Name: Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Naucz się edycji genów TALEN w locus AAVS1 w ludzkich komórkach iPSC z wykorzystaniem GFP jako markera. Protokół obejmuje transfekcję, selekcję puromycyną i izolację klonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Przygotowanie matrycy membrany podstawnej i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych
<ol>
	<li>Zamrożony materiał z matrycą błony podstawnej umieścić w temperaturze od -20 °C do lodu i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po rozmrożeniu odpipetować 2 mg podwielokrotności macierzy błony podstawnej do wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa. Przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Aby przygotować płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, rozmrozić jedną porcję na lodzie, aż ostatni kawałek lodu w probówce eppendorfa zniknie (zwykle w ciągu ~2 godzin).</li>
	<li>Po rozmrożeniu dodać matrycę błony podstawnej do 12 ml zimnego (4 °C) DMEM/F12, aby uzyskać roztwór do powlekania matrycy membrany podstawnej.</li>
	<li>Dodać roztwór macierzy błony podstawnej do odpowiedniego naczynia hodowlanego. W przypadku płytki 6-dołkowej należy dozować 1 ml na dołek. Zakręć płytą, aby upewnić się, że roztwór matrycy membrany podstawnej całkowicie zakrywa każdą studzienkę.</li>
	<li>Parafilm uszczelnić płytę/naczynie pokryte matrycą membrany podstawnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem. Alternatywnie, płyty/naczynia pokryte membraną podstawną należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni od nałożenia powłoki. 
	UWAGA: Dodaj dodatkowy DMEM/F12 do płyty/naczynia pokrytego matrycą membrany podstawnej, aby zapobiec wysuszeniu. Przed użyciem płyty/naczynia pokrytego membraną podstawową o temperaturze 4 °C należy umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Całkowicie odessać matrycę błony podstawnej przed dodaniem pożywki i komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża E8
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę E8, rozmrażając suplement E8 przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć 10 ml podłoża podstawowego E8 z 500 ml bulionu i wyrzucić.</li>
	<li>Odpipetować całą 10 ml fiolkę z suplementem E8 bezpośrednio do 490 ml podłoża podstawowego E8. Nie podgrzewać kompletnego podłoża E8 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ponieważ powtarzające się wahania temperatury mogą spowodować degradację bFGF w całym podłożu E8.</li>
	<li>Zużyć kompletną pożywkę E8 w ciągu 2 tygodni od dodania suplementu.</li>
</ol>
3. Rozmrażanie iPSC
<ol>
	<li>Wyjąć fiolkę z zamrożonymi iPSC z ciekłego azotu i umieścić na suchym lodzie.</li>
	<li>Szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; obracać fiolkę w łaźni wodnej do momentu, aż pozostanie tylko niewielki fragment lodu.</li>
	<li>Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Dodać kroplami 1 ml pożywki E8 o temperaturze pokojowej bezpośrednio do fiolki.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 2 ml przenieść zawiesinę komórek kroplami do 9 ml pożywki E8 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Często obracaj probówką, aby upewnić się, że komórki i podłoże dobrze się mieszają.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości E8 uzupełnionej 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Dodać komórki do odpowiedniej liczby studzienek pokrytych matrycą z membraną podstawną i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zaleca się płytki co najmniej 0,2 x 106 iPSC na dołek płytki 6-dołkowej, aby umożliwić szybkie odzyskanie po rozmrożeniu.</li>
</ol>
4. Konserwacja i rutynowe przechodzenie iPSC
<ol>
	<li>Odświeżaj pożywkę E8 codziennie.</li>
	<li>Monitoruj morfologię i zbieganie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Wysokiej jakości iPSC rosną w płaskich koloniach z wyraźnymi granicami; poszczególne kolonie mają wygląd "podobny do kostki brukowej".</li>
	<li>Przejście komórek iPSC, gdy osiągną ~70% konfluencji.</li>
	<li>Przygotować roztwór pasażujący EDTA, dodając 0,9 g NaCl i 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml DPBS. Dobrze wymieszaj, aby rozpuścić NaCl i filtr próżniowy do sterylizacji. Przed pasażowaniem ogrzać porcję roztworu pasażującego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby przejść, odessać zużytą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki raz równą objętością ciepłego roztworu pasażowego. Aspirat i odpipetować wystarczającą ilość roztworu pasującego EDTA, aby pokryć komórki (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej).</li>
	<li>Umieść komórki pod odwróconym mikroskopem i obserwuj kolonie iPSC. Pojawienie się w koloniach i podniesionych granicach powinno stać się widoczne w ciągu 2 do 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie zassać roztwór pasażujący EDTA.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dozować 4 ml pożywki E8 (w przypadku użycia płytki 6-dołkowej) pod wysokim ciśnieniem bezpośrednio do każdej studzienki, która ma być przepuszczona.</li>
	<li>Zbierz grudki iPSC i podziel je na odpowiednią liczbę dołków w zależności od proporcji podziału od 1:8 do 1:12. Nie należy pipetować zbyt mocno, ponieważ dezagregacja grudek komórek spowoduje słabą żywotność.</li>
	<li>Umieść płytkę w inkubatorze i kilkakrotnie kołysz płytką w przód iw tył oraz na boki, aby rozproszyć komórki.</li>
</ol>
5. Przygotowanie MEFów i iPSC do Tansfection
<ol>
	<li>48 godzin przed transfekcją należy przepuścić iPSC w temperaturze ~ 1:6 do czterech lub więcej studzienek 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, tak aby za dwa dni były one w 70% zlewane.</li>
	<li>Następnego dnia rozmrozić DR4 MEF do pożywki MEF składającej się z DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełnionego 10% FBS i 1x MEM-NEAA.</li>
	<li>Umieścić DR4 MEF na dwóch 10-centymetrowych szalkach w temperaturze ~ 2 x 104 komórki/cm2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę MEF na E8 uzupełnioną 10 μM Y-27632 30 minut przed wykonaniem transfekcji na iPSC.</li>
	<li>Opcjonalnie: Jeśli pożądana jest analiza cytometryczna przepływowa iPSC po transfekcji, należy usunąć płytkę pokrytą membraną podstawną z 4 °C i umieścić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opcjonalnie: 4 godziny przed transfekcją uzupełnij hodowlę iPSC przed transfekcją Y-27632 w końcowym stężeniu 10 μM.</li>
</ol>
6. Leczenie odczynnikiem dysocjacji komórek delikatnych i transfekcja iPSC za pomocą systemu elektroporacji
<ol>
	<li>Usunąć roztwór do transfekcji komórek pierwotnych P3 z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na ~30 minut. Przed użyciem dodać cały 100 μl suplementu do roztworu do transfekcji.</li>
	<li>Ciepły odczynnik do dysocjacji delikatnych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzyskać TALENY AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) oraz dawcę AAVS1-CAG-EGFP od -20 °C.</li>
	<li>Wyjąć iPSC z inkubatora i przemyć je raz za pomocą DPBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji delikatnych komórek do dołka i inkubować iPSC w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy więcej niż 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Odpipetuj komórki kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety p1000, aby oddzielić wszelkie pozostałe komórki od naczynia hodowlanego i rozbić grudki iPSC.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki E8 do każdego dołka i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby dalej dezagregować grudki komórek na pojedyncze komórki 
	UWAGA: Wydajność transfekcji znacznie spada, jeśli grudki komórek nie są wystarczająco zdezagregowane.</li>
