Name: Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj technikę obrazowania superrozdzielczego synaps immunologicznych komórek NK na szklanym podłożu z dwuwarstwą lipidową. Metoda STED pozwala wizualizować cytoszkielet aktyny i granulityczne struktury z niespotykaną dotąd szczegółowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Emily Mace i Malini Mukherjee za obrazowanie i analizę dekonwolucji. Prace w laboratorium Liu były częściowo wspierane przez Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant numer AI36211 z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children's Hospital Pediatric Pilot Research Fund oraz Lymphoma SPORE Developmental Research Program z Baylor College of Medicine i Methodist Research Institute.

1. Przygotowanie liposomów
<ol>
	<li>Obliczyć ilość zawiesinowych roztworów podstawowych 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-kapu biotynylu (Biotyna-PE) zawieszonych w chloroformie, w celu wytworzenia rozcieńczonych roztworów o pożądanym stężeniu końcowym. Aby uzyskać końcowe stężenia 400 μM DOPC i 80 μM fosfolipidów Biotyna-PE po 10 ml każdy, należy rozpocząć od umieszczenia 629 μl 10 mg/ml DOPC i 88 μl 10 mg/ml Biotin-PE w oddzielnych szklanych probówkach chromatograficznych. 
	UWAGA: ważne jest, aby czyścić szklane strzykawki Hamilton i szklane probówki chromatograficzne roztworem czyszczącym (1 L 95% etanolu do 120 ml wody zawierającej 60 g wodorotlenku potasu, KOH), przenosząc zawieszony chloroform roztwór podstawowy DOPC i Biotyny-PE.</li>
	<li>Wysuszyć chloroform strumieniem argonu w okapie chemicznym. Uszczelnić probówkę chromatograficzną parafilmem.</li>
	<li>Poddaj nowo wysuszone liposomy działaniu wysokiej próżni w liofilizatorze O/N, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. W celu ukończenia tego samego dnia suszyć przez 60-90 minut.</li>
	<li>Podczas pracy liofilizatora przygotuj trochę buforu do rozcieńczania. Do tego protokołu przygotuj 25 ml składające się z 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; i 2% (wagowo) detergentu n-oktylo-β-D-glukopiranozydu (OG). Najpierw wymieszaj ze sobą pierwsze dwa składniki, a następnie wypiernij tlen argonem przed dodaniem suchego proszku OG. Po przygotowaniu przefiltrować roztwór OG z membraną z octanu celulozy o grubości 0,2 mikrona i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Ponadto należy przygotować dwie zakręcane butelki zawierające 1 l buforu tris-soli fizjologicznej o tych samych stężeniach, ale bez OG. Umieść mieszadło magnetyczne oczyszczone wodą destylowaną na dnie każdego z nich. Przygotuj 6 dodatkowych litrów buforu Tris-sola. Usuń tlen ze wszystkich butelek z argonem i umieść je również w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Po liofilizacji rozpuść wysuszone lipidy w buforze tris-soli OG, aby uzyskać 4 mM roztwór każdego z nich. Postępując zgodnie z przykładowymi objętościami, dodać 2 ml do probówki DOPC i 0,2 ml do probówki Biotin-PE.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą lipidy biotyny-PE z lipidami DOPC. Poprawia to ruchliwość SLB, ponieważ sprzężona biotyna może osłabiać płynność grup głów fosforanowych. Aby uzyskać końcowe stężenie 80 μM Biotin-PE, należy zmieszać 0,2 ml 4 mM Biotin-PE i 1 ml 4 mM DOPC. Następnie dodać 8,8 ml buforu Tris-soli OG.</li>
	<li>Aby uzyskać końcowe stężenie 400 μM DOPC, wystarczy zmieszać 1 ml 4 mM DOPC z 9 ml Tris-soli OG.</li>
	<li>Napełnij sonikator lodowatą wodą. Umieść szklaną rurkę zawierającą rozcieńczony fosfolipid w środku sonikatora za pomocą zacisku narzędziowego. Sonikować rozcieńczony fosfolipid przez 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. 
	UWAGA: Dodaj lód do łaźni wodnej sonikatora, aby utrzymać niską temperaturę, ponieważ sonikacja będzie generować ciepło.</li>
	<li>Napełnij rurki argonem, aby wyprzeć tlen z powietrza nad cieczą i uszczelnij je parafilmem.</li>
</ol>
2. Dializa liposomów
<ol>
	<li>Wyciąć z rolki dwa odcinki rurki do dializy na sucho (odcięcie masy cząsteczkowej: 12-14 000, średnica: 6,4 mm) o odpowiedniej długości (w tym przykładzie 40 cm), po jednym na każde rozcieńczenie fosfolipidów.</li>
	<li>Ponownie nawodnić odcinki rurek, pozwalając im zanurzyć się w 200 ml wody destylowanej w szklanej zlewce przez 2 minuty.</li>
	<li>Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 5 minut na wysokim poziomie lub przynajmniej do momentu, gdy woda się zagotuje.</li>
	<li>Zawiąż węzeł na jednym końcu każdej rurki i spłucz wnętrze kilkoma mililitrami buforu Tris-saline-OG. Następnie skrupulatnie wyciśnij jak najwięcej tego buforu do mycia, aby zminimalizować ilość buforu pozostającego w środku.</li>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym dodaj rozcieńczone fosfolipidy do każdej probówki i zaciśnij otwarte końce małym zamknięciem rurki do dializy, tak aby wykluczyć całe powietrze. Całkowite wykluczenie powietrza będzie wymagało poświęcenia niewielkiej objętości próbki poprzez zaciśnięcie poniżej "linii wodnej".</li>
	<li>Zanurzyć próbki w przygotowanych wcześniej butelkach z buforem tris-soli fizjologicznej bez OG. Wyprzeć tlen z butelki z argonem przed ponownym zamknięciem i umieścić do wymieszania O/N w temperaturze 4°.</li>
	<li>Przenieść rurkę do nowej butelki buforu Tris-soli fizjologicznej bez OG co 12 godzin przez co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Na krótko przed usunięciem dializowanych lipidów należy przygotować kilka małych probówek, do których należy podzielić lipidy, wypełniając każdą z nich argonem w celu wyparcia tlenu.</li>
	<li>Po upływie 36 godzin należy umieścić butelki do dializy w okapie z przepływem laminarnym i wyjąć z nich rurki do dializy. Miej pod ręką pieluchę ławkową lub zlewkę, aby zebrać mokry spływ.</li>
	<li>Przeciąć rurkę do dializy powyżej zacisku, a następnie zdjąć klips i ostrożnie przenieść dializowany roztwór lipidowy za pomocą pipety do podwielokrotności 1 ml we wstępnie przygotowanych probówkach wypełnionych argonem na lodzie.</li>
	<li>Podwielokrotność wodnego roztworu liposomu użyj strumienia argonu, aby ponownie wyprzeć tlen w każdej probówce.</li>
	<li>Przechowuj liposomy w temperaturze 4°. Nie zamrażać.</li>
</ol>
3. Oznaczanie gęstości przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej
<ol>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała o objętości 50 μl dla każdego rozcieńczenia, w następujących stężeniach: 0 nM (próba ślepa), 10 nM, 50 nM, 100 nM i 500 nM. (zwane dalej "serią próbek").</li>
	<li>Dodaj 1 μl kulek krzemionkowych do 6 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Pamiętaj, aby dobrze wstrząsnąć kulkami przed pipetowaniem, ponieważ mają tendencję do osiadania. 
