Name: Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj protokół transplantacji szpiku kostnego z użyciem busulfanu jako alternatywę dla napromieniowania u myszy. Ta metoda umożliwia generowanie stabilnego chimeryzmu i badanie akumulacji komórek szpikowych w ośrodkowym układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research Research (do KP) oraz grant Neuromuscular Research Partnership Program od CIHR, ALS Society of Canada i Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) dla CK i FMR. Dodatkowego wsparcia udzieliło również ALS Society of America (57969). Chcielibyśmy podziękować dr R. Keithowi Humphriesowi z Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Kanada oraz personelowi Simon Fraser University Animal Care Unit.

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Simona Frasera (UACC; numery zezwoleń 1037K-12 i 1060K-03) i jest zgodny z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami, Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Dyrektywą Rady EWG.
1. Uwagi specjalne
UWAGA: Busulfan jest cytotoksyczny. Obchodzić się z materiałem niebezpiecznym i utylizować zgodnie z kartą charakterystyki i wytycznymi instytucji.
<ol>
	<li>Wszystkie techniki należy wykonywać aseptycznie w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Sterylizuj narzędzia przed użyciem, owijając je w odpowiedni materiał opakowaniowy, taki jak opakowanie typu peel i sterylizując w autoklawie.</li>
	<li>Chociaż ryzyko zakażenia jest mniejsze w przypadku kondycjonowania busulfanu w porównaniu z napromienianiem, ze zwierzętami należy obchodzić się tylko w kapturze z przepływem laminarnym przez pierwsze 2 tygodnie po przeszczepie.</li>
</ol>
2. Kondycjonowanie myszy biorców
<ol>
	<li>Rozcieńczyć busulfan do 3 mg/ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). 
	UWAGA: Ważne jest, aby ponownie rozcieńczyć busulfan tuż przed użyciem każdego dnia po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Podawać 20 mg/kg rozcieńczonego busulfanu myszom biorcom we wstrzyknięciu IP dziennie.</li>
	<li>Powtarzać codzienne wstrzyknięcia IP busulfanu w dawce 20 mg/kg mc., aż do uzyskania całkowitej dawki 60-100 mg/kg mc. (tj. w przypadku całkowitej dawki 80 mg/kg mc. należy podawać 20 mg/kg mc. busulfanu przez 4 kolejne dni).</li>
</ol>
3. Izolacja komórek szpiku kostnego dawcy
UWAGA: Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do izolacji i przygotowania komórek BM od maksymalnie 5 myszy dawców. Zazwyczaj wydajność komórek na mysz wynosi około 30-40 milionów BMDC, co wystarcza do przeszczepienia 12-16 myszy biorców. Jeśli potrzebnych jest więcej myszy dawców, może być konieczne odpowiednie dostosowanie protokołu.
<ol>
	<li>Po ostatnim dniu kondycjonowania busulfanu należy poddać eutanazji mysz dawcę GFP (w wieku od jednego do sześciu miesięcy) przy użyciu CO2 (lub za pomocą innej procedury eutanazji akceptowanej w placówce). Aby uniknąć powikłań po przeszczepie, należy używać dawców syngenicznych, którzy są tej samej płci co biorcy.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę na brzuchu i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie przez skórę od jamy brzusznej w górę nogi w kierunku kostki. Trzymając stopę, mocno pociągnij skórę od kostki w kierunku biodra, odsłaniając tkankę nogi</li>.
