Mysi model nieodwracalnej i odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Niniejszy film przedstawia mysi model neuropatii obturacyjnej indukowanej jednostronnym zamknięciem moczowodu, która może być nieodwracalna lub odwracalna. Przedstawiono dane histologiczne ukazujące powstałe uszkodzenie strukturalne oraz jego regenerację po przywróceniu drożności. Ten schemat obrazowy ilustruje główne etapy tego modelu. Tutaj widzimy lewą nerkę, moczowód i pęcherz moczowy.

Standardową jednostronną niedrożność moczowodu indukuje się poprzez podwiązanie moczowodu. Z czasem moczowód ulega rozszerzeniu, a nerka rozwija wodniczkę.

Aby ograniczyć nadmierne rozszerzenie moczowodu, nerka z czasem staje się wodobrzuszna, a następnie zostaje odblokowana w punkcie czasowym odpowiednim dla badania. W siódmym dniu eksperymentu usuwa się rurkę o miękkich ściankach, a moczowód zostaje przecięty tuż nad poziomem podwiązania. Odblokowany moczowód zostaje poddany anastomozie z pęcherzem moczowym w celu umożliwienia odpływu moczu, a nerka zazwyczaj ulega dekompresji w ciągu kilku dni.

Model jednostronnego zatoru moczowodu, określany jako UUO, może być wykorzystywany do badania rozwoju uszkodzeń tkanek i włóknienia po nefropatii zatorowej. Odwracalny model zatoru moczowodu, skrócona nazwa RUUO, może służyć do pogłębienia wiedzy na temat przebudowy tkanek, która może nastąpić po urazie. Poniżej przedstawiono schemat typowego eksperymentu obejmującego zarówno procedury UUL, jak i nasze procedury UUL.

Myszy poddawane są UUL w dniu zerowym, a siedem dni później myszy są albo uśmiercane w celu oceny stopnia uszkodzenia, albo dokonuje się odblokowania moczowodów, aby przeprowadzić RUUR. Następnie nerki poddawane są dekompresji przez siedem dni przed pobraniem tkanek.

Tkankę można ocenić pod kątem uszkodzeń strukturalnych, nacieku makrofagów, akumulacji miofibroblastów oraz włóknienia. Poniżej przedstawiono typowe przygotowanie chirurgiczne. Procedura jest wykonywana przy użyciu sterylnych narzędzi i materiałów jednorazowych z autoklawu, rozmieszczonych w sterylnym polu operacyjnym.

W przypadku operowania wielu zwierząt narzędzia powinny być sterylizowane między zabiegami za pomocą sterylizatora koralikowego lub dla każdego zabiegu należy użyć nowego zestawu narzędzi. Operatorzy noszą sterylną kitle, maskę, czepek i rękawiczki. Ta ośmiotygodniowa samiec myszy C 57 black 6 została znieczulona poprzez doszpryznaczne wstrzyknięcie ketaminy, chlorowodorku i ksylazyny.

Głębokość znieczulenia potwierdzono brakiem reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Pole operacyjne ogolono i zdezynfekowano za pomocą rozcieńczonego roztworu chlorheksydyny. Zastosowano smarowanie oczu w celu zapobiegania wysychaniu rogówki.

Przeciwbólowy chlorowodorek buprenorfiny został podany za pomocą zastrzyku podskórnego. Pyszczek został umieszczony na sterylnym, przykrytym podgrzewanym podłożu chirurgicznym, a kończyny unieruchomiono za pomocą nożyczek do rozdzielania tkanek; wykonano laparotomię w linii środkowej oraz nacięcie wzdłuż beznaczyniowego liniowego łokcia. W następnym rozdziale szczegółowo opisano sposób wykonania nieodwracalnego UUOA, po czym do nacięcia wprowadzono retraktor calibra, a mysz przykryto sterylnymi draperiami.

Jelitka zostają odsunięte i przykryte zwilżoną jałową gazą, aby odsłonić lewy moczowód. Moczowód zostaje odsłonięty i wyizolowany za pomocą pęsety kątowej w celu wywołania niedrożności. Moczowód zostaje podwiązany dwukrotnie przy użyciu czarnej plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 6-0.

Moczowód może zostać zablokowany w dowolnym miejscu między pęcherzem a miedniczką nerkową. Następnie moczowód zostaje podzielony pomiędzy szwy. W kolejnym rozdziale szczegółowo opisano sposób wykonania odwracalnej niedrożności moczowodu.

