wszystkie zmapowane odczyty w miejscach CpG będą zawierać C (Rysunek 5B).
Ilościowe określenie częstotliwości występowania cytozyny (C/C+T) w miejscach CpG pozwala na wyznaczenie częstotliwości metylacji w pierwotnej próbce. Reprezentatywna krzywa wzorcowa wygenerowana z kontroli metylacji całego genomu (n = 3/stosunek metylacji) wykazuje liniowość oznaczania metylacji oraz precyzję pomiaru dla każdego stosunku metylacji (Rysunek 6). Jako przykład zastosowania tej metody w całości, RNA i DNA wyizolowano wspólnie z móżdżku oraz siatkówki myszy (n=4/grupa). Ekspresję rodopsyny, selektywnie wyrażanej w tkance siatkówki, zmierzono za pomocą qPCR. Ekspresję wykryto wyłącznie w siatkówce (Rysunek 7A). Za pomocą BSAS określono ilościowo poziomy metylacji CpG w regionie promotora rodopsyny. Skumulowane poziomy metylacji w całym regionie promotora wynosiły &gt;80% w móżdżku w porównaniu do &lt;15% w siatkówce (p &lt; 0,001, parametryczny test t) (Rysunek 7B). Oznaczanie metylacji metodą BSAS pozwala na ilościową analizę metylacji w konkretnych miejscach, dzięki czemu poziomy metylacji mogą być porównywane w odniesieniu do konkretnych miejsc CpG w dowolnym regionie genomowym. Poziomy metylacji CpG w promotorze rodopsyny były znacząco wyższe w próbkach z móżdżku w porównaniu z próbkami z siatkówki (p &lt;0,001, parametryczny test t dla każdego miejsca CpG) (Rysunek 7C).
<img alt="Schemat sekwencjonowania z bisulfitami; konwersja genomowego DNA do analizy metylacji. Etapy PCR i tagmentacji." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat metody BSAS.W tej metodzie genomowe DNA poddawane jest konwersji bisulfitowej w celu zamiany niezmetylowanych cytozyn w uracyle. Następnie, podczas reakcji PCR, uracyle te zostają zamienione na tyminy. Amplifikacja PCR jest skierowana na regiony zainteresowania, co pozwala na silne wzbogacenie wyłącznie tych sekwencji. Powstałe amplikony PCR są przekształcane w biblioteki z podwójnymi indeksami poprzez prosty proces tagmentacji. Następnie biblioteki są sekwencjonowane na nadblatowym sekwenatorze nowej generacji, a odczyty z sekwencjonowania są mapowane do konwertowanej in silico sekwencji referencyjnej, co pozwala na określenie procentowego poziomu metylacji cytozyn w sposób specyficzny dla poszczególnych zasad.
<img alt="Schemat regionu chromosomalnego; analiza sekwencji DNA; konwersja cytozyn non-CpG do T; mapowanie genetyczne." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: In silico konwersja bisulfitowa regionu zainteresowania. Do konwersji bisulfitowej in silico można wybrać dowolny region zainteresowania z dowolnej referencyjnej sekwencji genomowej. Cytozyny non-CpG w sekwencji referencyjnej są zastępowane tyminami. Cytozyny CpG pozostają cytozynami w referencji poddanej konwersji bisulfitowej.
<img alt="Schemat projektowania starterów do sekwencjonowania DNA przedstawiający prawidłowe i błędne rozmieszczenie starterów w obrębie miejsc CpG." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Rozmieszczenie starterów. Startery do PCR po konwersji bisulfitowej projektuje się w oparciu o sekwencję referencyjną poddaną konwersji bisulfitowej in silico. Startery powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby nie nakładać się na dinukleotydy CG ani nie znajdować się bezpośrednio obok dinukleotydów CG.
<img alt="Wyniki elektroforezy wraz z chromatogramami przedstawiające rozdział fragmentów DNA w parach zasad (bp)." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykłady amplikonów PCR oraz bibliotek sekwencyjnych o wysokiej i niskiej jakości. Reprezentatywne ślady elektroferogramu i żel pokazują (A) idealny amplikon do generowania biblioteki za pośrednictwem transposomu z pojedynczym produktem o wysokim stężeniu. (B) Biblioteka wygenerowana z tego amplikonu wykazuje wysokie stężenie i równomierny rozkład wielkości. (C) Niskiej jakości amplikony PCR mogą charakteryzować się małą wielkością, niskim stężeniem oraz zawierać wiele produktów i/lub dimery starterów. Takie niskiej jakości amplikony prowadzą do (D) niepowodzenia w generowaniu biblioteki, co objawia się niskim stężeniem i niskim rozkładem wielkości.
<img alt="Wyrównanie sekwencji DNA, przedstawiające porównanie z referencją i analizę głębokości odczytów w formie wykresu." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykłady wyników sekwencjonowania z kontroli metylacji. (A) In silico konwertowana sekwencja referencyjna z zaznaczonymi na czerwono miejscami CpG. Zmapowane odczyty z kontroli 0% metylacji dla wybranego regionu wykazują obecność tyminy (zaznaczenie zielone) w miejscach CpG. (B) Zmapowane odczyty z kontroli 100% metylacji wykazują obecność cytozyny (zaznaczenie niebieskie) w miejscach CpG.
<img alt="Wykres korelacji procentowej 5-mC, schemat, analiza metylacji, dopasowanie danych, badanie epigenetyczne." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
Rysunek 6: Ilościowe oznaczenie metylacji w zakresie kontroli metylacji. Kontrole metylacji całego genomu zmieszane w stosunkach metylacji (n = 3/stosunek) od 0% do 100% zostały poddane analizie ilościowej za pomocą BSAS. Wykres wartości oczekiwanych w stosunku do wyznaczonych ilościowo wykazuje liniowość oznaczeń kontroli metylacji. We wszystkich kontrolach odnotowano wysoką precyzję ilościowego oznaczenia metylacji.
<img alt="Analiza ekspresji i metylacji genu Rho; wykresy pudełkowe ekspresji i 5-mC w móżdżku i siatkówce." src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Przykład sparowanej analizy metylacji DNA i ekspresji genów w próbkach tkanek. (A) Względna ekspresja mRNA rodopsyny w tkance móżdżku i siatkówki myszy. (B) Średnia metylacja promotora rodopsyny ilościowo określona metodą BSAS w DNA móżdżku i siatkówki (***p &lt;0.001, parametryczny test t). C) Poziomy metylacji specyficzne dla miejsc CpG w obrębie promotora rodopsyny (-244 do +6 względem miejsca startu transkrypcji [TSS]) w DNA móżdżku i siatkówki myszy.