	<li>Odetnij tkankę mięśniową i tłuszczową z kości udowej, aby odsłonić staw biodrowy.</li>
	<li>Delikatnie ciągnąc za stopę, aby wyprostować nogę, dociśnij nożyczki do stawu biodrowego. Wytnij tuż nad głową kości udowej, uważając, aby nie przeciąć samej kości udowej.</li>
	<li>Aby pomóc w utrzymaniu bezpłodności, trzymaj nogę za stopę i oczyść pozostałą tkankę z kości, pocierając powierzchnię kości autoklawowanymi tkankami.</li>
	<li>Oddziel kość udową i piszczelową, przecinając staw kolanowy i umieść kość udową w naczyniu hodowlanym zawierającym sterylny PBS. Inkubować na lodzie.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć kość strzałkową, przecinając w miejscach, w których kość strzałkowa łączy się z piszczelem. Umieść piszczel w naczyniu hodowlanym z kością udową i inkubuj na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.7 dla drugiej nogi i, jeśli to konieczne, dodatkowych myszy dawców. Po usunięciu kości wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub użyj nowego zestawu sterylnych narzędzi do kolejnych kroków.</li>
	<li>W przypadku kości udowych przytrzymaj kość udową kleszczami i za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie "ogol" dystalne końce kości. Usuń tyle kości, ile jest konieczne, aby odsłonić jamę BM.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 3 ml jałowego PBS i założyć igłę 23 G. Ostrożnie wwiercić igłę w jamę BM i przepłukać BM do sterylnego naczynia hodowlanego. Pamiętaj, aby zeskrobać jamę szpikową czubkiem igły, aby zapewnić usunięcie wszystkich pożądanych komórek. Po ekstrakcji upewnij się, że czerwony BM nie jest już widoczny, a kość wydaje się teraz biała.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.9-3.10 dla kolejnych kości udowych, gromadząc wszystkie BM w tym samym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>W przypadku kości piszczelowych chwyć kość piszczelową kleszczami i ostrożnie "ogol" koniec, w którym piszczel była przymocowana do kolana, aby odsłonić jamę BM. Wykonaj drugie cięcie wzdłuż kości w miejscu, gdzie kończy się widoczny czerwony BM.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 3 ml jałowego PBS i założyć igłę 25 G. Delikatnie wbić igłę do jamy BM (od końca, który był przymocowany do kolana) i przepłukać BM do naczynia hodowlanego zawierającego BM z kości udowych. Zeskrob ściany jamy BM igłą, aby usunąć wszystkie komórki. Po ekstrakcji upewnij się, że czerwony BM nie jest już widoczny, a kość wydaje się teraz biała.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.12-3.13 dla kolejnych piszczeli, łącząc wszystkie BM w tym samym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Delikatnie rozetrzeć BM za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby oddzielić komórki.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez filtr koszowy 40 μM do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wypłucz naczynie PBS, aby uzyskać pozostałe komórki i przenieś je przez filtr do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.</li>
	<li>Dodać ~30 ml sterylnego PBS, aby ugasić bufor lizujący.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml jałowego PBS. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Weź małą porcję homogenatu komórkowego i rozcieńcz PBS (1:100 dla 1 myszy; 1:200 dla 2 myszy itd.), aby określić ilościowo liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 8 x 106 komórek/ml i inkubować na lodzie aż do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Przeszczep szpiku kostnego
<ol>
	<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 0,5 ml (igłą insulinową 28 g) 300 μl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej dla każdej myszy przeznaczonej do wstrzyknięcia. Należy upewnić się, że usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się w strzykawce.</li>
	<li>Umieść klatkę myszy zawierającą kondycjonowane myszy biorcę na poduszce grzewczej i pozwól żyłom ogonowym się rozszerzyć.</li>
	<li>Weź mysz odbiorcy i umieść ją w urządzeniu krępującym. Przetrzyj ogon gazą chirurgiczną nasączoną 70% etanolem.</li>
	<li>Mocno przytrzymaj ogon i skosem do góry delikatnie włóż igłę do jednej z bocznych żył ogonowych i wstrzyknij zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Trzymać gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia do momentu ustania krwawienia przed umieszczeniem myszy w nowej, czystej klatce.</li>
</ol>
5. Szacowanie zakresu chimeryzmu BM
UWAGA: Poziomy chimeryzmu są zazwyczaj zmienne we krwi obwodowej po 1 tygodniu od BMT, a zatem poziomy chimeryzmu są zwykle szacowane co najmniej 2 tygodnie po BMT. Poziom chimeryzmu powinien osiągnąć >80% komórek GFP+ we krwi obwodowej w ciągu 3-4 tygodni po BMT.
<ol>
	<li>Przygotować bufor FACS (2 mM EDTA + 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS). 