Jest to pierwszy etap procedury RUUL. Moczowód zostaje odsłonięty i wyizolowany za pomocą pęsety kątowej w celu wywołania niedrożności. Moczowód zostaje podwiązany dwukrotnie przy użyciu czarnej plecionej nici jedwabnej 6.0.

Moczowód należy zamknąć blisko pęcherza, aby zachować odpowiednią długość moczowodu do wykonania anastomozy z pęcherzem. Podczas procedury cofania, szwy zostają przycięte, lecz jeden pozostaje długi do późniejszego użycia, a następnie odcina się kawałek miękkiej plastikowej rurki o długości około pięciu milimetrów. Następnie wykonuje się podłużne nacięcie, tak aby można było ją rozchylić i nałożyć wokół moczowodu.

Plastikowa rurka o miękkiej ściance powinna mieć średnicę wewnętrzną 1 mm i średnicę zewnętrzną 2 mm. Rurkę o miękkiej ściance umieszcza się ostrożnie wokół mocznika, upewniając się, że po zamknięciu długa nitka szewna wystaje ze środka nacięcia. Następnie wokół rurki przekłada się i zawiązuje odcinek czarnej plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 6-0.

Następnie długą nitkę chirurgiczną wychodzącą ze środka cewki włącza się do kolejnego wiązania. Wykonuje się to w celu pewnego zamocowania mocznika i cewki na miejscu. Cewka wokół mocznika zapobiegnie nadmiernemu rozszerzeniu mocznika pod koniec obu procedur UUO i RUUO.

Jelitach zostają przywrócone na miejsce, a następnie zszywa się otrzewną i zamyka skórę za pomocą metalowych klipsów. W miejscu operowanego obszaru stosuje się również jod. Znieczulenie jest częściowo odwracane poprzez podskórną injekcję aamaz.

Wodorochlorek i płyny podaje się podskórnie w objętości 1 ml ogrzanej soli fizjologicznej. Myszy monitoruje się do momentu odzyskania przytomności, a następnie pozostawia im się możliwość ogrzania w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 29°C przez 24 godziny. W dniach następujących po niedrożności moczowodów w nerkach rozwija się wodomiączka.

Myszy można uśmiercić w różnych punktach czasowych podczas fazy urazu lub po zniesieniu niedrożności. W następnym rozdziale szczegółowo opisano, jak przeprowadzić zniesienie niedrożności, co stanowi drugi etap procedury RUUO. Mysz zostaje poddana znieczuleniu i przygotowana zgodnie z wcześniejszym opisem.

Metalowe klamry do skóry zostają usunięte i wykonuje się laparotomię. Szwy otrzewne są usuwane, a otrzewną można delikatnie otworzyć za pomocą pęsety ząbkowanej do szczurów. Następnie przygotowuje się mysz i odsłania lewy moczowód, zgodnie z wcześniejszym opisem, używając pęsety kątowej.

Moczowód oraz miękka plastikowa rurka są izolowane od otaczających tkanek. Szwy utrzymujące miękką rurkę na miejscu zostają przecięte skalpelem, a następnie usunięte. Następnie ostrożnie usuwa się miękką plastikową rurkę, co ujawnia rozszerzony moczowód.

Moczowód w miejscu niedrożności jest kruchy i może ulec przerwaniu powyżej przeszkody, co miało miejsce w tym klipie. Jednak szwy umieszczone wcześniej blisko pęcherza podczas pierwszego etapu UUO pozostaną nienaruszone, co zapewni, że mocz nie będzie wyciekać z pęcherza do jamy otrzewnowej. Pod moczowód kładzie się kawałek sterylnej gazy, aby zebrać osad moczowy, który wypłynie z wcześniej niedrożnego moczowodu.

Pozostała długość odblokowanego mocznika musi zostać odpompowana aż do uzyskania przejrzystego moczu, aby upewnić się, że światło mocznika zostało oczyszczone z wszelkich zanieczyszczeń. Po opróżnieniu mocznika i miedniczki nerkowej, na końcowym odcinku mocznika aplikuje się długą, czarną, plecioną nicią jedwabną o rozmiarze 6-0. Służy ona jako pomoc przy późniejszym zespoleniu mocznika z pęcherzem.

Następnie moczowód jest odwijany tak, aby znajdował się przed swoją pierwotną pozycją i spoczywał na nerce. Na końcu moczowodu umieszcza się pojedynczy szew z nano poliamidowej nici monofilamentowej. Należy zadbać o to, aby szew pozostał w warstwie mięśniowej i nie wniknął do światła moczowodu.