	UWAGA: Jeśli zamówiłeś suche kulki, a nie zawieszone, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi rozcieńczenia.</li>
	<li>Do tych kulek dodaj 2 μl mieszanych fosfolipidów DOPC:Biotinyl w stosunku 1:1. Zrób to dla każdej studni.</li>
	<li>Pulsuj płytką na wirowniku o średniej intensywności 3 razy przez 10 sekund każdy, aby zachęcić do interakcji z kulkami i fosfolipidami.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 150 μl 5% kazeiny. Dobrze wymieszaj, pipetując trzy razy w górę i w dół.</li>
	<li>Pozwól płytce inkubować w roztworze kazeiny przez 10 minut, a następnie zmyj. Aby umyć, napełnij każdą studzienkę do całkowitej objętości 250 μl buforowaną solą fizjologiczną HEPES (HBS) z 1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA). Wirować przy 1.000 x g przez 2 min. Odpipetować i wyrzucić górne 200 μl supernatantu, a następnie powtórzyć dwukrotnie, w sumie trzy cykle płukania.</li>
	<li>Dodać 50 μl streptawidyny w stężeniu 333 ng/ml. Ponownie pulsuj płytkę 3x 10 sekund i pozostaw ją na wytrząsarce na 15 minut. Przemyj 3 razy, jak w kroku 6, aby usunąć niezwiązaną streptawidynę.</li>
	<li>Dodać 50 μl znakowanego fluorescencyjnie biotynylowanego przeciwciała z poprzednio przygotowanej serii rozcieńczeń (patrz krok 3.1) do każdej studzienki i wymienić płytkę na wytrząsarce na 20-30 minut. Przemyć 3x jak w kroku 6 w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.</li>
	<li>Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 100 μl HBS/1% HSA, a następnie przenieś do probówki FACS. Powtórz to dwukrotnie, aby zapewnić skuteczne usunięcie wszystkich kulek ze studzienki, w sumie 300 μl, i zrób to dla każdej studzienki.</li>
	<li>Przynieś powstałe rurki do cytometru przepływowego. Nadszedł czas, aby je przeczytać.</li>
	<li>Dodać 1 kroplę z butelki oznaczonej "B" z zestawu kulek do kalibracji intensywności fluorescencji (FIC) (zwanego dalej "serią standardową") do probówki FACS i rozcieńczyć 300 μl HBS/1% HSA.</li>
	<li>Przeczytaj tę tubę, ale nie zapisuj jeszcze danych. Na razie po prostu upewnij się, że puste koraliki są prawidłowo wyzerowane. Wykonaj histogram przedstawiający fluorescencję koralików mierzoną w odpowiednim kanale, a następnie przesuń napięcie lasera wzbudzającego w dół, aż pik znajdzie się po lewej stronie histogramu.</li>
	<li>Wyjmij probówkę i dodaj po 1 kropli każdej z pozostałych 4 probówek z serii (oznaczonych od 1 do 4) do tej samej probówki. Teraz ponownie umieść rurkę w maszynie i zapisz wynikowe dane, które powinny pojawić się jako 5 odrębnych pików.</li>
	<li>Odczytaj każdą pojedynczą probówkę z serii próbek.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy FACS, narysuj bramkę obejmującą całą szerokość każdego piku na histogramie serii standardowej w połowie punktu maksymalnego. To jedna brama na każdy szczyt. Zrób to samo dla każdej próbki. Zwróć uwagę na MFI (średnią intensywność fluorescencji) dla każdej bramki.</li>
	<li>Za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych wprowadź zmierzone wartości MIF w odpowiednim miejscu. Wprowadź również wartości MESF (cząsteczki równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu) (średnia liczba cząsteczek fluorescencyjnych pokrywających każdy koralik) dla każdej butelki z serii standardowej. Informacje te można znaleźć, postępując zgodnie ze wskazówkami na plastikowym słoiku, w którym dostarczono tubki.</li>
	<li>Użycie arkusza kalkulacyjnego spowoduje wykreślenie MIF w stosunku do wartości MESF, tworząc liniową korelację między liczbą fluoroforów a zmierzoną intensywnością.</li>
	<li>Użyj modułu "białka i etykiety" w spektrofotometrze mikroobjętościowym, aby określić stosunek barwnika do białka w znakowanym przeciwciałie.</li>
	<li>Wprowadzić skuteczność znakowania białka próbki, średnią średnicę kulek pokrytych lipidami oraz wartość MFI dla każdego wpisu. Arkusz kalkulacyjny automatycznie użyje formuły z wykresu liniowego wygenerowanego w kroku 3.16 do obliczenia wartości MESF dla każdego rozcieńczenia białka i gęstości wysiewu białka próbki przy każdym stężeniu.</li>
</ol>
4. Izolowanie i hodowla ludzkich komórek NK
<ol>
	<li>Podwielokrotność 15 ml krwi obwodowej lub kożuchy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć tę krew PBS zawierającą 1% FBS w stosunku 1:1.</li>
	<li>Delikatnie dodać 13 ml Ficollu na dno probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Wirować tę probówkę przez 20 minut przy 1 200 x g z akceleratorem i odłamaniem lub przy najniższych ustawieniach.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy użyć pipety serologicznej, aby zebrać pływającą, mętną białą warstwę środkową komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które powinny się usiąść, oraz przecięcie między przezroczystą żółtą górną warstwą a bardziej mętną bladą dolną warstwą, z których obie znajdują się powyżej najniższej warstwy czerwonych krwinek (RBC). UWAGA: Nie należy zbierać żadnych erytrocytów podczas zbierania PBMC.</li>
	<li>Umieścić zebrane PBMC w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozcieńczyć do pełnej objętości PBS zawierającym 1% FBS. Ponownie odwirować, tym razem z hamulcem i maksymalnie włączonym pedałem przyspieszenia, przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS zawierającym 1% FBS.</li>
	<li>Policz komórki, ponownie wirując z tymi samymi ustawieniami, co w kroku 4.6.</li>
	<li>Ponownie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce R10 o gęstości 10 milionów komórek/ml.</li>
	<li>Weź 30 milionów komórek w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml i odizoluj komórki NK za pomocą zestawu do separacji magnetycznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po izolacji policz komórki jeszcze raz i ponownie zawieś o gęstości 500 000 komórek/ml w kompletnym pożywce R10 (88% RPMI; 10% FBS; 1% HEPES; 1% pirogronian sodu) uzupełnionym IL-2 (100 U/ml). Hodowla w temperaturze 37° w inkubatorze CO2 i wymiana pożywki 2-3 razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Montaż dwuwarstwy lipidowej na podłożu płaskim na podłożu szklanym
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu piranii, mieszając 30% nadtlenku wodoru z kwasem siarkowym w stosunku 1:3 w zlewce. 
	UWAGA: Zawsze wykonuj pracę ze szkodliwymi środkami, takimi jak kwas siarkowy, w odpowiednio przeznaczonym do tego dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>W tym roztworze zanurz 2 prostokątne szkiełka nakrywkowe #1,5 w roztworze piranii na 20-30 minut. 
	UWAGA: Konieczne jest oczyszczenie szkiełek nakrywkowych roztworem piranii.</li>
	<li>Podczas czyszczenia szkiełek nakrywkowych należy pobrać 1 tubkę wcześniej przygotowanych 400 μM lipidów DOPC i 1 tubkę wcześniej przygotowanych 80 μM lipidów Biotyna-PE. Transportuj je na lodzie do zbiornika argonu.</li>
	<li>Wyprzeć tlen w nowej probówce mikrowirówki z argonem, a następnie dodać DOPC i Biotin-PE w stosunku 1:1. Właściwa objętość będzie się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej 2 μl każda. Ponownie wyprzeć tlen w probówce z mieszaniną za pomocą argonu, a także poszczególnych probówek z odczynnikami, przed powrotem tych ostatnich do lodówki.</li>
	<li>Po zakończeniu czyszczenia dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut.</li>
	<li>Pobrać 1,5 μl mieszaniny liposomów przygotowanej w kroku 5.4 i podać ją w jednej kropli do jednej z komór pasa ruchu na szkiełku komorowym. Użycie 2 kropli na linię jest typowe, ale nie jest konieczne.</li>
	<li>Szybko i sprawnie umieść suche szkiełko nakrywkowe na kropelkach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i dobrze zdefiniowane, nie dotykając krawędzi ścianek komory. Mocno dociśnij pomiędzy każdym pasem ruchu i wokół niego, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.</li>
	<li>Zaznacz pozycje kropli za pomocą markera</li>
	<li>Przepuść 100 μl 5% wodnej kazeiny przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę. Spróbuj upewnić się, że w komorze przepływowej nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl streptawidyny w stężeniu 333 ng/ml do każdego toru. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć, przepuszczając 3 ml HBS/1% HSA przez każdą ścieżkę, aby usunąć nadmiar streptawidyny.</li>
	<li>Dodać 100 μl biotynylowanego, znakowanego fluorescencyjnie anty-CD16, takiego jak Alexa Fluor 568, o stężeniu białka wcześniej określonym jako najbardziej skuteczne w sekcji 3. Inkubować w ciemności przez 20-30 minut. Umyć ponownie, przepuszczając 3 ml HBS/1% HSA przez każdą linię.</li>
	<li>Przepuść 100 μl D-biotyny o stężeniu 25 nM przez komorę w celu związania nadmiaru streptawidyny, a tym samym wyeliminowania ryzyka niespecyficznego wiązania streptawidyny z komórkami.</li>
	<li>Policz komórki NK i ponownie zawiesić w stężeniu 500 000/ml w HBS/1% HSA.</li>
	<li>Podczas wirowania komórek wypłucz D-biotynę z komory za pomocą kolejnych 3 ml HBS/1% HSA na pas</li>.