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie metylacji CpG w wybranych regionach zainteresowania w genomowym DNA wyizolowanym z tkanek lub komórek. Cel ten osiąga się poprzez zaprojektowanie specyficznych dla konwersji siarczynowej starterów PCR, które pozwalają na amplifikację regionów zainteresowania z genomowego DNA poddanego konwersji siarczynowej. W drugim kroku następuje amplifikacja regionu zainteresowania po konwersji siarczynowej, a następnie z otrzymanych amplikonów generowane są biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji (NGS).Następnie biblioteki są sekwencjonowane, a do analizy generowane są pliki FASTQ. W ostatnim etapie odczyty z sekwencjonowania są dopasowywane do referencyjnej sekwencji docelowej przekonwertowanej pirosiarczynem, a procentowa zawartość 5mc jest obliczana. Ostatecznie sekwencjonowanie amplikonów po konwersji siarczynowej lub BS-AS może zostać przeprowadzone w celu precyzyjnego i dokładnego określenia stopnia metylacji CpG w dowolnym regionie zainteresowania u dowolnego organizmu modelowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie metodą Sangera, jest to, że BS-AS zapewnia dokładne i precyzyjne ilościowe oznaczanie metylacji CpG w sposób szybki i wysokoprzepustowy, co daje możliwość analizy wielu regionów w dużej liczbie próbek.Po zidentyfikowaniu celu i zaprojektowaniu starterów, przygotuj mieszaninę reakcyjną w celu optymalizacji amplifikacji pojedynczego amplikonu, a następnie szczelnie zamknij płytkę PCR folią termozgrzewalną, aby zwizualizować amplikony za pomocą elektroforezy żelowej. Następnie nałóż do odpowiednich dołków 30 µL reakcji PCR lub markera wielkości, a potem prowadź elektroforezę przy napięciu 200 V przez około 45 minut. Gdy pierwszy barwnik dotrze do końca żelu, zatrzymaj reakcję, a następnie pokryj cały żel świeżo przygotowanym roztworem bromku etydyny w stężeniu 5 µg/mL.Po pięciu minutach należy obrazować żel za pomocą transluminatora UV przy długości fali wzbudzenia 482 nanometrów. Wykorzystaj drabinę wielkości, aby określić rozmiar produktów PCR (AMPLICONS) w celu ustalenia specyficzności reakcji. Poszukaj wielu prążków poza oczekiwanym rozmiarem produktu, aby określić średnią wielkość wykrytych pików biblioteki oraz oszacować molarność.Następnie analizuj biblioteki na chipie do elektroforezy kapilarnej do wyznaczania wielkości DNA, stosując wysokoczuły zestaw do analizy DNA zgodnie z instrukcjami producenta. W celu ilościowego oznaczenia bibliotek metodą qPCR, użyj starterów zaprojektowanych przeciwko sekwencjom adapterów w wygenerowanych bibliotekach oraz standardów o znanym stężeniu na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, stosując ustawienia kwantyfikacji absolutnej zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie, wykorzystując wielkość bibliotek oraz ilościowe oznaczenie molarne z qPCR, oblicz stężenia molarne bibliotek. Po sekwencjonowaniu zaimportuj skompresowane pliki fastQ do odpowiedniego potoku analizy sekwencjonowania, wybierz opcję importu, a następnie wybierz metodę sekwencjonowania użytą do wygenerowania odczytów, aby zachować wartości Q-score dla aplikacji do przycinania odczytów. Zaimportuj odpowiednie skompresowane pliki odczytów fastQ, a następnie w opcjach ogólnych odznacz opcję odrzucania wyników jakościowych.Wybierz lokalizację dla zaimportowanych odczytów i kliknij finish. Następnie w sekcji NGS core tools wybierz trim sequences. Zaznacz odczyty do przycięcia, pozostawiając jedynie te, które posiadają wyniki Q 30 lub wyższe.Następnie wybierz opcję przycinania według wyników jakości (trim using quality scores) i ustaw limit na 0,001. Aby dodatkowo wybrać tylko odczyty zawierające nie więcej niż jeden niejednoznaczny nukleotyd, zaznacz opcję przycinania niejednoznacznych nukleotydów (trim ambiguous nucleotides) i ustaw maksymalną liczbę niejednoznaczności na jeden.Następnie należy wybrać lokalizację zapisu przyciętych odczytów i kliknąć przycisk zakończenia, aby zmapować przycięte odczyty do referencyjnego genu przekonwertowanego *in silico* za pomocą siarczynów. W sekcji NGS core tools należy wybrać opcję map reads. W