	UWAGA: Bufor FACS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Umieść mysz w rurce krępującej i ogol futro na tylnej nodze, aby odsłonić boczną żyłę odpiszczelową.</li>
	<li>Cienko pokryj nogę wazeliną i przebij żyłę odpiszczelową igłą 25 G.</li>
	<li>Zebrać około 50 μl krwi za pomocą rurki kapilarnej pokrytej heparyną. Dodać krew do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml buforu FACS. Wymieszaj probówkę przez odwrócenie i przechowuj na lodzie.</li>
	<li>Przytrzymaj gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie, zanim wrócisz do klatki.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi przez 5 minut przy 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS, aby ugasić bufor lizujący.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 5 minut przy sile 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Wykonać drugi etap lizy w 500 μl buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 8,5 min.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS, aby ugasić bufor lizujący.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 5 minut przy sile 900 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant. Sprawdź, czy granulka jest teraz biała. 
	UWAGA: Jeśli granulka nadal wydaje się czerwona, przed przejściem do następnego kroku może być potrzebny dodatkowy etap lizy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu FACS. Odwirowywać próbki przez 5 minut przy 900 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu FACS i określić ilościowo komórki GFP+ za pomocą cytometrii przepływowej (UWAGA: W tym momencie można przeprowadzić dowolne pożądane barwienie immunologiczne komórek, przy użyciu standardowych technik, przed analizą cytometryczną przepływową).</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHickey%2C+WF+%22Science+%28New+York%2C+N.+Y.%29%22">Science (New York, N. Y.)</a>. 239 (4837), 290-292 (1988).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reconstitution+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+reduced-intensity+conditioning+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens.</a> Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).</li>
<li>Ellen Nath, C., John Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Busulphan+in+blood+and+marrow+transplantation%3A+dose%2C+route%2C+frequency+and+role+of+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Current+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring.</a> Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).</li>
<li>Galaup, A., Paci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+dimethanesulfonate+alkylating+agents%3A+busulfan+and+treosulfan%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).</li>
<li>Lewis, C. -A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelosuppressive+Conditioning+Using+Busulfan+Enables+Bone+Marrow+Cell+Accumulation+in+the+Spinal+Cord+of+a+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60661(2013).</li>
<li>Capotondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+conditioning+is+instrumental+for+successful+microglia+reconstitution+following+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).</li>
<li>Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Busulfan+Conditioning+Enhances+Engraftment+of+Hematopoietic+Donor-derived+Cells+in+the+Brain+Compared+With+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).</li>
<li>Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+bone+marrow-derived+cells+into+the+CNS+in+models+of+neurodegeneration%3A+Naturally+Occurring+Migration+of+BMDC+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS.</a> Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).</li>
<li>Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Cell+Recruitment+to+the+Brain+in+the+Absence+of+Irradiation+or+Parabiosis+Bias%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias.</a> PLoS ONE. 8 (3), e58544(2013).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression%2C+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li>
<li>Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+and+allogeneic+bone+marrow+engraftment+after+total+body+irradiation%3A+dependence+on+dose%2C+dose+rate%2C+and+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation.</a> Blood. 77 (3), 661-669 (1991).</li>
<li>Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+myeloablative+regimen+with+clinical+potential%3A+I.+Treosulfan+conditioning+and+bone+marrow+transplantation+allow+induction+of+donor-specific+tolerance+for+skin+grafts+across+full+MHC+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers.</a> Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Andersson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+therapy+with+intravenous+busulfan+and+cyclophosphamide+%28IV+BuCy2%29+for+hematologic+malignancies+prior+to+allogeneic+stem+cell+transplantation%3A+a+phase+II+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).</li>
<li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+concentrations+of+busulfan+during+high-dose+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy.</a> Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).</li>
<li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+distribution+of+%5B11C%5D-busulfan+in+cynomolgus+monkey+and+in+the+brain+of+a+human+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Harrison, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+repopulation%3A+a+new+assay+for+long-term+stem+cell+functional+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity.</a> Blood. 55 (1), 77-81 (1980).</li>
<li>Evans, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+imaging+reveals+that+blood-derived+macrophages+but+not+resident+microglia+facilitate+secondary+axonal+dieback+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kondycjonowanie busulfanem pozwala na generowanie chimeryzmu BM wysokiego poziomu u myszy z łatwo wykrywalnymi komórkami krwiotwórczymi. Kondycjonowanie to można przeprowadzić bez konieczności stosowania urządzeń do napromieniania. Co więcej, supresja szpiku kostnego za pomocą dawek busulfanu opisanych w tym protokole jest dobrze tolerowana, minimalizując toksyczne skutki uboczne spowodowane mieloablacyjnymi dawkami promieniowania, a zatem może być bardziej odpowiednią techniką generowania chimeryzmu BM u młodych, staryc...