	<li>Zebrać iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w minimalnej ilości pożywki E8.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru po nałożeniu ważnego barwnika, takiego jak 0,4% błękitu trypanowego. Upewnij się, że komórki są wystarczająco zdysocjowane podczas liczenia (1-3 komórki na "kępę").</li>
	<li>Dozować 3 x 106 komórek do każdej z dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml i ponownie odwirowywać w temperaturze 100 x g przez 3 minuty 
	UWAGA: Wirowanie z niską prędkością zmniejsza obciążenie komórek i umożliwia łatwe ponowne zawieszenie iPSC przed elektroporacją.</li>
	<li>Ustawić system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (Program CB-150).</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant z osadów komórkowych. Do jednej osadki dodać 10 μg dawcy HR jako próbkę kontrolną. Do drugiego osadu dodać 10 μg dawcy HR wraz z 5 μg każdego TALEN-a (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) jako próbkę doświadczalną.</li>
	<li>Zawiesić każdą osadkę komórkową w 100 μl roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 i przenieść do kuwety.</li>
	<li>Wykonaj transfekcję i natychmiast dodaj 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej do każdej kuwety.</li>
	<li>Przenieść transfekowane iPSC kroplami do jednej 10-centymetrowej płytki zawierającej MEF DR4 przygotowane w kroku 5.4.</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodaj kilka kropli z każdego eksperymentu do jednej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, jeśli pożądana jest analiza cytometrii przepływowej wydajności transfekcji.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.15-6.17, aby zakończyć obie próbki. Następnego dnia należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS i zmienić pożywkę hodowlaną na NutriStem, który wydaje się wspierać hodowlę iPSC na karmnikach lepiej niż E8.</li>
	<li>Przejściowa ekspresja EGFP osiąga szczyt w 48 do 72 godzinach po transfekcji; oceń skuteczność transfekcji zgodnie z potrzebami.</li>
</ol>
7. Puromycyna Wybór docelowych iPSC
<ol>
	<li>Rozpocznij selekcję puromycyny 72 godziny po transfekcji, gdy iPSC osiągną 70% konfluencji.</li>
	<li>W przypadku iPSC NCRM5 selekcję puromycyny należy rozpocząć od 0,5 μg/ml puromycyny (1/2 pełnej dawki) rozcieńczonej na pożywce hodowlanej NutriStem. Optymalne stężenie puromycyny może wahać się od 0,25 do 1 μg/mlL dla niektórych linii iPSC.</li>
	<li>Hodowla iPSC w NutriStem + 0,5 μg/ml puromycyny przez 3 dni, codziennie odświeżając podłoże.</li>
	<li>Po 3 dniach należy zwiększyć stężenie puromycyny do 1 μg/ml.</li>
	<li>Hodowla iPSC pod wpływem 1 μg/ml puromycyny przez kolejne 7 do 8 dni lub do momentu, gdy odrębne kolonie pojawią się wystarczająco duże, aby można było je pobrać.</li>
</ol>
8. Wybieranie kolonii i rozszerzanie docelowych iPSC
<ol>
	<li>Użyj macierzy błony podstawnej, aby pokryć 96-dołkową płytkę, dozując 50 μl roztworu do powlekania macierzy błony podstawnej (2 mg matrycy błony podstawnej rozcieńczonej w 12 ml DMEM/F12) do każdej studzienki. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez noc przed użyciem.</li>
	<li>Po odczekaniu, aż płyta pokryta matrycą membrany podstawowej osiągnie temperaturę pokojową, odessać matrycę membrany podstawnej i dozować 100 μl E8 uzupełnionego 10 μM Y-27632 do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieść odwrócony mikroskop w komorze bezpieczeństwa biologicznego i lekko spryskaj 70% EtOH w celu sterylizacji.</li>
	<li>Przeciągnij szklaną pipetę Pasteura na palnik Bunsena, aby uzyskać idealne narzędzie do zbierania kolonii, które ma mały "haczyk" na końcówce. Wysterylizuj 70% EtOH i umieść w kapturze do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora szalkę zawierającą docelowe kolonie iPSC i umieścić w kapturze pod mikroskopem.</li>
	<li>Wybierz iPSC, rysując okrąg wokół granicy kolonii za pomocą narzędzia do wybierania kolonii.</li>