	<li>Sprawdź ruchliwość ligandów na SLB poprzez odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) na całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej przed dodaniem komórek NK.</li>
	<li>Gdy komórki zakończą wirowanie i zostaną ponownie zawieszone w pożądanym stężeniu, dodaj 100 μl do każdego pasa.</li>
	<li>Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37° 5% CO2 na 30-60 minut.</li>
	<li>Po tym okresie inkubacji utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut. Przemyć, przepuszczając 3 ml PBS przez każdą ścieżkę, aby usunąć paraformaldehyd.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu blokującego (5% normalnej surowicy osła i 0,2% Tritron X-100 w PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Barwnik F-aktyny i perforyny przez dodanie 200 μl rozcieńczonej fluorescencyjnie znakowanej falloidyny (1 jednostka / ml znakowanej falloidyny) i znakowanej fluorescencyjnie mAb anty-perforyny (500 ng / ml antyperforyny mAb). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zmyć, uruchamiając 3 ml PBS. Komora jest gotowa do wykonania badań obrazowych.</li>
</ol>
6. Obrazowanie synapsy NK na dwuwarstwie lipidowej za pomocą STED
<ol>
	<li>Włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu. Włącz zarówno skanowanie rezonansowe, jak i moduły SED. Po dokonaniu tych wyborów poczekaj około 3-5 minut, aż oprogramowanie się zainicjuje.</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Konfiguracja" u góry ekranu.</li>
	<li>Wybierz "Konfiguracja lasera", a następnie włącz białe światło i lasery STED 592 nm.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 100x i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzenia z laserem zubożającym 592 nm.</li>
	<li>Wybierz moduł "Laser Config", wyłącz laser zubożający 592 i włącz laser zubożający 660 nm.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku, nad obiektywem. Ustaw ostrość komórek związanych na wyznaczonym obszarze dwuwarstwowym za pomocą lampy światła białego i okularów.</li>
	<li>Wróć do zakładki "Akwizycja", bezpośrednio po prawej stronie zakładki "Konfiguracja".</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Przełącz na światło białe", a następnie włącz ten moduł i przeciągnij linię lasera wzbudzenia na odpowiednią długość fali.</li>
	<li>Wybierz żądany detektor z listy dostępnych, a następnie ustaw zakres wykrywania tak, aby obejmował odpowiedni zakres długości fal. 
	UWAGA: NIGDY nie umieszczaj zakresu wykrywania bezpośrednio pod wiązką wzbudzenia.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Sekwencjonalny" na pasku narzędzi po lewej stronie, aby wyświetlić okno dialogowe Skanowanie sekwencyjne u dołu lewego paska narzędzi. Dzięki temu użytkownik może dodać wiele sekwencji, z których każda ma inną wiązkę wzbudzenia dla innego koloru. Kliknij "Między klatkami", a następnie ustaw częstotliwość wzbudzenia, detektor i zakres wykrywania dla każdego dodatkowego koloru, jak w krokach 6.9 i 6.10.</li>
	<li>Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień naciśnij "Start", aby rozpocząć proces pozyskiwania.</li>
	<li>Zastosuj bezpłatne oprogramowanie do dekonwolucji (Huygens) przy użyciu ustawienia przeznaczonego do dekonwolucji SED, jak opisano wcześniej13.</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowością obecnego badania jest to, że łączy ono technikę SLB z STED w celu zbadania synaps komórek NK. Wcześniejsze badania obrazowały dwuwarstwę lipidową za pomocą TIRF w celu zbadania tworzenia synaps komórek T8 i transportu cząsteczek sygnałowych na błonie komórkowej6. Inni opisali obrazowanie STED synaps komórek NK przy użyciu szkiełek pokrytych przeciwciałami13,14. Opisana tutaj metoda hybrydowa dodatkowo rozwija te wysiłki, obrazując synapsę komórki NK ze zwiększoną przejrzystością zapewnianą przez obrazowanie w superrozdzielczości na powierzchni dwuwarstwy lipidowej, co lepiej modeluje dynamiczną powierzchnię APC.
Chociaż SLB są sztucznymi błonami pozbawionymi cytoszkieletu, tratw lipidowych i innych ligandów, które posiadają rzeczywiste komórki docelowe lub APC, technika ta może podsumować ważne cechy, takie jak ruchliwość i orientacja ligandów. Dzięki temu system SLB może służyć jako podejście redukcjonistyczne w analizie udziału poszczególnych receptorów i ligandów w tworzeniu IS i dynamice IS. Najważniejszą cechą SLB jest to, że naukowcy mogą łączyć tę technikę z podejściami do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takimi jak mikroskopia konfokalna i mikroskopia TIRF. Wprowadzenie mikroskopii STED jeszcze bardziej zwiększa tę przewagę, dostarczając bezprecedensowego wglądu w badania nad SI i ich kliniczne zastosowania.
Jednym z potencjalnych zarzutów wobec tego systemu jest to, że SLB nie naśladuje odpowiednio złożonej powierzchni APC, co prowadzi do potencjalnie niefizjologicznych cech anatomicznych w powstałych synapsach. Chociaż prawdą jest, że ograniczony repertuar cząsteczek powierzchniowych na SLB nie oddaje w pełni niejednorodnie zaludnionej powierzchni APC, ograniczenie to może być również korzystne, ponieważ pozwala badaczom określić wpływ indywidualnych interakcji receptorów i ligandów na tworzenie synaps.
W tym procesie składa się kilka kluczowych kroków. Jednym z najważniejszych jest zapobieganie utlenianiu liposomów poprzez ciągłe stosowanie argonu do wypierania tlenu w rurce i roztworze, tak jak w krokach 1.10, 2.6 i 2.11. Utlenianie lipidów spowoduje zmniejszenie ruchliwości lipidów, utrudniając w ten sposób zdolność białek powierzchniowych do swobodnego poruszania się i uczestniczenia w strukturyzacji synaptycznej. Podobnie, ważne jest również usunięcie całego chloroformu z liposomu poprzez liofilizację (krok 1.2). Przy określaniu gęstości białek w dwuwarstwie lipidowej ważne jest, aby najpierw zdyspersjonować kulki krzemowe w jednorodnej zawiesinie wolnej od klastrów. W razie potrzeby można zastosować sonikację koralików. Podczas montażu SLB niezbędne są wczesne etapy (5.1-5.8), w których szkiełka nakrywkowe są czyszczone, umieszczane są krople i mocowane szkiełko nakrywkowe. Błąd w którymkolwiek z nich może wymagać rozpoczęcia eksperymentu od nowa (od początku sekcji 5). Z tego powodu dobrą praktyką jest czyszczenie większej liczby szkiełek nakrywkowych, niż będzie to potrzebne, aby zaoszczędzić czas w przypadku nieszczęśliwego wypadku.