Ostatnio pojawiło się znaczne zainteresowanie rolą mikrogleju i komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), zarówno podczas choroby, jak i przy normalnym starzeniu się. Obecnie wiadomo, że mikroglej, rezydujące komórki odpornościowe OUN, rozwijają się w OUN po wejściu prymitywnych komórek progenitorowych szpiku podczas embriogenezy1. Mikroglej zachowuje aspekty swojej linii mielomonocytarnej aż do dorosłego życia. Chociaż dowody sugerują, że udział BMDC w puli mikrogleju jest minimalny u zdrowych dorosłych zwierząt1, rola, jaką BMDC odgrywają w progresji różnych chorób neurodegeneracyjnych, pozostaje niejasna. Niepewność tę potęguje fakt, że trudno jest odróżnić BMDC, które gromadzą się w OUN, od endogennego rezydującego mikrogleju, ponieważ nie zidentyfikowano powszechnie akceptowanego dyskryminującego markera immunohistochemicznego. W celu monitorowania BMDC in vivo stosujemy protokół przeszczepu BM (BMT), w którym endogenne komórki BM myszy biorcy są zastępowane komórkami myszy dawcy z wszechobecną ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora β-aktyny. Protokół ten pozwala na określenie zarówno lokalizacji, jak i morfologii BMDC GFP+ w myszy biorcy za pomocą immunohistochemii i ułatwia dalszą charakterystykę tych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), a następnie kolejnych testów biochemicznych. 
Aby BMT zakończyło się sukcesem, komórki BM biorcy muszą zostać poddane ablacji (tzw. mieloablacja) w celu wytworzenia niszy w BM biorcy, która umożliwi wszczepienie komórek dawcy. Często mieloablację uzyskuje się za pomocą promieniowania gamma całego ciała, które indukuje pęknięcia podwójnej nici w DNA, co prowadzi do śmierci komórki, szczególnie w aktywnie dzielących się komórkach, takich jak hematopoetyczne komórki progenitorowe2,3. Protokoły napromieniania przeprowadza się w celu wywołania wystarczającej śmierci komórek BM, tak aby śmiertelność zwierzęcia donosiła do skutku, jeżeli zwierzę biorcy nie uzyska odpowiedniego wszczepienia komórek dawcy z BMT (tzw. "napromienianie śmiertelne"). Napromienianie wymaga jednak specjalistycznego urządzenia i sprzętu, a także zasobów weterynaryjnych i hodowli zwierząt, które nie są dostępne dla badaczy we wszystkich instytucjach. Ponadto napromienianie mieloablacyjne może powodować potencjalnie śmiertelne uszkodzenia innych tkanek, a ze względu na immunosupresję napromieniane zwierzęta są bardziej podatne na wtórne infekcje3. W związku z tym opracowano schematy kondycjonowania o zmniejszonej intensywności (tak zwane protokoły "RIC"), które mają na celu zminimalizowanie potencjalnie toksycznych skutków ubocznych protokołu kondycjonowania u pacjentów, szczególnie do stosowania w populacjach ryzyka, takich jak dzieci i osoby starsze4. 
Niektóre protokoły RIC opierają się na chemioterapeutykach, takich jak busulfan, w celu kondycjonowania przedziału BM. Busulfan jest dwufunkcyjnym środkiem alkilującym DNA, często stosowanym klinicznie jako alternatywa dla napromieniania5,6. Warto zauważyć, że busulfan może być bezpiecznie podawany myszom przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) i nie wymaga specjalistycznych urządzeń i sprzętu niezbędnego do napromieniania myszy. Kondycjonowanie busulfanem było szeroko stosowane w naszym laboratorium7, a także w kilku innych ostatnich publikacjach 8-11. Przy zastosowaniu dawek 60-100 mg/kg mc. można ustalić wysoki stopień stabilnego chimeryzmu (>80% komórek GFP+) we krwi obwodowej i BM7. Co ważne, przy tych dawkach mieloablacja nie jest kompletna i jako takie myszy są w stanie przetrwać bez otrzymywania wspierających komórek BM (K. Peake, J. Manning, C. Lewis i C. Krieger, niepublikowane obserwacje). Co więcej, przy kondycjonowaniu busulfanu mielosupresyjnym dochodzi do szybkiej rekonstytucji komórek mielomonocytarnych krwi obwodowej przez komórki dawcy. Jednak zastępowanie limfocytów krwi obwodowej przez komórki dawcy jest wolniejsze, co podkreśla brak immunosupresji, która występuje w przypadku dawek 60-100 mg/kg busulfanu w porównaniu z napromienianiem całego ciała7. 
Udało nam się wykorzystać chimeryzm wywołany busulfanem do zbadania BMDC u myszy dzikich typów, a także w mysich modelach zaburzeń neurodegeneracyjnych stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)7 i choroby Alzheimera. Zaobserwowano, że w pewnych warunkach znaczna liczba BMDC GFP+ gromadzi się w OUN7,12. Co ważne, podobnie jak kondycjonowanie mieloablacyjne z napromienianiem, kondycjonowanie busulfanem, a następnie BMT jest wystarczające, aby umożliwić akumulację GFP+ BMDC w OUN zarówno u myszy typu dzikiego, jak i myszy z zaburzeniami neurologicznymi 7-11. Ponieważ główną przeszkodą w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych jest zdolność do przenoszenia cząsteczek terapeutycznych z krążenia do OUN, gdzie mogą wywierać korzystne skutki, stwarza to możliwość, że BMDC mogą być modyfikowane do ekspresji cząsteczek terapeutycznych, a następnie wykorzystywane jako nośnik do dostarczania leków do OUN biorców kondycjonowanych busulfanem. Jest to mechanizm, nad którym aktywnie pracujemy. Chociaż stwierdziliśmy, że kondycjonowanie mieloablacyjne z napromienianiem prowadzi do większej akumulacji BMDC GFP+ w OUN w porównaniu z kondycjonowaniem busulfanem7, napromienianie może mieć znaczną toksyczność u pacjentów z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i w mysich modelach choroby OUN.
Podczas gdy my, jak i wielu innych, używaliśmy modeli BMT do badania BMDC w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, możliwość zastąpienia komory BM myszy biorcy wyraźnie rozpoznawalną populacją komórek BM jest nieocenionym narzędziem do badania różnych aspektów układu krwiotwórczego. Obejmuje to szeroki zakres tematów badawczych, takich jak rozwój linii krwiotwórczej, białaczka, przeszczepianie narządów, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i immunobiologia.

<table><tbody><tr><td>Busulfex</td><td>Otsuka Kanada Pharmaceutical Inc.</td><td>DIN 02240602</td><td>Rozcieńczyć busulfan do 3 mg/ml sterylnym PBS tuż przed użyciem. Busulfanan jest cytotoksyczny. Utylizuj i utylizuj zgodnie z kartą charakterystyki i wytycznymi instytucji.</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>Można zastąpić inny bufor do lizy, ale może być konieczne odpowiednie dostosowanie czasu inkubacji</td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>płodu bydlęcego</td><td>12483-020</td><td></td></tr></tbody></table>

busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

