Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zastąpienie przedziału szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego myszy dawcy powszechnie wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Bez zastosowania napromieniowania. Jest to osiągane poprzez uprzednie przygotowanie myszy biorcy za pomocą seryjnych wstrzyknięć doszpikowych związku mielosupresyjnego, busalanu.

Następnie komórki szpiku kostnego izoluje się z kości udowych i piszczeli myszy dawcy wykazującej powszechną ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Na koniec komórki szpiku kostnego dawcy przeszczepia się myszy biorcy poddanej kondycjonowaniu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Ostatecznie pobiera się krew z przeszczepionej myszy i analizuje ją za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić stopień chimeryzmu szpiku kostnego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak całkowite napromieniowanie organizmu, jest możliwość ustanowienia wysokiego stopnia chimeryzmu szpiku kostnego bez cytotoksycznych efektów całkowitego napromieniowania oraz bez konieczności korzystania ze specjalistycznych urządzeń i zaplecza. Metoda ta pozwala nie tylko na badanie akumulacji komórek pochodzących ze szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym, ale może być również wykorzystana do badania takich zagadnień jak rozwój linii hematopoetycznej, immunobiologia oraz białaczka. W celu przygotowania myszy biorcy przygotuj rozcieńczony busulfan zgodnie z protokołem tekstowym i podawaj 20 mg/kg masy ciała myszom biorcom codziennie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP).

Po uśmierceniu myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, spryskaj mysz 70% ethanol. Podnieś skórę w okolicy brzucha i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry od jamy brzusznej, w górę nogi w kierunku kostki, trzymając stopę. Mocno odciągnij skórę od kostki w stronę biodra, odsłaniając tkanki nogi.

Odetnij mięśnie i tkankę tłuszczową z kości udowej, aby odsłonić staw biodrowy, delikatnie pociągając za stopę. Aby wyprostować nogę, dociśnij nożyczki do kości miednicy i przetnij tkanki tuż powyżej głowy kości udowej, uważając, aby nie uszkodzić samej kości. Aby zachować sterylność, trzymaj nogę za stopę i usuń pozostałe tkanki z kości udowej za pomocą nożyczek oraz pęsety do oczyszczenia powierzchni kości.

Oddziel kość udową od piszczeli, przecinając staw kolanowy, a następnie umieść kość udową w naczyniu hodowlanym zawierającym PBS i inkubuj na lodzie. Następnie usuń i odrzuć kość strzałkową, przecinając ją w miejscach, w których łączy się ona z piszczelą. Po tym oczyść piszczel.

Odciąć stopę, przecinając kość piszczelową w miejscu zakończenia szpiku czerwonego, a następnie umieścić kość piszczelową w naczyniu hodowlanym wraz z kością udową i inkubować w lodzie. Za pomocą pęsety przytrzymać kość udową i ostrożnie, używając nożyczek chirurgicznych, ściąć dystalne końce kości. Usunąć tylko tyle tkanki kostnej, ile jest konieczne do odsłonięcia jamy szpikowej, używając trzech mililitrów sterylnego PBS.

Napełnij strzykawkę i przymocuj igłę o rozmiarze 23 G. Ostrożnie wprowadź igłę do jamy szpiku i wypłucz szpik kostny do sterylnej szalki hodowlanej. Użyj czubka igły, aby zeskrobać wnętrze jamy szpiku, aby upewnić się, że po ekstrakcji usunięto wszystkie pożądane komórki.

Upewnij się, że czerwony szpik kostny nie jest już widoczny, a kość ma teraz biały kolor. Używając pęsety, przytrzymaj kość piszczelową i za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie zeskrob koniec, w którym kość piszczelowa była przytwierdzona do kolana. Aby odsłonić jamę szpikową, napełnij strzykawkę trzema mililitrami sterylnego PBS i załóż igłę 25 G.

Ostrożnie wprowadź igłę do jamistej części kości i wypłucz szpik kostny do naczynia z zebranym szpikiem z kości udowych. Za pomocą końcówki do pipety o objętości 1 ml delikatnie rozetrzyj szpik kostny, aby rozdzielić komórki. Przepuść zawiesinę komórkową przez filtr koszykowy o oczkach 40 µm do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 50 ml.

Użyj PBS do wypłukania naczynia, aby zebrać pozostałe komórki, a następnie przenieś bufor przez filtr do probówki do wirowania. Dolej do probówki PBS do uzyskania objętości końcowej od 30 do 40 mililitrów i wiruj przy 450 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń i odrzuć nadfiltr.

