Name: Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych za pomocą hydrożelowej łaty i kleju fibrynowego w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. Technika poprawia przetrwanie komórek i regenerację serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) oraz stypendium ze Szpitala Fundacji Carle.

Procedura jest w pełni zgodna z protokołem IACUC numer 13302 i została zatwierdzona przez Wydział Zasobów Zwierzęcych.
1. Przygotowanie instrumentu
<ol>
	<li>Autoklawuj wszystkie jednorazowe narzędzia używane przed zabiegiem chirurgicznym, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Sterylizuj narzędzia używane wiele razy podczas sesji za pomocą sterylizatora ze szklanymi kulkami między użyciami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hydrożelu
<ol>
	<li>Rozmrozić i ułożyć płytki komórek macierzystych co najmniej 24 godziny przed stworzeniem konstruktu hydrożelowego.</li>
	<li>Plastry należy przygotować na dzień przed zabiegiem chirurgicznym za pomocą aparatu stereolitograficznego (lub podobnego instrumentu), który został szczegółowo opisany w poprzednich publikacjach8,18.</li>
	<li>Aby stworzyć hydrożel, najpierw wygeneruj model projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) żądanej łaty i wyeksportuj projekt do formatu stereolitograficznego (STL).</li>
	<li>Stwórz roztwór żelu, rozpuszczając dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDMA) w sterylnym 1x PBS, aby uzyskać 20% roztwór w/v. Jednocześnie rozpuścić fotoinicjator 1-[4-(2-hydroksy-etoksy)-fenylo]-2-hydroksy-2-metylo-1-propano-1-on w DMSO. Dodać fotoinicjator do roztworu PEGDMA przy końcowej w/v 0,5%. Bezpośrednio przed sieciowaniem dodać 100 ml pożądanej gęstości komórek. Uwaga: Zalecana jest gęstość komórek między 2,0 x 10 5-2,0 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Odpipetuj roztwór żelu wstępnego do naczynia znajdującego się na środku platformy SLA i uruchom oprogramowanie SLA z wcześniej przesłanym projektem w formacie STL.</li>
	<li>Usunąć plastry z aparatu i inkubować hydrożele O/N w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do środowiska w plastrach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt i intubacja doustna
<ol>
	<li>Oceń każdą mysz przed zabiegiem, aby upewnić się, że zwierzę jest w dobrym zdrowiu, zgodnie z ich nawykami pielęgnacyjnymi i interakcjami z kolegami w klatce. Uwaga: Do tej procedury użyto samic myszy C57BL / 6J w wieku 8-10 tygodni, jednak można użyć dowolnego wieku i typu myszy.</li>
	<li>Umieść zwierzęta w komorze anestezjologicznej i poddaj działaniu 5% izofluoranu z podparciem 1 l/minO2. Monitoruj poziom znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Gdy zwierzę zostanie odpowiednio znieczulone, zważ je i umieść na stanowisku do intubacji.</li>
	<li>Skieruj źródło światła w stronę klatki piersiowej zwierzęcia i użyj kleszczy, aby cofnąć powierzchnię krtani i odsłonić struny głosowe. Ostrożnie poprowadź angiocath 20 G między strunami głosowymi i płynnie włóż do tchawicy. Wykryj prawidłowe wprowadzenie poprzez mechaniczny ruch jamy klatki piersiowej po podłączeniu cewnika do respiratora dla małych zwierząt.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia wentylacji do wagi zwierzęcia w oparciu o wytyczne producenta.</li>
	<li>Po zaintubowaniu umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Upewnij się, że temperatura poduszki grzewczej nie przekracza 40 °C. W razie potrzeby umieść barierę między zwierzęciem a poduszką grzewczą, aby zminimalizować ryzyko poparzenia.</li>
	<li>Usuń włosy z miejsca operowanego za pomocą kremu do depilacji. Wysterylizuj miejsce za pomocą 3 naprzemiennych peelingów z betadyny i 75% etanolu, aby zapewnić prawidłową sterylizację. Umieść zasłonę, aby odsłonić tylko pole operowane, i umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Torakotomię wykonuje się po lewej stronie zwierzęcia, dlatego należy wykonać nacięcie skóry około 1 cm na lewo od mostka, które biegnie wzdłuż mostka.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby oddzielić warstwę mięśniową od leżącej pod nią klatki piersiowej w dwóch krokach. Zwróć uwagę na linię wyznaczającą, która reprezentuje mięśnie piersiowe większe zwierzęcia. Lekko unieś ten mięsień, oddziel go od leżącego pod nim zewnętrznego mięśnia skośnego i cofnij przyśrodkowo. Następnie w ten sam sposób uwolnij zewnętrzny mięsień skośny od leżącego poniżej żebra i cofnij się na boki, zapewniając niezakłócony widok drugiego, trzeciego i czwartego żebra.</li>
	<li>Wykonaj torakotomię między trzecim a czwartym żebrem. Delikatnie podnieś czwarte żebro i użyj kauteryzatora, aby otworzyć jamę klatki piersiowej między trzecim a czwartym żebrem. Umieść retraktory, aby jeszcze bardziej otworzyć jamę i odsłonić serce.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby rozerwać cienkie osierdzie serca.</li>
	<li>Podwiązaj lewą tętnicę wieńcową za pomocą 8-0 Szew nylonowy z monofilamentu. Szew należy umieścić około 4 mm od wierzchołka serca, bezpośrednio pod dolnym końcem lewego przedsionka. Określ prawidłowe założenie szwów poprzez blanszowanie mięśnia sercowego komory i zwiększenie rozmiaru lewego przedsionka po zawiązaniu szwu.</li>
</ol>
5. Umieszczanie naszywek i klejenie
<ol>
	<li>Plastry należy przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu użycia.</li>
	<li>Delikatnie unieś plaster za pomocą szpatułki z płaskim końcem i delikatnie umieść go na powierzchni serca, w miejscu zawału. 
	Uwaga: Aby zapobiec zsuwaniu się z lewej komory, plaster można przytrzymać na miejscu, lekko utrzymując kontakt za pomocą szpatułki lub końcówki kleszczy.</li>
	<li>Przygotuj klej, mieszając fibrynogen i trombinę w stosunku 4:1. Roztwór mieszać wielokrotnym pipetowaniem, aż zacznie gęstnieć, zwykle w ciągu 1 minuty od rozpoczęcia przygotowania.</li>
	<li>Gdy lepkość roztworu osiągnie pożądany poziom, szybko przenieś około 10 ml na powierzchnię plastra. Uwaga: Czas krzepnięcia kleju fibrynowego jest szybki, co zapewnia niewielkie okno możliwości skutecznego przenoszenia kleju.</li>
</ol>
6. Szycie
<ol>
	<li>Wszystkie szwy zamykające należy wykonać za pomocą nici nylonowej 6-0 monofilamentowej.</li>
	<li>Zamknij warstwę żeber trzema do czterech pojedynczych przerwanych szwów.</li>
	<li>Przed całkowitym zamknięciem warstwy międzyżebrowej należy wprowadzić kaniulę PE-10 do nacięcia, aby ewakuować jamę klatki piersiowej po całkowitym zamknięciu i przywrócić prawidłowe ciśnienie wewnątrzopłucnowe.</li>
	<li>Zamknij mięśnie piersiowe za pomocą trzech do czterech pojedynczych przerwanych szwów.</li>
	<li>Uszczelnij warstwę skóry za pomocą ciągłego szwu.</li>
	<li>Po całkowitym zamknięciu przymocuj strzykawkę o pojemności 1,0 ml do końca kaniuli i użyj jej do opróżnienia jamy klatki piersiowej.</li>
	<li>Nałóż klej tkankowy na miejsce nacięcia, aby wzmocnić miejsce szwu.</li>
</ol>
7. Leczenie pooperacyjne
<ol>
	<li>Podać myszom zastrzyk buprenorfiny (0,05-1,0 mg/kg) i karprofenu (2,2 mg/kg) podskórnie bezpośrednio po podwiązaniu naczyń wieńcowych i co najmniej 20 minut przed przebudzeniem. Podawaj oba leki 6-8 godzin po zabiegu, a następnie podawaj dwa razy dziennie przez okres do trzech dni, aby kontrolować ból i niepokój.</li>
	<li>Stale monitoruj zwierzęta do momentu uzyskania przytomności i co godzinę przez pierwsze 4 godziny po operacji. Wykonaj drugą kontrolę w noc operacji (2-4 godziny później), aby podać drugą dawkę leku przeciwbólowego.</li>
	<li>Monitorować zwierzęta codziennie po drugim dniu po zabiegu, aż do momentu, gdy stan zwierząt okaże się stabilny.</li>
</ol>
8. Analiza funkcji serca i histologii
<ol>
	<li>Wykonaj echokardiografy na myszach 4 tygodnie po zabiegu, aby określić zakres uszkodzeń po zawale mięśnia sercowego.</li>
	<li>Znieczulić myszy 4-5% izofluranem w komorze anestezjologicznej w celu indukcji znieczulenia wziewnego, a następnie 2% izofluranem za pomocą maski na twarz w celu znieczulenia podtrzymującego.</li>
	<li>Oczyść obszar obrazowania kremem do depilacji i użyj USG małego zwierzęcia, aby uzyskać skan echokardiograficzny 2D w trybie M bijącego serca i zarejestrować związane z nim parametry funkcjonalne</li>.
	<li>Myszy należy poddać eutanazji w komorze z dwutlenkiem węgla, a następnie zebrać serca zwierząt i umieścić w 10% roztworze formaliny na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieść serca do 70% etanolu i utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia tkanek.</li>
	<li>Przetwórz serca i zanurz je w blokach parafinowych.</li>
	<li>Wytnij odcinki 5 mm przez obszar komorowy serca, zaczynając od wierzchołka, a kończąc na przedsionku.</li>
	<li>Plastry podzielone na sekcje zarówno trichromem Massona, jak i barwieniem hematoksyliną i eozyną przy użyciu standardowych protokołów.</li>
</ol>

<ol><li>Kolk, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAD-ligation%3A+a+murine+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2009).</li>
<li>Li, Y., Yao, Y., Sheng, Z., Yang, Y., Ma, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-modal+tracking+of+transplanted+mesenchymal+stem+cells+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Dual-modal tracking of transplanted mesenchymal stem cells after myocardial infarction.</a> International journal of nanomedicine. 6, 815-823 (2011).</li>
<li>Nagaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+mesenchymal+stem+cells+improves+cardiac+function+in+rats+with+acute+myocardial+infarction+through+angiogenesis+and+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 287, H2670-H2676 (2004).</li>
<li>Wang, J. S., Shum-Tim, D., Chedrawy, E., Chiu, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+delivery+of+marrow+stromal+cells+for+myocardial+regeneration%3A+pathophysiologic+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+thoracic+and+cardiovascular+surgery%22%5BJournal%5D)">The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 122, 699-705 (2001).</li>
<li>Cashman, T. J., Gouon-Evans, V., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+cardiac+therapy%3A+practical+challenges+and+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reviews%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for cardiac therapy: practical challenges and potential mechanisms.</a> Stem cell reviews. 9, 254-265 (2013).</li>
<li>Sutton, M. G., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+after+myocardial+infarction%3A+pathophysiology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy.</a> Circulation. 101, 2981-2988 (2000).</li>
<li>Smolina, K., Wright, F. L., Rayner, M., Goldacre, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+recurrence+after+acute+myocardial+infarction+in+England%2C+2004+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+quality+and+outcomes%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and recurrence after acute myocardial infarction in England, 2004 to 2010.</a> Circulation. Cardiovascular quality and outcomes. 5, 532-540 (2012).</li>
<li>Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+photopatterning+of+hydrogels+using+stereolithography+for+long-term+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation.</a> Lab on a chip. 10, 2062-2070 (2010).</li>
<li>Kai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-loaded+nanofibrous+patch+promotes+the+regeneration+of+infarcted+myocardium+with+functional+improvement+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model.</a> Acta biomaterialia. 10, 2727-2738 (2014).</li>
<li>Serpooshan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bioengineered+acellular+collagen+patch+on+cardiac+remodeling+and+ventricular+function+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).</li>
<li>Cavallo, L. M., Solari, D., Somma, T., Savic, D., Cappabianca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Awake+Endoscope-Guided+Sealant+Technique+with+Fibrin+Glue+in+the+Treatment+of+Postoperative+Cerebrospinal+Fluid+Leak+After+Extended+Transsphenoidal+Surgery%3A+Technical+Note%5BTitle%5D)+AND+%22World+neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The Awake Endoscope-Guided Sealant Technique with Fibrin Glue in the Treatment of Postoperative Cerebrospinal Fluid Leak After Extended Transsphenoidal Surgery: Technical Note.</a> World neurosurgery. , (2013).</li>
<li>Chung, H. W., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+for+Gundersen+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue for Gundersen flap surgery.</a> Clinical Ophthalmology. 7, 479-484 (2013).</li>
<li>Dunn, C. J., Goa, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+sealant%3A+a+review+of+its+use+in+surgery+and+endoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Fibrin sealant: a review of its use in surgery and endoscopy.</a> Drugs. 58, 863-886 (1999).</li>