	<li>Użyj "haczyka" narzędzia do zbierania kolonii, aby delikatnie zeskrobać i usunąć kolonię iPSC z powierzchni płytki. W przypadku większych kolonii narysowanie znaku X za pomocą narzędzia do zbierania kolonii, aby poćwiartować kolonię, ułatwi wzrost komórek po ponownym posiewaniu.</li>
	<li>Gdy grudki komórek zostaną odłączone i swobodnie unoszą się na wodzie, użyj pipety p200 ustawionej na ~30 μl, aby zebrać iPSC. Umieść komórki bezpośrednio w płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Opcjonalnie: za pomocą pipety p20 ustawionej na ~5 μl zebrać iPSC do probówki Eppendorfa, a następnie dodać 50 μl odczynnika do dysocjacji komórek delikatnych do trawienia przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Po roztrawieniu dodać 500 μl pożywki E8 do probówki Eppendorfa, aby rozcieńczyć odczynnik do dysocjacji komórek delikatnych i odwirować komórki przy 200 x g w standardowej mikrowirówce stołowej przez 5 minut. Następnie odessać większość pożywki i pozostawić ~30 μl do ponownego zawieszenia i przeniesienia komórek do płytki 96-dołkowej. 
	UWAGA: Takie podejście ułatwi dysocjację skupiska komórek i szybką ekspansję wybranej kolonii.</li>
	<li>Kontynuuj zbieranie kolonii, aż zostanie zebrana wystarczająca liczba kolonii iPSC (zaleca się około 20-30 kolonii na eksperyment).</li>
	<li>Po pobraniu kolonii umieść na noc 96-dołkową płytkę w inkubatorze. Odśwież się kompletną pożywką E8 następnego dnia i hoduj do ~70% zlewania się.</li>
	<li>Przejście komórek z 96-dołka do 24-dołkowego, a następnie do 6-dołkowego, jak opisano w krokach 4.5-4.10. 
	UWAGA: objętości roztworu EDTA i pożywki E8 powinny być proporcjonalnie zmniejszone w przypadku stosowania studzienek mniejszych niż płytka 6-dołkowa.</li>
	<li>Oceń skuteczność celowania za pomocą PCR skrzyżowania i analizy Southern blot w celu potwierdzenia celowanej integracji kasety i braku losowo wstawionych wektorów16.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+insulator+in+AAVS1%2C+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+by+AAVS1+Transcription+Activator-Like+Effector+Nucleases.+Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells%3A+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li>
<li>Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stembook.org/node/1438">http://www.stembook.org/node/1438</a> (2008-2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi etapami pomyślnego wytworzenia ukierunkowanych na AAVS1 ludzkich iPSC w ramach "bezpiecznej przystani" są: (1) skuteczne dostarczanie plazmidów TALEN i dawcy do iPSC poprzez transfekcję; (2) optymalizacja dysocjacji iPSC na pojedyncze komórki przed transfekcją i gęstość posiewu po transfekcji; (3) optymalizacja dawki i czasu doboru leków w oparciu o wzrost linii iPSC; (4) staranne preparowanie i wybieranie docelowych kolonii oraz przenoszenie na nową płytkę/studzienkę. W porównaniu z podobnymi metodami za...

Zdolność do przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w embrionalne indukowane komórki macierzyste (iPSC) została po raz pierwszy odkryta przez Takahashi et al. w 2007 roku1. Wykazano, że ludzkie fibroblasty skóry transdukowane retrowirusami wyrażającymi cztery czynniki transkrypcyjne (tak zwane czynniki Yamanaka Oct3/4, Sox2, c-Myc i Klf4) okazały się bardzo podobne do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w oparciu o morfologię, proliferację, ekspresję genów i status epigenetyczny; Co najważniejsze, iPSC są również zdolne do różnicowania się w komórki wszystkich trzech listków rozrodczych1. Potencjał proliferacyjny i zdolność różnicowania iPSC sprawiają, że są one bardzo atrakcyjnymi narzędziami; Dzięki przeprogramowaniu komórek pochodzących od pacjentów cierpiących na określone choroby, komórki iPS mogą być wykorzystywane zarówno jako systemy modelowe chorób in vitro, jak i jako potencjalne środki terapeutyczne.