polu reference należy wskazać przycięte odczyty do zmapowania i kliknąć next.Następnie w sekcji maskowania referencji (reference masking) należy wybrać przekonwertowaną sekwencję referencyjną i zaznaczyć opcję braku maskowania (no masking). Kliknij następny (next), a następnie przypisz wartość trzy dla niedopasowań (mismatches), insercji (insertions) i delecji (deletions). Przypisz wartość jeden dla minimalnej frakcji długości odczytu zmapowanej do referencji (minimum fraction of read length map to the reference), a w sekcji obsługi niedokładnych dopasowań (nonspecific match handling) przypisz wartość 0,9 dla minimalnej frakcji tożsamości między mapą, odczytem a referencją (minimum fraction of identity between the map, read and reference), wybierz zignoruj (ignore) i kliknij Następny (Next) w opcjach wyjściowych (output options).Następnie wybierz opcję Create standalone read mappings. Następnie w sekcji result handling kliknij save. Wybierz lokalizację zapisu mapowania odczytów i kliknij finish, aby uruchomić wywoływanie wariantów (variant calling) dla zmapowanych odczytów.W analizie ponownego sekwencjonowania (re-sequencing analysis) zaznacz detekcję wariantów o niskiej częstotliwości (low frequency variant detection) i wybierz mapowanie odczytów do analizy. Kliknij następny, a następnie w parametrach wariantów o niskiej częstotliwości wprowadź 0,01% i kliknij następny. W filtrach ogólnych ustaw minimalne pokrycie na 1000, aby zapewnić głębokość sekwencjonowania większą lub równą 1000 x.Na koniec kliknij „next”, a następnie w opcjach wyjściowych (output options) wybierz „create annotated table” i wskaż lokalizację zapisu pliku z tabelą wariantów, kliknij „finish” i wykorzystaj częstotliwości wariantów w adnotowanych miejscach CPG w obszarze zainteresowania z pliku tabeli wariantów, aby obliczyć częstotliwość metylacji cytozyny w referencyjnej cytozynie w kontekście CG; odczyty z sekwencjonowania amplikonów siarczynowych prawidłowo dopasowane do skonwertowanej sekwencji referencyjnej będą przypominać te przedstawione na rycinie. Dinukleotydy CPG można wyraźnie zidentyfikować, a stany metylacji można oszacować, obserwując odczyty zasad w miejscach CPG. W zmapowanych odczytach 0% metylacji spowoduje, że zmapowane odczyty będą zawierać tyminę zmapowaną do miejsc CPG.Kontrole 100% metylacji będą skutkować zmapowanymi odczytami zawierającymi cytosyny zmapowane do miejsc CPG. W tym eksperymencie RNA i DNA zostały współizolowane z móżdżku i siatkówki myszy. Następnie, zgodnie z oczekiwaniami, zmierzono za pomocą QPCR ekspresję opsyn wykazującą selektywną ekspresję w tkance siatkówki.RNA opsyny wykryto wyłącznie w siatkówce po ilościowym oznaczeniu poziomu metylacji CpG w regionie promotora opsyny za pomocą sekwencjonowania amplikonów po konwersji pirosiarczynowej. Jednak skumulowany poziom metylacji w obrębie regionu promotora wynosił ponad 80% w móżdżku, w porównaniu do mniej niż 15% w siatkówce. Ilościowe oznaczenie metylacji metodą BSAS pozwala na analizę metylacji w konkretnych miejscach, co umożliwia porównanie poziomu metylacji dla poszczególnych sekwencji CpG w dowolnym regionie genomu.Rzeczywiście, w tym eksperymencie stwierdzono, że poziomy metylacji CpG w obrębie promotora opsyny były znacząco wyższe w próbkach z móżdżku w porównaniu do próbek z siatkówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić metylację CpG w wybranych regionach zainteresowania w genomicznym DNA wyizolowanym z tkanek lub komórek.

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza metilacji DNA ukierunkowanej za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA). W tym protokole opisujemy enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, który można wykorzystać do uniknięcia przeszacowania poziomów metylacji mtDNA spowodowanych drugorzędową strukturą mtDNA.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Naucz się ukierunkowanej analizy metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji BSAS. Ta metoda umożliwia precyzyjną ilościową ocenę metylacji CPG w wybranych regionach genomowych.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów