Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak skutecznie uchwycić obrazy synaps immunologicznych komórek NK lub NK w super rozdzielczości na podpartej dwuwarstwie lipidowej. Osiąga się to poprzez skonstruowanie szklanej płaskiej dwuwarstwy lipidowej zawierającej przeciwciała przeciwko szkiełkom komórkowym aktywującym receptor CD 16 In w komórkach NK. Wcześniej wyizolowane komórki NK są następnie dodawane do płaskiej dwuwarstwy lipidowej zatopionej w przeciwciałie, a następnie barwi się komórki aktyną f i perforyną.

Ostatnim krokiem jest obrazowanie powstałych synaps komórek NK za pomocą mikroskopu steady, ostatecznie obrazowanie synapsy NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej. Użycie stead pokazuje synapsę komórek NK w większej szczegółowości, co pozwala na wizualizację ultra struktury cytoszkieletu aktyny i dodatnich granulek litycznych perran umieszczonych w regionach o niskiej gęstości aktyny F. Tak więc głównym celem tej techniki jest to, że szklana bariera lipidowa może naśladować błonę plus komórki tuck, białka na tej zwykłej barierze lipidowej.

Mogą poruszać się na boki, co może lepiej podsumować powstawanie bardzo logicznie istotnej synapsy immunologicznej. Wiadomość ta może pomóc odpowiedzieć kluczowym chrześcijanom w dziedzinie immunologii, umożliwiając badaczom wizualizację powstawania synaps w sposób kontrolny ze szczegółami, co jest nieosiągalne przy użyciu komercyjnych i mikroskopowych podejść. Stypendysta podoktorski zajmujący się malowaniem i stypendium dla absolwentów zademonstrują procedurę montażu płaskiej dwuwarstwy lipidowej podpartej szkłem.

Najpierw przygotuj 100 mililitrów roztworu piranii, mieszając 30% nadtlenek wodoru z kwasem siarkowym w stosunku jeden do trzech w zlewce z tym roztworem. Umieść dwie prostokątne szkiełka nakrywkowe o numerze 1,5 na 20 do 30 minut podczas czyszczenia szkiełek nakrywkowych. Pobrać jedną probówkę z wcześniej przygotowanymi 400 mikromolowymi lipidami DOPC i jedną probówkę z wcześniej przygotowanymi 80 mikromolowymi lipidami biotyny PE.

Transportuj je na lodzie do zbiornika argonu po deoksy natlenieniu nowej probówki mikrowirówki argonem. Dodaj do siebie DOPC i biotynę PE w stosunku jeden do jednego. Konkretna objętość będzie się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej dwa mikrolitry.

Każdy deoksy natlenia probówkę z mieszaniną i poszczególne probówki z odczynnikiem przed powrotem drabiny do lodówki. Po zakończeniu czyszczenia dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Ustaw pokrywę do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut, a następnie pobrać 1,5 mikrolitra mieszaniny liposomów i podwielokrotności w jednej kropli do jednej z komór pasowych szkiełka komorowego.

Użycie dwóch kropli na linię jest typowe, ale nie jest konieczne. Teraz, szybko i sprawnie, umieść suche szkiełko nakrywkowe na kropelkach, upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone, aby nie łączyły się po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i dobrze zdefiniowane, nie dotykając krawędzi ścianek komory.

Mocno dociśnij pomiędzy i wokół każdego pasa, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między pokrywą. Poślizgnij się i przesuń Zaznacz pozycje kropli za pomocą markera. Następnie przepuść 100 mikrolitrów wodnej 5% osłonki przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę.

Spróbuj upewnić się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków. Następnie wstrzyknij 100 mikrolitrów strept adin o stężeniu 333 nanogramów na mililitr do każdego pasa. Po inkubacji przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej przemyć, przepuszczając trzy mililitry buforowanej soli fizjologicznej z 1% albuminą surowicy ludzkiej przez każdy pas

Aby usunąć nadmiar trytyny, dodać 100 mikrolitrów biotynylowanej, znakowanej fluorescencyjnie anty CD 16 o stężeniu białka wcześniej ustalonym zgodnie z opisem w protokole tekstowym po inkubacji w ciemności przez 20 do 30 minut. Umyj ponownie, przepuszczając trzy mililitry buforowanej soli fizjologicznej z 1% albuminą ludzkiej surowicy przez każdą ścieżkę. Następnie przepuść przez komorę 100 mikrolitrów biotyny D o stężeniu 25 nanomolowym, aby związać nadmiar tabiny STR, a tym samym wyeliminować szansę na niespecyficzne wiązanie tabiny STR z komórkami.