Dla tego ostatniego celu, kilka kwestii musi zostać poruszonych, zanim pełny potencjał iPSC w warunkach klinicznych będzie mógł zostać zrealizowany; potencjał rakotwórczy hodowanych in vitro hESC i iPSC, użycie pochodnych ksenogennych podczas przeprogramowania i utrzymania komórek oraz potrzeba śledzenia przeszczepionych komórek in vivo są kluczowymi przeszkodami w klinicznym zastosowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych (Sprawdzone przez Hentze et at.2). Idealnym rozwiązaniem potrzeby śledzenia zróżnicowanych komórek po przeszczepie byłby wizualnie wykrywalny marker, który jest odporny na wyciszanie i różnorodność niezależnie od zastosowania. Silna i trwała ekspresja zintegrowanych transgenów jest najłatwiejsza do osiągnięcia, gdy egzogenne DNA jest wprowadzane do loci "bezpiecznej przystani"; Oznacza to, że miejsca genomowe umożliwiają wystarczającą transkrypcję zintegrowanego wektora, jednocześnie łagodząc zaburzenia ekspresji w sąsiednich genach3. Jednym z takich miejsc, które zostało bardzo dobrze scharakteryzowane od czasu jego odkrycia, jest miejsce integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1), w pierwszym intronie genu podjednostki regulatorowej 12C (PPP1R12C) fosfatazy białkowej 1. Wykazano, że locus ten nie tylko umożliwia trwałą i solidną ekspresję zintegrowanych transgenów poprzez wydłużony czas w hodowli i różnicowaniu in vitro 3, ale także chroni otaczające geny przed zaburzeniami transkrypcji4; Uważa się, że obie cechy wynikają z obecności endogennych elementów izolatora chromatyny otaczających miejsceAAVS1 5.
Postępy w narzędziach inżynierii genomu w ciągu ostatniej dekady znacznie ułatwiły łatwość i efektywność, z jaką można osiągnąć manipulacje genetyczne w dowolnym typie komórki. Podczas gdy wczesne udane eksperymenty opierały się na niezwykle niskich poziomach endogennej rekombinacji homologicznej (HR) z wprowadzonym dawcą w celu osiągnięcia celowania genów w ESC6,7, zastosowanie nukleaz specyficznych dla miejsca, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), które znacząco indukują rekombinację homologiczną poprzez generowanie dwuniciowego pęknięcia DNA, znacznie zwiększyło skuteczność takich eksperymentów8,9. Ponowne wykorzystanie zarówno efektorów podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALE) patogennych dla roślin rodzajów Xanthomonas, jak i prokariotycznego systemu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9 w wydajne, specyficzne dla miejsca nukleazy zaprojektowane sprawiły, że celowanie genów w pluripotencjalne komórki macierzyste stało się dostępną i praktyczną metodologią10-13.
Niedawny artykuł opisywał skuteczną metodę stabilnej integracji zielonej kasety reporterowej fluorescencyjnej z locus bezpiecznej przystani AAVS1 w ludzkich iPSC przy użyciu nukleaz TALE (TALENs)14. Te ukierunkowane iPSC zachowały swoją fluorescencję nawet po skierowanym różnicowaniu do kardiomiocytów i przeszczepieniu do mysiego modelu zawału mięśnia sercowego (MI), dostarczając mocnych dowodów na użyteczność takich stabilnie fluorescencyjnych pluripotencjalnych komórek macierzystych14. Aby uzyskać docelowe kolonie, zastosowano metodę pułapki genowej, w której sekwencja peptydu samorozszczepiającego 2A za pomocą syplingu-akceptora (SA) umieszcza gen N-acetylotransferazy puromycyny (PAC) pod kontrolą endogennego promotora PPP1R12C; w związku z tym tylko iPSC, które włączyły dawcę DNA w locus AAVS1, wyrażają PAC, co czyni je wybieralnymi na podstawie oporności na puromycynę; (Rysunek 1,15). Protokół ten szczegółowo opisuje procedury generowania iPSC AAVS1-GFP opisane w niedawnym artykule14, w tym proces transfekcji iPSC za pomocą TALEN-ów i dawcy 9,8 kb w celu integracji fragmentu DNA o wielkości 4,2 kb z locus bezpiecznej przystani AAVS1, selekcji iPSC na podstawie oporności na puromycynę i wybierania kolonii do ekspansji klonalnej. Techniki opisane w niniejszym dokumencie mogą być stosowane do wielu eksperymentów inżynierii genomu.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana membranowa, *bez LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Przechowywać podłoże podstawowe w temperaturze 4 stopni C. Przechowywać suplement w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej Po rozpuszczeniu w H2O, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Przechowywać w ciekłym azocie.</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.</td></tr><tr><td>Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca,</td><td>Hyklon</td> pochodzenia amerykańskiego <td>SH30070.03</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C na noc i podwielokrotnie. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C, dopóki nie będzie potrzebny.</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Jednostka podstawowa 4D-Nucleofector &nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>część systemu elektroporacji</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>część systemu elektroporacji</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Po przybyciu wyjmij roztwór ogniw pierwotnych, uzupełnij i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C i ogrzać podwielokrotność w 37 &deg; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Pożywka</td> hodowlana <td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 i 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Dawca rekombinacji homologicznej</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przygotować robocze porcje 1 mg/ml w ddH2O.</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (chłodnicze), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 & razy; 750 ml Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych ukierunkowanych na talen z genem gfp do aavs1 safe harbor

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Ukierunkowana addycja transgenu może zapewnić trwałą ekspresję genów, jednocześnie omijając mutagenezę genów i mutagenezę insercyjną spowodowaną losową integracją za pośrednictwem wektora wirusowego. Protokół ten opisuje uniwersalną i wydajną platformę ukierunkowanej addycji transgenów w ludzkich iPSC, opartą na wykorzystaniu zwalidowanych TALEN-ów typu open source i dawcy przypominającego pułapkę genową w celu dostarczenia transgenów do locus bezpiecznej przystani. Co ważne, efektywna edycja genów jest ograniczona przez wydajność dostarczania wektorów edycji genów. W związku z tym protokół ten koncentruje się w pierwszej kolejności na przygotowaniu iPSC do transfekcji w celu osiągnięcia wysokiej wydajności dostarczania jądrowego. Kiedy iPSC są dysocjowane na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek i transfekowane za pomocą zoptymalizowanego programu, można skłonić >50% komórek do przejęcia dużych wektorów edycji genów. Ponieważ locus AAVS1 znajduje się w intronie aktywnego genu (PPP1R12C), do selekcji docelowych komórek iPS użyto genu opornego na puromycynę (PAC) sprzężonego z akceptorem splicingu (SA), wykluczając komórki tylko z losową integracją i nietransfekowane. Strategia ta znacznie zwiększa szansę na uzyskanie docelowych klonów i może być również wykorzystana w innych eksperymentach z aktywnym celowaniem genowym. Dwa tygodnie po selekcji puromycyny w dawce dostosowanej do specyficznej linii iPSC, klony są gotowe do pobrania poprzez ręczne rozwarstwienie dużych, izolowanych kolonii na mniejsze kawałki, które są przenoszone na świeże podłoże w mniejszym dołku w celu dalszej ekspansji oraz badań genetycznych i funkcjonalnych. Można postępować zgodnie z tym protokołem, aby łatwo uzyskać wiele linii reporterowych iPSC GFP, które są przydatne do obrazowania in vivo i in vitro oraz izolacji komórek.

Wizualizacja protokołu została przedstawiona na Rysunku 2, gdzie okresy hodowli iPSC w różnych mediach zostały zaznaczone kolorem zielonym dla E8 lub niebieskim dla NutriStem. Ważne jest, aby transfekować wyłącznie wysokiej jakości iPSC; należy badać naczynia hodowlane podczas rutynowej konserwacji i upewnić się, że hodowle iPSC zawierają głównie wyraźne kolonie o morfologii przypominającej brukowaną uliczkę (Rysunek 3A); komórki zróżnicowane nie powinny zajmować więcej niż 10% hodowli. ...

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie izolatów klonów indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z GFP ekspresją, w których AAVS1 w jednym bezpiecznym miejscu (safe harbor) jest celowany. Osiąga się to poprzez wydajne dostarczenie do iPSC plazmidów AAVS1 talons oraz plazmidów donora AAVS1 C-A-G-E-G-F-P za pomocą nukleofekcji. W drugim kroku komórki celowane AAVS1 są selekcjonowane za pomocą purymycyny na komórkach karmicielskich z embrionów mysich.Następnie poszczególne klony wykazujące ekspresję GFP i nakierowane na AAVS1 przenosi się na płytkę 96-dołkową pokrytą matrigelem. W ostatnim etapie klony AAVS1 GFP-iPSC namnaża się w pożywce E8, stosując standardowe techniki hodowli iPSC. Ostatecznie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i cytometrii przepływowej wykazuje się jednorodną i silną ekspresję GFP w nakierowanych na AAVS1 klonach ludzkich iPSC.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wyizolowania kolonii obejmują mikrodyssekcję wybranych klonów przy użyciu specjalistycznych narzędzi do pobierania kolonii pod mikroskopem, co jest trudne do opanowania podczas instruktażu bezpośredniego. Należy rozpocząć od jednokrotnego przemycia kultur iPSC roztworem PBS. Następnie do każdej studni dodaje się 1 mL łagodnego odczynnika do dysocjacji komórek o temperaturze 37 °C i inkubuje komórki w 37 °C przez około pięć minut, aż ponad 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego.Za pomocą pipety P 1000 mechanicznie rozbić pozostałe skupiska komórek lub komórki przylegające. Następnie do każdej studniki dodać dwa mililitry pożywki E8 i za pomocą pipety 10 ml dalej rozdzielać kultury do postaci zawiesin pojedynczych komórek. Teraz zebrać komórki do 15 mililitrowej probówki stożkowej i odwirować je.Osad zawiesić w minimalnej ilości pożywki E8 w celu policzenia komórek. Następnie, po potwierdzeniu żywotności kultur za pomocą wykluczania błękitu trypanu oraz ich odpowiedniej dysocjacji, przenieść 3 milionów komórek do każdej z dwóch 15 mililitrowych probówek stożkowych. Podczas wirowania komórek ustawić system do elektroporacji na program specyficzny dla typu komórek dla ludzkiej linii komórek macierzystych zarodkowych H9. Następnie dodać 10 µg samego donora rekombinacji homologicznej do jednego osadu dla próbki kontrolnej oraz 10 µg plazmidu donora rekombinacji homologicznej wraz z 5 µg każdego plazmidu talonu dla próbki badawczej.Następnie do każdego z osadów kontrolnych i doświadczalnych należy dodać 100 µL roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 w temperaturze pokojowej i resuspender komórki. Przenieś próbki do oddzielnych kuwet, a następnie poddaj je inkubacji natychmiast po transfekcji. Do każdej kuwety dodaj 500 µL pożywki E8 w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś kroplami transfekowane próbki iPSC do oddzielnych szalek 10 cm zawierających mysie fibroblasty embrionalne DR4. Przed wyselekcjonowaniem kolonii, każdą studzienkę płytki 96-dołkowej należy pokryć 50 µL roztworu matrycy błony podstawnej, a następnie przechowywać płytkę przez noc w temperaturze 4 °C do następnego ranka.Gdy płytka osiągnie temperaturę pokojową, odessać nadmiar roztworu i nalać do każdego dołka 100 µL medium E8 uzupełnionego o 10 µM Y 2 7 6 3 2. Następnie umieścić mikroskop odwrócony w komorze z laminarnym przepływem powietrza i wysterylizować go, rozpylając niewielką ilość 70% etanolu. Następnie nad palnikiem Bunsena wygiąć szklaną pipetę Pasteura, aby stworzyć narzędzie do wycinania kolonii z małym haczykiem na końcu, po uprzedniej sterylizacji 70% etanolem.Umieść haczyk w komorze do wyschnięcia, a następnie umieść kulturę IPSE na stoliku mikroskopu w celu wyselekcjonowania klonów. Zlokalizuj odpowiednią kolonię przy niskim powiększeniu i za pomocą narzędzia do pobierania kolonii obrysuj ją i podziel na ćwiartki. Następnie delikatnie zeskrob ćwiartkę kolonii z naczynia hodowlanego i użyj pipety P 200 ustawionej na około 30 µl, aby zebrać swobodnie pływające IPC, przenosząc komórki bezpośrednio na macierz błony podstawnej.Po zebraniu, iPSC powinny przytwierdzić się w ciągu dwóch do czterech godzin od wysiania. Na koniec wybrane kolonie inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C, a następnego ranka odświeża komórki, stosując pełną pożywkę E8. Ważne jest, aby w trakcie całego eksperymentu transfekować wyłącznie wysokiej jakości iPSC.Hodowle iPSC powinny zawierać głównie wyraźne kolonie o morfologii przypominającej brukowaną nawierzchnię, podobnie jak komórki widoczne tutaj, a komórki zróżnicowane nie powinny stanowić więcej niż 10% hodowli; zdolność do transfekcji iPSC można ocenić i zoptymalizować, używając małego wektora PAX GFP, ponieważ transfekcja PAX GFP zazwyczaj reprezentuje maksymalną możliwą wydajność ze względu na jego niewielki rozmiar. Przejściowa ekspresja A VS one C-A-G-E-G-F-P intel w transfekowanych iPSC osiąga szczyt od 48 do 72 godzin po transfekcji, co można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej na niewielkiej części transfekowanych komórek. Wydajność transfekcji może się znacznie różnić.Nawet w eksperymentach z A frakcja pozytywna pod względem GFP wynosi zaledwie 10%. Pojedyncze klony wykazujące jednorodną fluorescencję powinny być wystarczająco duże, aby umożliwić ich nabranie po selekcji czystą mycyną. Ponadto, po przeniesieniu do formatu 96-dołkowego, powiększone docelowe klony iPSC powinny wykazywać stabilną i jednorodną ekspresję GFP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie transfekować iPSC poprzez nukleofekcję oraz jak izolować bezpieczną przystań AV one.Wyizolowanie docelowych klonów IPSE przy użyciu narzędzi do pobierania kolonii.

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Transfekcja, selekcja i pobieranie kolonii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych, ukierunkowanych za pomocą TALEN z genem GFP do bezpiecznego schronienia AAVS1

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film opisuje precyzyjną technikę edycji genomu w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC), wykorzystującą TALENy do tworzenia dwuniciowych pęknięć w docelowym locus, indukując ukierunkowaną homologię naprawę integracji genów białka fluorescencji.

Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Naucz się edycji genów TALEN w locus AAVS1 w ludzkich komórkach iPSC z wykorzystaniem GFP jako markera. Protokół obejmuje transfekcję, selekcję puromycyną i izolację klonów.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor (Wideo) | JoVE Journal

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Przeglądaj więcej filmów