Szew służy do zakotwiczenia moczowodu w pęcherzu; następnie, aby przygotować pęcherz do anastomozy, tworzy się kanał przez pęcherz, wprowadzając igłę 21 G ukośnie przez pęcherz. Igła 21 G jest następnie wykorzystywana do przeprowadzenia igły z oczkiem przez pęcherz. Wcześniej umieszczony w moczowodzie szew Nino jest następnie przeciągnięty przez pierwsze nacięcie w pęcherzu i wyprowadzony przez ścianę pęcherza w sąsiedztwie punktu wejścia, aby przeprowadzić moczowód przez pęcherz.

Długą szuturę 6-0 umieszczoną na końcu mocznicy przeciąga się przez ucho igły. Następnie igłę powoli wycofuje się przez pęcherz, upewniając się, że mocznica również zostaje wciągnięta do wnętrza pęcherza. Po umieszczeniu mocznicy w pęcherzu, szutury nano umieszczone w mocznicy i ścianie pęcherza zostają zawiązane, aby trwale i pewnie zakotwiczyć mocznicę w odpowiednim miejscu.

Nakłada się drugi szew otax. Ponownie przeprowadza się go przez moczowód, upewniając się, że pozostaje on w obrębie warstwy mięśniowej, następnie przez nacięcie pęcherza i na zewnątrz przez ścianę pęcherza. Następnie wiąże się go w podobny sposób.

Trzeci szew nano tax jest umieszczany w tylnej części pęcherza. Następnie, za pomocą grzbietów otwartych nożyczek, ścianę pęcherza lekko odsuwa się do tyłu, aby odsłonić odcinek moczowodu. Następnie moczowód zostaje przekrojony powyżej szwu płucnego.

Pomalowany moczowód zostanie następnie cofnięty pod kątem do pęcherza. Wykorzystuje się cztery pęsety, aby upewnić się, że moczowód został w pełni cofnięty do pęcherza. Na koniec ranę wyjściową w pęcherzu zamyka się szwem jednowłóknistym poliamidowym o rozmiarze 9-0; przed zamknięciem należy upewnić się, że moczowód jest stabilnie zakotwiczony w pęcherzu.

Zaszyć otrzewną i skórę zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie zapewnić opiekę pooperacyjną zgodnie z wcześniejszym opisem. W niniejszym badaniu wszystkim myszom z UUO pozwolono na siedmiodniową rekonwalescencję w celu odbarczenia odblokowanej nerki, choć można badać wcześniejsze lub późniejsze punkty czasowe. Poniżej przedstawiono dane ilustrujące wygląd nerek zablokowanych i odblokowanych oraz wynikające z tego uszkodzenia.

Rysunek ten przedstawia wygląd natywnych nerek, miedniczek nerkowych i moczowodów w modelu U-U-L-U-U-O w porównaniu z nerką natywną. Nerka z UUO poddana obstrukcji przez siedem dni wykazuje cechy wodniaka oraz ma blady kolor. Po siedmiu dniach od odbarczenia, nerka z RUO uległa dekompresji, a miedniczka nerkowa i moczowód powróciły do rozmiarów i koloru zbliżonych do nerki natywnej.

Należy zauważyć, że moczowód w modelu IUO jest krótszy od moczowodów w modelu UUO i nerek natywnych ze względu na technikę destrukturyzacji oraz anastomozę z pęcherzem moczowym. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne obrazy przekrojów nerek barwionych H i E z nerek natywnych, UUO oraz RUUO. Zdrowe śródmiąższ nerek prawidłowych składa się z przekrojów poprzecznych zwartych, zdrowych kanalików.

Liczba kanalików wskazanych czarnymi strzałkami wykazuje znaczne rozszerzenie w siódmej dobie. Po QUL w probówce kontrolnej rozszerzenie jest wyraźnie mniejsze w siódmej dobie po odwróceniu UUL. Przedstawiony tutaj model mysi nefropatii obturacyjnej jest indukowany jednostronną obstrukcją moczowodu, która może być nieodwracalna lub odwracalna.

Opisany tutaj model odwracalny umożliwia usunięcie niedrożności moczowodu oraz wykonanie anastomozy moczowodu z pęcherzem w celu pełnego przywrócenia przepływu moczu. Wynikająca z tego dekompresja nerki pozwala na badanie przebudowy tkanek w eksperymentach po urazie. Połączenie modeli nieodwracalnej i odwracalnej nefropatii obturacyjnej dostarcza badaczom cennych informacji na temat procesów chorobowych oraz wpływu interwencji terapeutycznych na rozwój uszkodzeń i następującą po nich przebudowę tkanek.