Przeszczep szpiku kostnego (BMT) jest często stosowany do zastąpienia przedziału szpiku kostnego (BM) myszy biorców komórkami BM wyrażającymi odrębny biomarker wyizolowany od myszy dawców. Technika ta pozwala na identyfikację komórek krwiotwórczych pochodzących od dawcy u myszy biorców i może być stosowana do izolowania i charakteryzowania komórek dawcy przy użyciu różnych technik biochemicznych. BMT zazwyczaj opiera się na kondycjonowaniu mieloablacyjnym z napromienianiem całego ciała w celu wytworzenia niszy w przedziale BM myszy biorców do wszczepienia komórek dawcy. Opisany przez nas protokół wykorzystuje kondycjonowanie mielosupresyjne za pomocą chemioterapeutyku busulfan. W przeciwieństwie do napromieniania, które wymaga użycia specjalistycznych urządzeń, kondycjonowanie busulfanu przeprowadza się za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć 20 mg/kg busulfanu, aż do podania całkowitej dawki 60-100 mg/kg. Co więcej, napromienianie mieloablacyjne może mieć toksyczne skutki uboczne i wymaga udanego wszczepienia komórek dawcy w celu przeżycia myszy biorców. W przeciwieństwie do tego, kondycjonowanie busulfanu przy użyciu tych dawek jest na ogół dobrze tolerowane i myszy przeżywają bez wsparcia komórek dawcy. Komórki BM dawcy są izolowane z kości udowych i piszczelowych myszy z wszechobecną ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) i wstrzykiwane do bocznej żyły ogonowej kondycjonowanych myszy biorców. Chimeryzm BM szacuje się poprzez ilościowe określenie liczby komórek GFP+ we krwi obwodowej po BMT. Poziomy chimeryzmu >80% są zwykle obserwowane we krwi obwodowej 3-4 tygodnie po przeszczepie i utrzymują się przez co najmniej 1 rok. Podobnie jak w przypadku napromieniania, kondycjonowanie busulfanem i BMT pozwala na akumulację komórek pochodzących od dawcy BM w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), szczególnie w mysich modelach neurodegeneracji. Ta akumulacja OUN za pośrednictwem busulfanu może być bardziej fizjologiczna niż napromienianie całego ciała, ponieważ leczenie busulfanem jest mniej toksyczne, a zapalenie OUN wydaje się być mniej rozległe. Stawiamy hipotezę, że komórki te mogą być genetycznie modyfikowane w celu dostarczania leków do OUN.

Podawanie busulfanu w dawkach 60-100 mg/kg jest zazwyczaj dobrze tolerowane przez myszy. Jednak zwierzęta zazwyczaj tracą na wadze podczas fazy kondycjonowania (~5-10%), dlatego dieta może wymagać suplementacji przysmakami, takimi jak naświetlone nasiona słonecznika, aby zachęcić je do jedzenia. Poziomy chimeryzmu &gt;80% komórek GFP+ we krwi obwodowej i w szpiku kostnym (BM) powinny być konsekwentnie osiągalne przy zastosowaniu 60-100 mg/kg busulfanu7. Nasze laboratorium z powodzeniem zastosowało ten protokół...

Opisujemy protokół, w którym kondycjonowanie busulfanu pozwala na zastąpienie szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego od myszy dawców, które powszechnie wyrażają zielone białko fluorescencyjne, przy braku napromieniowania. Technika ta jest przydatna do badania akumulacji komórek szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym.

Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

Ogólnym celem tej procedury jest zastąpienie przedziału szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego myszy dawcy powszechnie wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Bez zastosowania napromieniowania. Jest to osiągane poprzez uprzednie przygotowanie myszy biorcy za pomocą seryjnych wstrzyknięć doszpikowych związku mielosupresyjnego, busalanu.Następnie komórki szpiku kostnego izoluje się z kości udowych i piszczeli myszy dawcy wykazującej powszechną ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Na koniec komórki szpiku kostnego dawcy przeszczepia się myszy biorcy poddanej kondycjonowaniu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Ostatecznie pobiera się krew z przeszczepionej myszy i analizuje ją za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić stopień chimeryzmu szpiku kostnego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak całkowite napromieniowanie organizmu, jest możliwość ustanowienia wysokiego stopnia chimeryzmu szpiku kostnego bez cytotoksycznych efektów całkowitego napromieniowania oraz bez konieczności korzystania ze specjalistycznych urządzeń i zaplecza. Metoda ta pozwala nie tylko na badanie akumulacji komórek pochodzących ze szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym, ale może być również wykorzystana do badania takich zagadnień jak rozwój linii hematopoetycznej, immunobiologia oraz białaczka. W celu przygotowania myszy biorcy przygotuj rozcieńczony busulfan zgodnie z protokołem tekstowym i podawaj 20 mg/kg masy ciała myszom biorcom codziennie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP).Po uśmierceniu myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, spryskaj mysz 70% ethanol. Podnieś skórę w okolicy brzucha i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry od jamy brzusznej, w górę nogi w kierunku kostki, trzymając stopę. Mocno odciągnij skórę od kostki w stronę biodra, odsłaniając tkanki nogi.Odetnij mięśnie i tkankę tłuszczową z kości udowej, aby odsłonić staw biodrowy, delikatnie pociągając za stopę. Aby wyprostować nogę, dociśnij nożyczki do kości miednicy i przetnij tkanki tuż powyżej głowy kości udowej, uważając, aby nie uszkodzić samej kości. Aby zachować sterylność, trzymaj nogę za stopę i usuń pozostałe tkanki z kości udowej za pomocą nożyczek oraz pęsety do oczyszczenia powierzchni kości.Oddziel kość udową od piszczeli, przecinając staw kolanowy, a następnie umieść kość udową w naczyniu hodowlanym zawierającym PBS i inkubuj na lodzie. Następnie usuń i odrzuć kość strzałkową, przecinając ją w miejscach, w których łączy się ona z piszczelą. Po tym oczyść piszczel.Odciąć stopę, przecinając kość piszczelową w miejscu zakończenia szpiku czerwonego, a następnie umieścić kość piszczelową w naczyniu hodowlanym wraz z kością udową i inkubować w lodzie. Za pomocą pęsety przytrzymać kość udową i ostrożnie, używając nożyczek chirurgicznych, ściąć dystalne końce kości. Usunąć tylko tyle tkanki kostnej, ile jest konieczne do odsłonięcia jamy szpikowej, używając trzech mililitrów sterylnego PBS.Napełnij strzykawkę i przymocuj igłę o rozmiarze 23 G. Ostrożnie wprowadź igłę do jamy szpiku i wypłucz szpik kostny do sterylnej szalki hodowlanej. Użyj czubka igły, aby zeskrobać wnętrze jamy szpiku, aby upewnić się, że po ekstrakcji usunięto wszystkie pożądane komórki.Upewnij się, że czerwony szpik kostny nie jest już widoczny, a kość ma teraz biały kolor. Używając pęsety, przytrzymaj kość piszczelową i za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie zeskrob koniec, w którym kość piszczelowa była przytwierdzona do kolana. Aby odsłonić jamę szpikową, napełnij strzykawkę trzema mililitrami sterylnego PBS i załóż igłę 25 G.Ostrożnie wprowadź igłę do jamistej części kości i wypłucz szpik kostny do naczynia z zebranym szpikiem z kości udowych. Za pomocą końcówki do pipety o objętości 1 ml delikatnie rozetrzyj szpik kostny, aby rozdzielić komórki. Przepuść zawiesinę komórkową przez filtr koszykowy o oczkach 40 µm do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 50 ml.Użyj PBS do wypłukania naczynia, aby zebrać pozostałe komórki, a następnie przenieś bufor przez filtr do probówki do wirowania. Dolej do probówki PBS do uzyskania objętości końcowej od 30 do 40 mililitrów i wiruj przy 450 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń i odrzuć nadfiltr.Osad ресуpendować w trzech mililitrach buforu do lizy erytrocytów i inkubować na lodzie przez 8,5 minuty. Następnie dodać około 30 mililitrów sterylnego PBS w celu neutralizacji buforu do lizy, odwirować i usunąć nadsącz. Użyć jednego mililitra sterylnego PBS do resuspensji osadu i przechowywać go na lodzie.Rozcieńcz niewielką ilość homogenatu komórkowego w PBS i użyj hemocytometru do policzenia komórek. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 8 × 10⁶ komórek na mililitr i inkubuj na lodzie do momentu iniekcji. Aby przeprowadzić transplantację szpiku kostnego, pobierz 300 µL rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do strzykawki o pojemności 0,5 ml.Przed wstrzyknięciem preparatu każdej myszy należy upewnić się, że z igły usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza. Klatkę z przygotowanymi myszami biorcami należy umieścić na podgrzewaczu, aby doprowadzić do rozszerzenia bocznych żył ogonowych. Myszy biorcy należy umieścić w odpowiednio dobranej rozmiarem stabilizatorze, a ogon przetrzeć gazikiem chirurgicznym nasączonym 70% ethanol. Mocno trzymając ogon, należy delikatnie wprowadzić igłę ściętą stroną skierowaną do góry do jednej z bocznych żył ogonowych i wstrzyknąć zawiesinę komórkową.Przytrzymaj gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Przed umieszczeniem myszy w nowej czystej klatce, około dwa do trzech tygodni po transplantacji szpiku kostnego, umieść mysz w rurce ograniczającej i ogol futro na tylnej kończynie, aby odsłonić żyłę sapanous boczną. Następnie nanieś cienką warstwę wazeliny na kończynę i za pomocą igły o rozmiarze 25 G przebij żyłę sapanous rurką kapilarną powlekaną heparyną.Pobierz około 50 µL krwi, następnie użyj gazy chirurgicznej, aby zatamować krwawienie. Po ustąpieniu krwawienia umieść mysz z powrotem w klatce. Przenieś krew do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL buforu fax.Wymieszaj zawartość probówki poprzez odwracanie i przechowuj na lodzie, a następnie odwiruj próbki krwi przy 900 ×g przez pięć minut. Po usunięciu i wylaniu supernatantu, użyj 500 µL buforu do lizy erytrocytów, aby resuspendować osad, i inkubuj na lodzie przez 8,5 minuty. Następnie dodaj jeden mililitr buforu FAX, aby zneutralizować bufor do lizy, i odwiruj przy 900 ×g przez pięć minut.Po ponownej lizie i wirowaniu, zgodnie z protokołem tekstowym, należy sprawdzić, czy osad jest teraz biały. Jeśli jest czerwony, należy powtórzyć etap lizy po raz trzeci. Resuspendować osad w buforze fax i użyć cytometrii przepływowej, aby określić proporcję komórek GFP-dodatnich.Wykres ten przedstawia poziomy chimeryzmu określane co tydzień we krwi obwodowej myszy poddanych kondycjonowaniu dawką 100 mg/kg busalanu, które przeszły pomyślną syngeneiczną transplantację szpiku kostnego, oraz myszy poddanych kondycjonowaniu dawką 80 mg/kg busalanu, u których transplantacja allogenicznego szpiku kostnego zakończyła się niepowodzeniem. Poziomy chimeryzmu powyżej 80% są zazwyczaj ustanawiane od trzech do czterech tygodni po transplantacji szpiku kostnego; przedstawione tutaj reprezentatywne dane z krwi obwodowej ukazują pomyślną i nieudaną transplantację szpiku kostnego trzy tygodnie po zabiegu. Te dane z cytometrii przepływowej pokazują, że wysoki stopień chimeryzmu utrzymuje się przez co najmniej rok w szpiku kostnym oraz że kondycjonowanie samym nośnikiem nie jest wystarczające do wywołania chimeryzmu szpiku kostnego.Mimo że nie występują istotne różnice w poziomach chimeryzmu szpiku kostnego uzyskiwanych przy dawkach busulfanu od 60 do 100 mg/kg, komórki GFP-dodatnie gromadzą się w ośrodkowym układzie nerwowym w sposób zależny od dawki. Rysunek ten przedstawia akumulację pochodnych ze szpiku kostnego komórek GFP-dodatnich w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy typu dzikiego oraz w większym stopniu u myszy będącej modelem choroby neurodegeneracyjnej, stwardnienia zanikowego bocznego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie syngenicznych myszy biorców i dawców tej samej płci, aby zminimalizować możliwość odrzucenia przeszczepu po zakończeniu zabiegu.W celu zbadania mechanizmów, dzięki którym komórki pochodzące z szpiku kostnego przedostają się do ośrodkowego układu nerwowego, można wykorzystać inne metody, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia.

busulfan-as-myelosuppressive-agent-for-generating-stable-high-level

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Busulfan jako środek mielosupresyjny do wytwarzania stabilnego wysokiego poziomu chimeryzmu szpiku kostnego u myszy

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj protokół transplantacji szpiku kostnego z użyciem busulfanu jako alternatywę dla napromieniowania u myszy. Ta metoda umożliwia generowanie stabilnego chimeryzmu i badanie akumulacji komórek szpikowych w ośrodkowym układzie nerwowym.

Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Przeglądaj więcej filmów