Ocena barier gatunkowych pasażowalnej encefalopatii gąbczastej za pomocą testu konwersji białka prionowego in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena bariery gatunkowej dla transmisyjnych encefalopatii gąbczastych, znanych jako TSE, w odniesieniu do danego gatunku, bez konieczności przeprowadzania prób na żywych zwierzętach. Osiąga się to poprzez przygotowanie dwóch substratów do testu konwersji, które zostaną wykorzystane w badaniu in vitro. Drugim krokiem jest inkubacja tych substratów z czynnikami TSE, które mają zostać poddane testom.

Po trawieniu Proteinazą K próbki poddawane są elektroforezie SDS-PAGE oraz immunoblottingowi. Końcowym etapem jest pomiar ilości białka PreOn opornego na działanie proteinazy K w każdym substracie przy użyciu cytometrii przepływowej oraz porównanie tych wartości poprzez obliczenie współczynnika wydajności konwersji (CER). Ostatecznie CER stanowi miarę bariery gatunkowej dla testowanego TSE w odniesieniu do gatunku gospodarza, z którego przygotowano substrat.

Zalety tego testu obejmują niski koszt, krótki czas trwania eksperymentu oraz zastąpienie żywych zwierząt próbkami tkanek. Chociaż metoda ta dobrze nadaje się do badania barier gatunkowych w przypadku chorób prionowych u dzikich zwierząt, może ona zostać zastosowana do dowolnego innego gatunku. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności przy przygotowaniu podłoża, kontroli jakości oraz standaryzacji.

Po uzyskaniu zdrowej, niezakażonej tkanki mózgowej z badanego gatunku, należy przygotować 10% (masowych w objętości) homogenat w buforze lizującym, używając młynka kuleczkowego lub moździerza z tłuczkiem. Następnie należy dodatkowo udoskonalić homogenaty, poddając je homogenizacji za pomocą strzykawki i igły, stosując igły o coraz mniejszej średnicy, aż do momentu, gdy substrat będzie można z łatwością aspirować i wypychać przez igłę o rozmiarze 27 G. Następnie homogenat mózgowy należy podzielić na dwie równe objętości do osobnych, oznakowanych plastikowych probówek stożkowych i dodać do każdej z nich 3 M chlorku guanidyny w XPBS o pH 3,5 lub 7,4 w stosunku objętościowym 1:1 do homogenatu mózgowego.

Następnie należy sprawdzić wartości pH roztworów substratów i w razie potrzeby użyć stężonego kwasu solnego lub wodorotlenku sodu, aby upewnić się, że pH każdego substratu mieści się w przedziale plus lub minus 0.05 od wartości docelowej. Roztwory należy mieszać w mieszalniku obrotowym w temperaturze pokojowej przez pięć godzin. Następnie należy wytrącić białko, dodając do roztworów substratów w każdej probówce stożkowej cztery objętości metanolu, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez 16 do 18 godzin.

Po inkubacji osadź próbki poprzez wirowanie przy 13 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odlej i odrzuć supernatranty, a z osadów odparuj metanol. Aby pomóc w usunięciu metanolu przywierającego do wnętrza probówki, użyj aplikatorów z watowym końcem.

Nie dopuszczać do nadmiernego wysuszenia osadów. Przejść do następnego kroku, gdy metanol nie będzie już widoczny; do resuspensji osadów białkowych należy użyć ilości buforu konwersyjnego równej ilości wyjściowego homogenatu mózgu. Po resuspensji krótko sonikować roztwory substratów przez 10 sekund.

Sonicuj w kąpieli ultradźwiękowej przy mocy wynoszącej około 30% mocy maksymalnej. Następnie rozdziel roztwory w objętościach od 0,5 do 1 mL do opisanych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, ponieważ białko prionowe komórkowe w obu substratach powinno być wrażliwe na proteinazę K. Potraktuj 10 do 25 µL każdego substratu proteinazą K w stężeniu końcowym 100 µg/mL i traw próbki przy 1000 RPM w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę w wytrząsarce termicznej; załaduj substraty trawione proteinazą K wraz z 10 do 25 µL każdego z nietrawionych substratów.

Na żelu SDS-PAGE wykonano elektroforezę i blokowanie immunologiczne z użyciem przeciwciała specyficznego dla białka prionowego w celu oceny gospodarczego białka prionowego, odporności na proteinazę K oraz poziomu nieprzetrawionego białka. Ten obraz przedstawia wyniki immunoblotingu. Dwie pierwsze ścieżki zawierają substraty nieprzetrawione, a dwie ścieżki po prawej stronie zawierają substrat przetrawiony proteinazą K.

Jeśli poziomy białek w substratach o pH 7,4 i 3,5 różnią się od siebie o nie więcej niż około 10% i nie wykazują odporności na proteinazę K, pary substratów są odpowiednie do zastosowania w badaniach CER; pozostałe alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia testu CER. Czynniki TSE należy traktować z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego oraz zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Po uzyskaniu zainfekowanej tkanki mózgowej TSE od gatunku będącego przedmiotem zainteresowania, należy przygotować 10% homogenat (masowy w objętości) w 1xPBS o pH 7,4, stosując metodę homogenizacji użytą wcześniej do przygotowania par substratów.

Rozdziel uzyskane homogenaty w objętościach od 100 do 300 µL do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy CER. Aby rozpocząć, powoli rozmroź równe ilości nieinfekowanego podłoża CER o pH 3,5 i 7,4 oraz roztworów nasiennych zainfekowanych prionami i TSE, umieszczając je na kruszonym lodzie przez około jedną godzinę. Po rozmrożeniu utrzymuj roztwory w lodzie, a następnie ponownie je zhomogenizuj, aspirując i wypuszczając każdy roztwór podłoża przez igłę strzykawki o rozmiarze 27G.

Następnie każdy roztwór zainfekowany TSE poddaj krótkiej sonikacji przez 10 sekund przy mocy wynoszącej około 30% mocy maksymalnej. Następnie przygotuj reakcje konwersji w oznakowanych probówkach PCR o cienkich ściankach i niskim wiązaniu, pipetując 95 µL substratu CER. Do dwóch probówek wprowadź substrat CER przygotowany przy pH 7,4 (w dubletach), a do dwóch kolejnych probówek 95 µL substratu CER przygotowanego przy pH 3,5 (w dubletach).

Następnie dodaj 5 µL roztworu zakażonych nasion w 10%TSE do jednej probówki z podłożem o pH 7,4 oraz do jednej probówki z podłożem o pH 3,5. Równolegle dodaj 5 µL buforu konwersyjnego do drugiej probówki z podłożem o pH 7,4 oraz do drugiej probówki z podłożem o pH 3,5, aby kontrolować nieswoistą konwersję bez matrycy. Przygotuj również kontrolę dla wejściowego białka prionowego opornego na proteinazę K.

Dla każdego badanego czynnika TSE dodaj pięć mikrolitrów 10% roztworu ziarna zainfekowanego TSE do 95 mikrolitrów buforu konwersyjnego w ramach kontroli. Krótko wymieszaj każdą próbkę w zamkniętej probówce PCR za pomocą wibratora typu vortex, aby połączyć substrat. Następnie poddaj próbki krótkiemu wirowaniu w niskiej prędkości laboratoryjnej miniwirówce naktowej, aby usunąć wszelką objętość mieszaniny reakcyjnej uwięzioną w zakrętce probówki PCR.

Umieść probówki w blatowym wytrząsarce termicznej przystosowanej do probówek PCR i inkubuj próbki przy 1000 RPM w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Następnego dnia dodaj sarco cell do stężenia końcowego 2% w/v oraz proteinazę K do stężenia końcowego 100 µg/mL. Traw próbki przy 1000 RPM w temperaturze 37°C przez jedną godzinę w wytrząsarce termicznej. Dodaj bufor do próbek SDS-PAGE, podgrzej próbki do 95°C przez 10 minut i rozdziel pozostałe białko PreOn oporne na proteinazę K w każdej próbce za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeprowadź immunoblotting jak wcześniej. Na koniec oblicz współczynnik wydajności konwersji jako miarę bariery gatunkowej.

Zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym, substrat do testu CER przygotowany przy pH 7,4 lub 3,5 inkubowano z mysim szczepem scrapie RML, scrapie owiec domowych, chroniczną wyniszczającą chorobą jelenia białogona lub szczepem 2 63 K scrapie adaptowanego do chomików. W teście CER próbki kontrolne oznaczone jako none zawierały równą ilość czynnika zakaźnego, a próbki substratu mysiego analizowano pod kątem obecności białka prionowego opornego na proteinazę K za pomocą immuno-blotu z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego SAF 83.

Surowe wartości tric dla każdej próbki są wyświetlone poniżej każdego pasma po zastosowaniu proteinazy. Poziomy białka prionowego opornego na pronazę K były zmienne w zależności od substratów mysich, denaturowanych przy pH 7,4 i inkubowanych z różnymi czynnikami TSE. Chociaż białko prionowe oporne na pronazę K stwierdzono we wszystkich substratach denaturowanych przy pH 3,5 i inkubowanych z czynnikiem TSE, niniejszy wykres słupkowy przedstawia średnie stosunki z odchyleniem standardowym między substratami mysimi o pH 7,4 i 3,5 dla każdego czynnika zakaźnego, na podstawie co najmniej trzech niezależnych serii analiz.

Małe litery odnoszą się do statystycznie jednorodnych podzbiorów określonych przez wartość p mniejszą niż 0,05 przy zastosowaniu analizy wariancji z metodą najmniejszych istotnych różnic Tukeya-Kramera. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w mniej niż 48 godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Test CER może służyć jako wstępna ocena istnienia bariery gatunkowej TSE, co może uzasadniać lub wykluczyć konieczność przeprowadzenia dodatkowych badań na żywych zwierzętach.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania substratów, przeprowadzania reakcji konwersji oraz obliczania współczynników wydajności konwersji w celu oceny barier gatunkowych.