Osad ресуpendować w trzech mililitrach buforu do lizy erytrocytów i inkubować na lodzie przez 8,5 minuty. Następnie dodać około 30 mililitrów sterylnego PBS w celu neutralizacji buforu do lizy, odwirować i usunąć nadsącz. Użyć jednego mililitra sterylnego PBS do resuspensji osadu i przechowywać go na lodzie.

Rozcieńcz niewielką ilość homogenatu komórkowego w PBS i użyj hemocytometru do policzenia komórek. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 8 × 10⁶ komórek na mililitr i inkubuj na lodzie do momentu iniekcji. Aby przeprowadzić transplantację szpiku kostnego, pobierz 300 µL rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do strzykawki o pojemności 0,5 ml.

Przed wstrzyknięciem preparatu każdej myszy należy upewnić się, że z igły usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza. Klatkę z przygotowanymi myszami biorcami należy umieścić na podgrzewaczu, aby doprowadzić do rozszerzenia bocznych żył ogonowych. Myszy biorcy należy umieścić w odpowiednio dobranej rozmiarem stabilizatorze, a ogon przetrzeć gazikiem chirurgicznym nasączonym 70% ethanol. Mocno trzymając ogon, należy delikatnie wprowadzić igłę ściętą stroną skierowaną do góry do jednej z bocznych żył ogonowych i wstrzyknąć zawiesinę komórkową.

Przytrzymaj gazę chirurgiczną w miejscu wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Przed umieszczeniem myszy w nowej czystej klatce, około dwa do trzech tygodni po transplantacji szpiku kostnego, umieść mysz w rurce ograniczającej i ogol futro na tylnej kończynie, aby odsłonić żyłę sapanous boczną. Następnie nanieś cienką warstwę wazeliny na kończynę i za pomocą igły o rozmiarze 25 G przebij żyłę sapanous rurką kapilarną powlekaną heparyną.

Pobierz około 50 µL krwi, następnie użyj gazy chirurgicznej, aby zatamować krwawienie. Po ustąpieniu krwawienia umieść mysz z powrotem w klatce. Przenieś krew do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL buforu fax.

Wymieszaj zawartość probówki poprzez odwracanie i przechowuj na lodzie, a następnie odwiruj próbki krwi przy 900 ×g przez pięć minut. Po usunięciu i wylaniu supernatantu, użyj 500 µL buforu do lizy erytrocytów, aby resuspendować osad, i inkubuj na lodzie przez 8,5 minuty. Następnie dodaj jeden mililitr buforu FAX, aby zneutralizować bufor do lizy, i odwiruj przy 900 ×g przez pięć minut.

Po ponownej lizie i wirowaniu, zgodnie z protokołem tekstowym, należy sprawdzić, czy osad jest teraz biały. Jeśli jest czerwony, należy powtórzyć etap lizy po raz trzeci. Resuspendować osad w buforze fax i użyć cytometrii przepływowej, aby określić proporcję komórek GFP-dodatnich.

Wykres ten przedstawia poziomy chimeryzmu określane co tydzień we krwi obwodowej myszy poddanych kondycjonowaniu dawką 100 mg/kg busalanu, które przeszły pomyślną syngeneiczną transplantację szpiku kostnego, oraz myszy poddanych kondycjonowaniu dawką 80 mg/kg busalanu, u których transplantacja allogenicznego szpiku kostnego zakończyła się niepowodzeniem. Poziomy chimeryzmu powyżej 80% są zazwyczaj ustanawiane od trzech do czterech tygodni po transplantacji szpiku kostnego; przedstawione tutaj reprezentatywne dane z krwi obwodowej ukazują pomyślną i nieudaną transplantację szpiku kostnego trzy tygodnie po zabiegu. Te dane z cytometrii przepływowej pokazują, że wysoki stopień chimeryzmu utrzymuje się przez co najmniej rok w szpiku kostnym oraz że kondycjonowanie samym nośnikiem nie jest wystarczające do wywołania chimeryzmu szpiku kostnego.

Mimo że nie występują istotne różnice w poziomach chimeryzmu szpiku kostnego uzyskiwanych przy dawkach busulfanu od 60 do 100 mg/kg, komórki GFP-dodatnie gromadzą się w ośrodkowym układzie nerwowym w sposób zależny od dawki. Rysunek ten przedstawia akumulację pochodnych ze szpiku kostnego komórek GFP-dodatnich w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy typu dzikiego oraz w większym stopniu u myszy będącej modelem choroby neurodegeneracyjnej, stwardnienia zanikowego bocznego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie syngenicznych myszy biorców i dawców tej samej płci, aby zminimalizować możliwość odrzucenia przeszczepu po zakończeniu zabiegu.

W celu zbadania mechanizmów, dzięki którym komórki pochodzące z szpiku kostnego przedostają się do ośrodkowego układu nerwowego, można wykorzystać inne metody, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia.