Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie izolatu AA w porównaniu z jedną bezpieczną przystanią, ukierunkowanymi indukowalnymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub klonami IPSC wykazującymi ekspresję GFP. Osiąga się to poprzez najpierw skuteczne dostarczenie plazmidów dawcy AAV i plazmidów dawcy A VS VS jednego C-A-G-G-F-P do IPC poprzez uczucie nukleologiczne. W drugim etapie komórki docelowe A a vs jeden są wybierane za pomocą pur mycyny na embrionalnych komórkach żywicielskich myszy.

Następnie poszczególne klony GFP wykazujące ekspresję A, A w porównaniu z jednym docelowym klonem są wybierane do 96-dołkowej płytki pokrytej matrycą. W ostatnim kroku klony A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C są rozszerzane za pomocą ośmiu pożywek i standardowych technik hodowli IPSC. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna i cytometria przepływowa są wykorzystywane do wykazania jednolitej i solidnej ekspresji GFP w klonach ludzkich IPSC AA VS one.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania kolonii obejmują mikrosekcję docelowych klonów przy użyciu specjalnych narzędzi do zbierania kolonii pod mikroskopem, co jest trudne do nauczenia się podczas nauczania obok siebie. Zacznij od przemycia kultur IPSC po jednym raz PBS. Następnie dodaj jeden mililitr delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut, gdy więcej niż 50% komórek oddzieliło się od naczynia hodowlanego.

Użyj pipety P 1000, aby mechanicznie rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek lub przyczepione komórki. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki E osiem do każdej studzienki i użyj 10-mililitrowej pipety do dalszej dezagregacji kultur na zawiesiny jednokomórkowe. Teraz zbierz zebrane komórki w 15-mililitrową stożkową rurkę i odkręć je.

Ponownie zawiesić osad w minimalnej ilości E osiem podłoża do liczenia. Następnie, po potwierdzeniu żywotności kultur przez wykluczenie błękitu trianowego, a także ich wystarczającą dysocjację, przeniesiono 3 miliony komórek do każdej z dwóch 15-mililitrowych stożkowych probówek, podczas gdy komórki wirowania ustawiły system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla ludzkiej embrionalnej linii komórek macierzystych H dziewięć. Następnie dodać 10 mikrogramów samego dawcy rekombinacji homologicznej do jednej osadki dla próbki kontrolnej i 10 mikrogramów plazmidu dawcy rekombinacji homologicznej wraz z pięcioma mikrogramami każdego plazmidu talonu dla próbki doświadczalnej.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego roztworu do transfekcji trzech pierwotnych komórek P o temperaturze pokojowej do każdego z kontrolnych i eksperymentalnych granulek i ponownie zawieś komórki. Próbki należy przenieść do pojedynczych kuwet, a następnie zjeść próbki natychmiast po transfekcji. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki E o temperaturze pokojowej osiem do każdego weterynarza Q, a następnie przenieś transfekowane próbki IPSC kroplami do pojedynczych 10-centymetrowych szalek zawierających DR cztery mysie fibroblasty embrionalne Przed pobraniem kolonii należy dobrze nauczyć się 96-dołkowej płytki z 50 mikrolitrami roztworu matrycy błony podstawnej, a następnie przechowywać płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego ranka.

Gdy płytka osiągnie temperaturę pokojową, odessać nadmiar roztworu i załadować każdą studzienkę 100 mikrolitrami pożywki E osiem uzupełnionej 10 mikromolami Y 2 7 6 3 2. Następnie umieść odwrócony mikroskop w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wysterylizuj go lekkim sprayem 70% etanolu. Następnie umieść szklaną pipetę pastwiskową na palniku Bunsena, aby po sterylizacji 70% etanolem stworzyć narzędzie do zbierania kolonii z małym haczykiem na końcówce.

Umieść haczyk w kapturze do wyschnięcia, a następnie umieść kulturę IPSE na stoliku mikroskopu, aby wybrać klony. Zlokalizuj odpowiednią kolonię w małym powiększeniu i użyj narzędzia do zbierania kolonii, aby ją prześledzić i poćwiartować. Następnie delikatnie zeskrobać pokrojoną na ćwiartki kolonię z naczynia hodowlanego i użyć pipety P 200 ustawionej na około 30 mikrolitrów, aby zebrać swobodnie unoszące się IPC, posiewając komórki bezpośrednio na macierzy błony podstawnej.

Podczas zbioru IPC powinny się przymocować w ciągu dwóch do czterech godzin od posiewania. Na koniec inkubuj wybrane kolonie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i odświeżaj komórki kompletną pożywką E eight następnego ranka. Ważne jest, aby przez cały czas trwania eksperymentu transfekować tylko wysokiej jakości PSC I.

Kultury IPSC powinny zawierać głównie odrębne kolonie o morfologii przypominającej bruk, tak jak komórki widoczne tutaj, a komórki zróżnicowane nie powinny przekraczać 10% hodowli, zdolność transfekcyjna IPC może być oceniana i optymalizowana przy użyciu małego wektora PAX GFP, ponieważ transfekcja za pomocą PAX GFP zazwyczaj reprezentuje maksymalną osiągalną wydajność ze względu na jej mały rozmiar. Przejściowa ekspresja A VS jeden C-A-G-E-G-F-P intel i transfekowanych IPC osiąga szczyt po 48 do 72 godzinach od transfekcji, co można potwierdzić za pomocą niewielkiej części transfekowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Wydajność transfekcji może się znacznie różnić.

Nawet w eksperymentach z frakcją dodatnią GFP jest tylko 10%Pojedyncze klony wykazujące jednolitą fluorescencję powinny być wystarczająco duże, aby można było wybrać kolonie po selekcji czystej mycyny. Ponadto, po dojściu do 96, dobrze sformatowane, rozszerzone docelowe klony IPSC powinny wykazywać stabilną i jednolitą ekspresję GFP. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie transfekować I PSC za pomocą uczucia nuklearnego i jak odizolować AV jedną bezpieczną przystań.

Celowane klony IPSE za pomocą narzędzi do zbierania kolonii.