Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i zwoju korzenia grzbietowego lub współkomórek neuronów DRG do badania regeneracji nerwów in vitro. Osiąga się to poprzez uzyskanie najpierw niezróżnicowanych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczura. W drugim etapie komórki są różnicowane w komórki podobne do Schwana za pomocą koktajlu czynników wzrostu.

Następnie neurony DRG są pobierane z rdzenia kręgowego szczura i łączone w ostatnim etapie, neurony są umieszczane na zróżnicowanych komórkach macierzystych w celu wytworzenia systemu kohodowli in vitro. Ostatecznie komórki są barwione pod kątem markerów neuronalnych i glejowych w celu ułatwienia wzrostu neurytów, kwantyfikacji i obrazowane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej w celu oceny morfologicznej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na różne pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, na przykład, w jaki sposób odpowiednie komórki macierzyste tkanki tłuszczowej oddziałują z neuronami narządowymi na różnych biomateriałach?

Powód, dla którego demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ obejmuje kroki, których trudno się nauczyć ze względu na niską dostępność i mały rozmiar tkanek w komorze biologicznej. Zacznij od użycia nożyczek i sterylnej żyletki, aby drobno posiekać tłuszcz trzewny i pachwinowy zebrany od dorosłych samców szczurów spro dolly do uzyskania delikatnej konsystencji. Następnie przenieś powstałą zawiesinę tłuszczu do probówki zawierającej 15 mililitrów świeżo przygotowanego filtra, wysterylizuj roztwór kolagenazy typu pierwszego i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem przez 30 do 60 minut.

Uważnie monitoruj trawienie, zatrzymując się, zanim tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, aby poprawić żywotność i wydajność komórek. Gdy chusteczka będzie gotowa, przefiltruj ją przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów. Dobre trawienie zaowocuje jednorodną konsystencją tłuszczu, która wydaje się beżowa z delikatnym wirowaniem.

Zneutralizuj enzymy trawienne za pomocą 15 mililitrów pożywki do wzrostu komórek macierzystych o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej FBS. Następnie odwiruj komórki, aby zebrać frakcję naczyniową zrębu. Odessać supinat zaczynając od wierzchniej warstwy tłuszczu.

Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu ISIS do krwinek czerwonych z pipetowaniem. Po minucie przerwij lizę, dodając 10 mililitrów świeżej, pożywki i ponownie odwiruj do komórek. Teraz ostrożnie zassać supernatant S.

Ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki i zasiej komórki w 75 centymetrach kwadratowych. Kolby o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Utrzymuj komórki na poziomach sub konfluencji do pierwszego lub drugiego pasażu, przy którym komórki są gotowe do różnicowania się w komórki podobne do Schwana przez leczenie etanolem beta more cap i kwasem retinowym w celu uzyskania neuronów DRG po pobraniu rdzenia kręgowego.

Zacznij od usunięcia wszelkich części grzbietowych, a następnie użyj sterylnych i ostrych nożyczek chirurgicznych, aby podzielić kręgosłup na pół wzdłuż osi podłużnej, odsłaniając tkankę pępowinową. Przetnij kręgosłup na dwa mniejsze segmenty poniżej poziomu klatki piersiowej, a następnie użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie usunąć całą tkankę pępowinową. Uważając, aby nie wyrwać i nie usunąć korzeni DRG, które wyglądają jak białe włókna wychodzące bezpośrednio z kanałów.

Po usunięciu całej tkanki rdzeniowej użyj bardzo cienkich kleszczy, aby pociągnąć cały korzeń DRG, sięgając głęboko do kanałów kręgowych i uważając, aby nie uszkodzić korzeni zwojów. Umieść DRG w naczyniu na drzewo domowe o powierzchni 60 milimetrów kwadratowych zawierającym od trzech do czterech mililitrów pożywki z szynkami F 12 uzupełnionej antybiotykami. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć nadmiar korzeni nerwowych otaczających zwoje, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek satelitarnych.