Następnie policz ludzkie komórki NK i ponownie zawieś je w stężeniu 500 000 na mililitr w stosach buforowanej soli fizjologicznej z 1% albuminą ludzkiej surowicy. Wypłucz biotynę D z komory kolejnymi trzema mililitrami buforowanej soli fizjologicznej z 1% albuminą surowicy ludzkiej na pas. Po ponownym zawieszeniu komórek w żądanym stężeniu dodaj 100 mikrolitrów do każdego pasa.

Umieść komorę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut. Po tym okresie inkubacji utrwalić komórki 4% aldehydem paraform w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut. Przemyć, przepuszczając trzy mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez każdy pas w celu usunięcia aldehydu paraformowego.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu blokującego przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie wybarwić aktynę i perforynę, dodając dwa mikrolitry rozcieńczonego, znakowanego fluorescencyjnie Phin i znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalnego anty perran, inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę przed myciem, przepuszczając przez komorę trzy mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Komora jest gotowa do rozpoczęcia obrazowania.

Włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe mikroskopu steady. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i włącz zarówno moduły skanowania rezonansowego, jak i stead. Po dokonaniu tych wyborów poczekaj około trzech do pięciu minut, aż oprogramowanie się zainicjuje.

Kliknij zakładkę konfiguracji u góry ekranu, wybierz konfigurację lasera. Następnie włącz białe światło i zamiast niego lasery 592 nanometrów. Wybierz obiektyw 100 x i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzenia z laserem zubożającym o długości 592 nanometrów.

Wybierz moduł konfiguracji lasera, wyłącz laser zubożający 592 i włącz laser zubożający 660 nanometrów. Umieść szkiełko na stoliku nad obiektywem. Ustaw ostrość komórek związanych na wyznaczonym obszarze dwuwarstwowym za pomocą lampy światła białego i okularów.

Następnie wróć do zakładki akwizycji bezpośrednio po prawej stronie zakładki konfiguracji. Kliknij zakładkę przełącz na światło białe, a następnie włącz ten moduł i przeciągnij linię lasera wzbudzenia do odpowiedniej długości fali. Po wybraniu żądanego detektora i ustawieniu zakresu wykrywania, kliknij przycisk sekwencyjny na pasku narzędzi pobierania po lewej stronie, aby wyświetlić okno dialogowe skanowania sekwencyjnego u dołu paska narzędzi po lewej stronie.

Dzięki temu użytkownik może dodać wiele sekwencji, z których każda ma inną wiązkę wzbudzenia dla innego koloru. Klikaj między ramkami, a następnie ustaw detektor częstotliwości wzbudzenia i zakres wykrywania dla każdego dodatkowego koloru. Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień naciśnij start, aby rozpocząć proces pozyskiwania.

Trójkolorowy obraz synapsy komórek NK na dwuwarstwie lipidowej na podłożu płaskim szklanym pokazuje, że przeciwciało anty CD 16 pokazane na czerwono gromadzi się na dwuwarstwie lipidowej, wywołując tworzenie aktyny F, a polaryzacja i penetracja perforyny pokazana na niebiesko przez siatkę aktyny f w panelu ogniskowym. Korzystając z tego połączonego podejścia, można czysto obserwować mikroklastry znakowanego fluorescencyjnie anty CD 16 w dwuwarstwie lipidowej podpartej szkłem, co bezpośrednio odzwierciedla grupowanie CD 16 na komórce NK. W porównaniu z konwencjonalnym obrazem konfokalnym, struktura pierścieniowa centralnej gromady CD 16 jest łatwiej dostrzegalna na obrazie stacjonarnym ze względu na zubożoną fluorescencję otoczenia.

Co więcej, ultrastruktura cytoszkieletu aktynowego jest widoczna ze znacznie lepszą rozdzielczością. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, granulki lityczne dodatniej peryny są widoczne umieszczone nad obszarami o niskiej gęstości aktyny F. Na obrazie zamiast tego kluczowy szczegół, który jest w większości tracony w obrazie konfokalnym Po opanowaniu tej techniki można wykonać około czterech godzin, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo podczas jej przechodzenia

Ważne jest, aby pamiętać o odtlenieniu próbki poprzez wielokrotne wypieranie tlenu argonem, a podczas montażu komory poprzez szybkie umieszczenie szkiełka nakrywkowego na próbce i zanurzenie go w roztworze osłonkowym.