Brak klastrowania jest najczęstszym problemem podczas pracy z tym systemem. Jeśli podczas wizualizacji komórek w ostatnim kroku nie uda się znaleźć żadnych synaps fluorescencyjnych, można podjąć kilka kroków. Kolejne barwienie dla pokrewnego receptora powierzchniowego komórki można dodać do komory, aby sprawdzić, czy komórka nie utworzyła synapsy z dwuwarstwą, podczas gdy komórki mogą przylegać niespecyficznie do szklanego szkiełka nakrywkowego lub powierzchni dwuwarstwowej, białka powierzchniowe zaangażowane synaptycznie powinny pojawiać się jako odrębne klastry na płaszczyźnie granicy komórka-dwuwarstwa, podczas gdy niezaangażowane białka powierzchniowe powinny pojawiać się jako rozproszone barwienie na obwodzie komórki. Jeśli ta metoda nie powiedzie się, należy sprawdzić ich komórki za pomocą cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że konkretny marker, który ma nadzieję zbadać, jest wyrażony w odpowiedniej obfitości na powierzchni komórki. Wiadomo, że niektóre białka powierzchniowe są regulowane w dół przez długi czas w hodowli in vivo .
Podczas gdy ten protokół szczegółowo opisuje, jak wizualizować tworzenie synaps komórek NK, system SLB może być używany do badania tworzenia synaps w dowolnym immunocytach, jakie można sobie wyobrazić po prostu przez podstawienie pierwszorzędowego liganda w kroku 5.11. Można również dodać wiele ligandów jednocześnie. Nie trzeba również stosować układu streptawidyna-biotyna do przylegania białek powierzchniowych w obrębie dwuwarstwy. Interakcje nikiel-NTA:histydyna są również żywotne. Jednak ze względu na wysoką siłę i specyfikę interakcji streptawidyna-biotyna, nasze laboratorium preferuje ten system. Można również zmieniać stężenie komórek dodawanych do dwuwarstwy od gęstości zalecanej w kroku 5.13, a także czas trwania kolejnego okresu inkubacji, aby obserwować synapsy na różnych etapach dojrzewania. Można to zrobić nawet na żywo, choć to oczywiście wyklucza możliwość wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych (chyba że są one już oznaczone stopionym znacznikiem fluorescencyjnym; nasze laboratorium używa kilku takich zmienionych linii komórkowych). Ze względu na wysoki stopień dostosowania możliwy w tym protokole, można użyć podstawowej techniki SLB, wraz z obrazowaniem STED, aby odpowiedzieć na niezwykle różnorodny zakres pytań z zakresu immunologii, biologii komórki i biochemii, w tym podstawowej dynamiki lipidów15, tworzenia synaps16, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej17 i przerzutów komórek nowotworowych18.

Synapsa immunologiczna (IS) leży w krytycznym punkcie aktywacji i funkcji komórki1. Jest to podstawowe podłoże, za pomocą którego przeprowadzana jest prezentacja antygenu i odporność komórkowa. Najwcześniejsze badania mikroskopowe nad powstawaniem synaps wykorzystywały układ sprzężony komórka-komórka2. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że większość koniugatów będzie oglądana niejako "z profilu", ograniczając w ten sposób pogląd obserwatora na samą strukturę synaptyczną. W 1999 roku laboratorium Dustina rozwiązało to ograniczenie, wykorzystując technikę dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym (SLB)3, która została wcześniej zapoczątkowana przez laboratorium McConnel4,5. Podejście to pozwoliło na wyeliminowanie komórek prezentujących antygen (APC) na rzecz szklanej płaskiej powierzchni lipidowej, do której białka mogą być przyłączane i swobodnie poruszać się w dwóch wymiarach. Korzystając z tej metody, Dustin i jego koledzy byli w stanie zajrzeć bezpośrednio do synapsy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości i po raz pierwszy uzyskać "twarzą w twarz" strukturę IS.
Za pomocą systemu SLB, szczegółowość, z jaką można wizualizować IS, została ograniczona tylko przez ograniczenia obecnych technik obrazowania6-8. Przy użyciu standardowych technik oświetleniowych minimalna rozdzielczość (tj. minimalna odległość między dwoma odrębnymi obiektami, w której można je rozróżnić) została < 200 nm na podstawie kryteriumRayleigha 9. Ograniczenie to utrudnia obrazowanie bardzo drobnych struktur w skali molekularnej tworzących synapsę, a do czasu opracowania technik obrazowania superrozdzielczego10-12 wizualizacja tych struktur ograniczała się do obrazowania nieruchomych komórek za pomocą mikroskopii elektronowej.
Wraz z niedawnym pojawieniem się różnych technik super-rozdzielczościowych, takich jak SIM (mikroskopia oświetlenia strukturalnego), PALM (mikroskopia lokalizacji aktywowanej fotoaktywem), STORM (stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej) i STED10-12, badacze są teraz w stanie badać te struktury synaptyczne w niespotykanych dotąd szczegółach, co z kolei zapewnia coraz bardziej jasne zrozumienie IS. Zalety mikroskopii STED zostały opisane wcześniej13. Tutaj opisujemy obrazowanie w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii STED wyposażonej w nowo opracowany laser zubożający 660 nm. W porównaniu z konwencjonalnym laserem zubożającym 592 nm, laser 660 nm pozwala na szerszy wybór barwników fluorescencyjnych (patrz http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), zwłaszcza tych czerwonych fluoroforów.
Inne publikacje opisywały obrazowanie STED synaps komórek NK na szkiełkach pokrytych przeciwciałami13,14. W tym przypadku system SLB jest połączony z mikroskopią STED o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania synapsy komórek NK. Technika ta ma tę przewagę nad szkiełkami powlekanymi przeciwciałami, że jest płynną mozaiką, w której osadzone białka powierzchniowe mogą swobodnie poruszać się po płaskiej dwuwymiarowej powierzchni (płaszczyzna x-y). To wierniej naśladuje organiczną i ruchomą powierzchnię komórki docelowej, a w konsekwencji lepiej podsumowuje tworzenie fizjologicznie istotnej synapsy immunologicznej.
Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikowi końcowemu szczegółowego opisu, jak obrazować synapsę immunologiczną komórek NK poprzez połączenie systemu SLB i super-rozdzielczej mikroskopii STED. Zapewni użytkownikowi końcowemu kroki niezbędne do: przygotowania liposomów, skonstruowania dwuwarstw osadzonych w białku, określenia gęstości białka na dwuwarstwach lipidowych oraz uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii STED. Techniki te nie ograniczają się do dziedziny immunologii i mogą być szeroko stosowane w różnych dyscyplinach.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sól sodowa)Avanti</td><td>&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>Przygotowanie liposomów</td></tr><tr><td>Gaz argonowy, sprężony</td><td>gaz powietrzny&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>Rurki liofilizacyjne</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>Przygotowanie liposomów</td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8,0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>Oktylo-&beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>Przygotowanie liposomów</td></tr><tr><td>Rurka do dializy</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html; FrName=Widma%2FPor+RC+Rury; rtm=Zestaw;#KIT">Spectrum Labs&nbsp; </a></td><td>132676</td><td>Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z polistyrenu w kształcie litery V (niepoddana obróbce)</td><td>Oznaczanie gęstości przeciwciał</td> <td>Corning</td><td>3896</td></tr><tr><td>Niefunkcjonalizowane kulki krzemionkowe</td><td>Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>Probówki FACS do oznaczania gęstości przeciwciał</td> <td>SS06N</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>Oznaczanie gęstości przeciwciał</td></tr><tr><td>Koraliki QuantumTM MESF</td><td>Bangs Laboratories</td><td>Oznaczanie zmiennej</td><td>gęstości przeciwciał</td></tr><tr><td>Kazeina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0875</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidowy</td></tr><tr><td>HEPES buforowany sól fizjologiczna + 1% HSA</td><td>Domowy</td><td></td><td>preparat dwuwarstwowy lipidowy</td></tr><tr><td>Streptawidyna&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>434301</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidów</td></tr><tr><td>Białko biotynylowane znakowane fluorescencyjnie&nbsp;</td><td>Domowy</td><td></td><td>dwuwarstwowy preparat lipidowy</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0,4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidowy</td></tr><tr><td>25x75 mm szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>Dwuwarstwowy preparat lipidowy</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30%)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidowy</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidowy</td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>Preparat dwuwarstwowy lipidów</td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny typu F Leica</td><td>&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica TCS STED</td><td>Leica</td><td></td><td>Do obrazowania</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek nk na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Szklany płaski system dwuwarstwowy lipidów był wykorzystywany w różnych dyscyplinach. Jednym z najbardziej użytecznych zastosowań tej techniki jest badanie tworzenia synaps immunologicznych, ze względu na zdolność płaskich dwuwarstw lipidowych wspieranych przez szkło do naśladowania powierzchni komórki docelowej podczas tworzenia poziomego interfejsu. Ostatnie postępy w obrazowaniu w superrozdzielczości pozwoliły naukowcom lepiej przyjrzeć się najdrobniejszym szczegółom struktury synaps. W tym badaniu jedna z tych zaawansowanych technik, stymulowane zubożenie emisji (STED), jest wykorzystywana do badania struktury synaps komórek NK (Natural Killer) na podpartej dwuwarstwie lipidowej. W niniejszym dokumencie znajduje się łatwy do naśladowania protokół szczegółowo opisujący: jak przygotować surowe syntetyczne fosfolipidy do użycia w syntezie dwuwarstw na podłożu szklanym; jak określić, jak gęsto białko o danym stężeniu zajmuje miejsca przyczepu dwuwarstwy; jak skonstruować podpartą dwuwarstwę lipidową zawierającą przeciwciała przeciwko receptorowi aktywującemu komórki NK CD16; i wreszcie, jak obrazować ludzkie komórki NK na tej dwuwarstwie za pomocą mikroskopii superrozdzielczej STED, z naciskiem na dystrybucję dodatnich granulek litycznych perforyny i nitkowatej aktyny w synapsach NK. W ten sposób, łącząc szklany płaski system dwuwarstwowy lipidów z techniką STEM, wykazujemy wykonalność i zastosowanie tej połączonej techniki, a także struktury wewnątrzkomórkowe w synapsie immunologicznej NK z super rozdzielczością.

Rysunek 1 przedstawia wynik gęstości przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej. Zasada polega na użyciu standardowych kulek do stworzenia krzywej wzorcowej MESF w funkcji MFI via cytometria przepływowa (A). MFI serii próbek przekształcono w MESF przy użyciu krzywej wzorcowej. Gęstość przeciwciał na dwuwarstwie lipidowej jest liniowo skorelowana z stężeniem przeciwciał (B). Rysunek 2 przedstawia trójkolorowy obraz STED synapsy NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej wspieranej szklaną powierzchnią. Przeciwciała anty-CD16 na dwuwarstwie lipidowej ulegają akumulacji, co wyzwala tworzenie F-aktyny oraz polaryzację i penetrację perforyny przez siatkę F-aktyny w panelu ogniskowym synapsy immunologicznej w komórkach NK. Dzięki zastosowaniu tego połączonego podejścia można wyraźnie zaobserwować mikroklastry fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał anty-CD16 w obrębie SLB, co bezpośrednio odzwierciedla klasteryzację CD16 na komórce NK. W porównaniu z konwencjonalnym obrazem konfokalnym, struktura centralnego klastra CD16 jest łatwiej rozpoznawalna na obrazie STED dzięki zredukowanej fluorescencji tła. Ponadto ultrastruktura cytoszkieletu aktynowego jest widoczna ze znacznie lepszą rozdzielczością. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami16,17, na obrazie STED widoczne są ziarna lityczne dodatnie pod względem perforyny, rozmieszczone nad obszarami o niskiej gęstości F-aktyny, co jest kluczowym szczegółem, który w większości ginie na obrazie konfokalnym.
<img alt="Wykres porównujący liczbę cząsteczek fluorescencyjnych z MFI oraz gęstość przeciwciał w zależności od stężenia." src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Gęstość przeciwciała 3G8 na dwuwarstwie lipidowej. (A) Korelacja liniowa między MESF a MFI dla serii standardów. (B) Korelacja liniowa między gęstością białka a jego stężeniem dla serii rozcieńczeń białka w próbce, przedstawiająca liczbę znakowanych fluorescencyjnie monomerów białka na jednostkę powierzchni w funkcji rosnącego stężenia na kuleczkach krzemionkowych powleczonych lipidami.
<img alt="Schematy mikroskopii STED i konfokalnej, anty-CD16, perforyna, F-aktyna, nałożenie obrazów, analiza struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazowanie STED synapsy komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej. Pierwotne komórki NK stymulowano na SLB zawierającej biotynilowane, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-CD16 (czerwony), następnie utrwalono, permeabilizowano i zabarwiono faloidyną (niebieski) oraz przeciwciałem anty-F-aktyna (zielony). Pojedynczą komórkę obrazowano najpierw w standardowych ustawieniach konfokalnych, a następnie w ustawieniach STED. Obrazy konfokalne i STED poddano dekonwolucji przy użyciu oprogramowania Huygens. Pasek skali, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu skutecznego obrazowania w superrozdzielczości synaps immunologicznych komórek natural killer (NK) na wspieranej dwuwarstwie lipidowej. Cel ten osiąga się poprzez konstrukcję płaskiej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym, zawierającej przeciwciała przeciwko aktywującemu receptorowi CD 16 komórek NK, w szkiełkach z komorą. Następnie do płaskiej dwuwarstwy lipidowej z osadzonymi przeciwciałami dodaje się wcześniej wyizolowane komórki NK, a po tym czasie przeprowadza barwienie komórek na f-aktynę i perforynę.Ostatnim krokiem jest obrazowanie powstałych synaps komórek NK przy użyciu mikroskopu STEAD, w szczególności obrazowanie synapsy NK na wspieranej dwuwarstwie lipidowej. Zastosowanie techniki STEAD pozwala na ukazanie synapsy komórek NK w zwiększonym detalu, co umożliwia wizualizację ultrastruktury cytoszkieletu aktynowego oraz granul litycznych dodatnich pod kątem perranu, zlokalizowanych nad obszarami o niskiej gęstości F-aktyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że szklana płaska bariera lipidowa może naśladować błonę plazmatyczną komórki docelowej oraz białka znajdujące się na tej płaskiej barierze lipidowej.Mogą one przemieszczać się bocznie, co pozwala lepiej odwzorować formowanie się immunologicznie istotnej synapsy. To podejście może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, umożliwiając badaczom wizualizację powstawania synapsy w sposób kontrolowany i szczegółowy, co jest nieosiągalne przy użyciu komercyjnych metod mikroskopowych. Pracownik postdoctoralny oraz doktorant zademonstrują procedurę przygotowania planarnej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym.W pierwszej kolejności przygotuj 100 mililitrów roztworu piranha, mieszając 30% nadtlenek wodoru z kwasem siarkowym w stosunku jeden do trzech w zlewce. Umieść dwie prostokątne szkiełka nakrywki nr 1,5 w roztworze na 20 do 30 minut w celu ich oczyszczenia. Pobierz jedną probówkę wcześniej przygotowanych lipidów DOPC o stężeniu 400 micromolar oraz jedną probówkę wcześniej przygotowanych lipidów biotin PE o stężeniu 80 micromolar.Przenieś je w lodzie do zbiornika z argonem po uprzednim odtlenieniu nowej probówki do mikrowirówki argonem. Dodaj do siebie DOPC oraz biotynowany PE w stosunku jeden do jednego. Dokładna objętość będzie zależeć od potrzeb eksperymentalnych, ale powinna wynosić co najmniej 2 µL.Każdą probówkę z mieszaniną oraz poszczególne probówki z odczynnikami należy odkręcić i zamknąć przed ponownym umieszczeniem zestawu w lodówce. Po zakończeniu czyszczenia dokładnie wypłukać szkiełka nakrywki wodą destylowaną. Pozostawić szkiełka nakrywki do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut, a następnie pobrać 1,5 µL mieszaniny liposomów i nanieść w formie pojedynczej kropli do jednej z komór dla ścieżek na szkiełku komorowym.Użycie dwóch kropel na ścieżkę jest typowe, ale nie jest konieczne. Teraz szybko i sprawnie połóż suchą lamellkę na kropelkach, upewniając się, że krople są w odpowiednich odstępach, aby nie zlały się po nałożeniu lamellki. Ponadto upewnij się, że krople pozostają okrągłe i wyraźnie zdefiniowane, nie dotykając ścianek komory.Mocno dociśnij obszary pomiędzy i wokół każdego kanału, aby zapewnić szczelność pokrywy. Zaznacz pozycje kropli za pomocą pisaka. Następnie wprowadź 100 µL 5% roztworu casing przez komorę, aby zablokować dwuwarstwę.Należy upewnić się, że w komorze przepływowej nie znajdują się pęcherzyki powietrza. Następnie do każdego kanału należy wstrzyknąć 100 µL streptavidiny o stężeniu 333 ng/mL. Po inkubacji przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej należy przemyć kanały, przepuszczając przez każdy z nich 3 mL buforu PBS z dodatkiem 1% albuminy surowicy ludzkiej.Aby usunąć nadmiar streptawidyny, po inkubacji w ciemności przez 20 do 30 minut dodaj 100 µL biotynilowanego, znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD 16 o stężeniu białka ustalonym wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ponownie przemyj, przepuszczając przez każdy kanał 3 mL soli fizjologicznej w buforze HEPS z dodatkiem 1% albuminy surowicy ludzkiej. Następnie przepuść przez komorę 100 µL biotyny D o stężeniu 25 nM, aby związać wszelki nadmiar streptawidyny i w ten sposób wyeliminować możliwość niespecyficznego wiązania streptawidyny z komórkami.Następnie należy policzyć ludzkie komórki NK i resuspenderować je do stężenia 500 000 na mililitr w soli buforowej HEPES z dodatkiem 1% albuminy surowicy ludzkiej. Wypłukać D-biotynę z komory, używając kolejnych trzech mililitrów soli buforowej HEPES z 1% albuminą surowicy ludzkiej na każdą ścieżkę. Po resuspenderowaniu komórek do pożądanej koncentracji, nanieść 100 µL na każdą ścieżkę.Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla na 30 do 60 minut. Po tym okresie inkubacji utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut. Przepłucz każdą ścieżkę, przepuszczając przez nią trzy mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby usunąć paraformaldehyd.Następnie dodaj 400 µL buforu blokującego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przeprowadź barwienie aktyny F i perforyny, dodając 2 µL rozcieńczonej fluorescencyjnie znakowanej perforyny oraz fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko perforynie; inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przemyj komorę, przepuszczając przez nią 3 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym. Komora jest gotowa do rozpoczęcia obrazowania.Włącz wszystkie niezbędne moduły sprzętowe mikroskopu STEAD. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i aktywuj moduły skanowania rezonansowego oraz STEAD. Po dokonaniu tych wyborów odczekaj około trzech do pięciu minut, aż oprogramowanie zostanie zainicjowane.Kliknij kartę konfiguracji u góry ekranu, wybierz konfigurację laserów (laser config). Następnie włącz światło białe oraz stabilne lasery o długości fali 592 nm. Wybierz obiektyw 100x i wyrównaj wiązkę lasera wzbudzającego z laserem deplecyjnym o długości fali 592 nm.Wybierz moduł konfiguracji lasera, wyłącz laser deplecyjny 592 i włącz laser deplecyjny 660 nanometrów. Umieść preparat na stoliku nad obiektywem. Ustaw ostrość na komórki przywiązane do wyznaczonego obszaru dwuwarstwy, korzystając z lampy światła białego i okularów.Następnie wróć do karty akwizycji (acquisition), znajdującej się bezpośrednio po prawej stronie karty konfiguracji. Kliknij kartę przełącznika światła białego (switch to white light), włącz ten moduł, a następnie przesuń linię lasera wzbudzającego do odpowiedniej długości fali. Po wybraniu żądanego detektora i ustawieniu zakresu detekcji, kliknij przycisk sekwencyjny (sequential) w lewym pasku narzędzi akwizycji, aby wyświetlić okno dialogowe skanowania sekwencyjnego w dolnej części lewego paska narzędzi.Pozwala to użytkownikowi na dodanie wielu sekwencji, z których każda posiada inny promień wzbudzenia dla innego koloru. Kliknij pomiędzy klatkami, a następnie ustaw detektor częstotliwości wzbudzenia oraz zakres detekcji dla każdego dodatkowego koloru. Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień kliknij start, aby rozpocząć proces akwizycji.Obraz STEAD w trzech kolorach przedstawiający synapsę komórki NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej wspartej na szkle pokazuje, że przeciwciało anty-CD16 (zaznaczone na czerwono) gromadzi się na dwuwarstwie lipidowej, wywołując tworzenie aktyny F, a także polaryzację i penetrację perforyny (zaznaczonej na niebiesko) przez sieć aktyny F w panelu ogniskowym. Dzięki zastosowaniu tego zintegrowanego podejścia można wyraźnie zaobserwować mikoskupiska fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała anty-CD16 wewnątrz wspartej na szkle dwuwarstwy lipidowej, co bezpośrednio odzwierciedla skupianie się CD16 na komórce NK. W porównaniu z konwencjonalnym obrazem konfokalnym, pierścieniowa struktura centralnego skupiska CD16 jest łatwiejsza do rozróżnienia na obrazie STEAD ze względu na zredukowaną fluorescencję tła.Ponadto ultrastruktura cytoszkieletu aktynowego jest widoczna ze znacznie lepszą rozdzielczością. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, perin pozytywne ziarna lityczne znajdują się nad obszarami o niskiej gęstości F-aktyny. Jest to kluczowy szczegół widoczny na obrazie STEAD, który w obrazowaniu konfokalnym zostaje w dużej mierze utracony. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie przy zachowaniu odpowiedniej staranności zajmuje około czterech godzin.Należy pamiętać o zachowaniu warunków beztlenowych dla próbki poprzez wielokrotne wypieranie tlenu argonem oraz podczas montażu komory, poprzez szybkie nałożenie szkiełka przykrywnego na próbkę i zanurzenie jej w roztworze obudowującym.

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przestrzeganie Obrazowania Super-rozdzielczej Immunologicznej Synapsy Komórki Natural Killer na Warstwie Lipidowej Podtrzymanej na Szkle

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii świetlnej w kratach, aby zobrazować interakcje między żywymi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda polega na skupieniu ultracienkiego arkusza światła sieciowego na oddziałującej parze komórek w celu uzyskania serii dwuwymiarowych obrazów, które są łączone w celu uzyskania czterowymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, które ujawniają czasoprzestrzenną dynamikę interakcji komórka-komórka.

Mikroskopia świetlna w sieci do wizualizacji interakcji receptor-ligand w żywych komórkach

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Poznaj technikę obrazowania superrozdzielczego synaps immunologicznych komórek NK na szklanym podłożu z dwuwarstwą lipidową. Metoda STED pozwala wizualizować cytoszkielet aktyny i granulityczne struktury z niespotykaną dotąd szczegółowością.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Przeglądaj więcej filmów