Następnie przenieś DRG na szalkę Petriego o powierzchni 35 milimetrów kwadratowych zawierającą 1,8 mililitra świeżej pożywki F 12 i dodaj 200 mikrolitrów kolagenazy. Roztwór podstawowy typu czwartego. Inkubować DRG przez godzinę, a następnie ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą.

Uważając, aby nie zassać ani nie uszkodzić DRG. Powtórz krok kolagenazy i przemyj DRG pożywką F 12. Po drugim praniu dodaj do komórek 1,8 mililitra pożywki F 12 i 200 mikrolitrów trypsyny.

Usunięcie trypsyny i dodanie jednego mililitra pożywki uzupełnionej 500 mikrolitrami FBS w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Następnie odessać pożywkę i delikatnie przemyć DRG trzykrotnie pożywką F 12, aby usunąć wszelkie ślady surowicy. Teraz nakarm komórki dwoma mililitrami świeżej pożywki F 12 i za pomocą szklanej pipety ostrożnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Pipetuj w górę i w dół osiem do 10 razy, aby delikatnie rozdzielić neurony, a następnie pozwól podniebieniu zgromadzić się na dnie rurki, gdy podniebienie się uspokoi. Przenieś supinat do nowej probówki i dodaj dwa mililitry świeżej pożywki F 12 do podniebienia. Powtarzająca się dysocjacja mechaniczna i transfer medium do zawiesiny staje się jednorodny.

Następnie ponownie ocenić zawiesinę komórkową trzy do czterech razy, a następnie przefiltrować powstałą homogenizowaną zawiesinę przez sitko komórkowe o średnicy 100 mikronów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwiruj komórki w 15-mililitrowej probówce, podczas gdy powoli się obracają, odpipetuj świeżo przygotowaną pipetę. 15% albumina surowicy bydlęcej w dół wnętrza 15-mililitrowej probówki, utrzymywana pod kątem 45 stopni, aby utworzyć stopniowy ślad białka.

Używając liczb na probówce jako odniesienia dla ścieżki formowania, a następnie odessaj snat z komórek, oszczędzając ostatnie 500 mikrolitrów na resus, zawieszając osad i powoli dozując komórki wzdłuż szlaku białkowego do nowej probówki. Po odwirowaniu komórek, ponownie, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze zmodyfikowanego podłoża BS i zasiej komórki w małej objętości podłoża. W 24-dołkowej płytce przez dwie godziny, gdy komórki się przyłączą, dodaj świeżą pożywkę BS uzupełnioną 15 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu nerwów po dysocjacji.

Komórki DRG mogą być również wykorzystywane do kohodowli z komórkami macierzystymi tkanki tłuszczowej przypominającymi komórki łabędzia poprzez wysiewanie ich na komórkach przednasiennych. Obrazy te pokazują znaczenie komórek macierzystych tkanki tłuszczowej podobnych do komórek Schwana dla kiełkowania DRG Neurite w modelu kohodowli przy użyciu folii polikaprolaktonowych jako substratów. Nie zaobserwowano żadnych neurytów na nieleczonych powierzchniach przy braku komórek macierzystych tkanki tłuszczowej przypominających komórki łabędzia, podczas gdy tworzenie neurytów uległo wyraźnej poprawie w systemie kohodowli.

Średnio liczba neurytów na ciało komórki znacznie wzrasta w obecności komórek macierzystych. Rzeczywiście, jak pokazują te obrazy, zdolność neuronów DRG do kiełkowania neuronów występuje preferencyjnie w połączeniu ze zróżnicowanymi komórkami macierzystymi, jak wskazuje żółte strzałki róży. Wiec po oglądnieciu tego filmu powinienes byc w stanie uzyskac wywodzic komórek macierzystych i zdysocjowac neurony DGen.

Ale także powinieneś być w stanie skonfigurować model do badania w obwodowym średnim zwyrodnieniu.