<li>Chi, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+achieved+by+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%2Fsilk+fibroin%2Fhyaluronic+acid+patches+in+a+rat+of+myocardial+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 33, 5541-5551 (2012).</li>
<li>Erb, M. A., Claus, T., Hartrumpf, M., Bachmann, S., Albes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Tachosil+surgical+patch+or+fibrin+glue+in+coronary+artery+surgery+does+not+affect+quality+of+anastomosis+or+provoke+postoperative+adhesions+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">The use of Tachosil surgical patch or fibrin glue in coronary artery surgery does not affect quality of anastomosis or provoke postoperative adhesions in pigs.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 36, 703-707 (2009).</li>
<li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+rupture+of+left+ventricular+free+wall+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+cardiovascular+and+thoracic+surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for rupture of left ventricular free wall after acute myocardial infarction.</a> Interactive cardiovascular and thoracic surgery. 4, 203-206 (2005).</li>
<li>Simpson, D., Liu, H., Fan, T. H., Nerem, R., Dudley, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+engineering+approach+to+progenitor+cell+delivery+results+in+significant+cell+engraftment+and+improved+myocardial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A tissue engineering approach to progenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improved myocardial remodeling.</a> Stem Cells. 25, 2350-2357 (2007).</li>
<li>Jeong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living%27+microvascular+stamp+for+patterning+of+functional+neovessels%3B+orchestrated+control+of+matrix+property+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Living' microvascular stamp for patterning of functional neovessels; orchestrated control of matrix property and geometry.</a> Advanced Materials. 24, 58-63 (2012).</li>
<li>Wu, X., Ren, J., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+as+the+cell-delivery+vehicle+for+mesenchymal+stromal+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue as the cell-delivery vehicle for mesenchymal stromal cells in regenerative medicine.</a> Cytotherapy. 14, 555-562 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dzięki takiemu podejściu do mysiego modelu zawału mięśnia sercowego opracowaliśmy system, który minimalizuje uszkodzenia obszarów innych niż mięśni sercowe, które są związane z innymi technikami zawału mięśnia sercowego. Obszary te obejmują uszkodzenia spowodowane tracheostomią, przecięciem warstwy mięśniowej i złamaniem żeber w celu odsłonięcia jamy klatki piersiowej. Uważamy, że zmiany te poprawiają ogólny wynik operacji dzięki dbałości o zachowanie jak najwięks...

Zawał mięśnia sercowego (MI) definiuje się jako przerwanie dopływu krwi do obszaru serca spowodowane niedrożnością głównej tętnicy wieńcowej. Uszkodzenia wynikające z zawału mięśnia sercowego są spowodowane przebudową żywotnej tkanki serca w niefunkcjonalną tkankę bliznowatą, co zmniejsza zdolność serca, a dokładniej lewej komory, do prawidłowego bicia. Powoduje to zmniejszenie objętości krwi, która może być dostarczana do organizmu przy każdym uderzeniu serca, znanej jako objętość wyrzutowa, oraz procentu krwi, która jest wypompowywana z serca przy każdym uderzeniu serca, znanego jako frakcja wyrzutowa6. Te, wraz z innymi osłabionymi funkcjami, zwiększają obciążenie reszty serca, aby utrzymać odpowiednie funkcjonowanie. Często ten zwiększony szczep może stać się tak poważny, że powoduje drugi zawał serca, zjawisko obserwowane u około 10% osób7.
Chociaż praktyki medyczne ewoluowały w celu leczenia bezpośrednich następstw zawału mięśnia sercowego, nie opracowano żadnej techniki, która pozwoliłaby zatrzymać, spowolnić lub odwrócić negatywne skutki uboczne przebudowy tkanek. Terapie komórkami macierzystymi pojawiły się jako możliwa droga takiego leczenia, jednak pomimo ich obiecującego potencjału, komórki macierzyste nie okazały się skuteczne w warunkach klinicznych. Jedną z teorii wyjaśniających ich wady jest niezdolność do zapewnienia, że korzystne komórki pozostają w miejscu zawału wystarczająco długo, aby uzyskaćkorzystne wyniki. Wykazano, że nie więcej niż 24% komórek, które są po prostu wstrzykiwane w miejsce zawału, przeżyło i pozostało w uszkodzonym miejscu 1 dzień po porodzie2. Możliwą perspektywą rozwiązania tego problemu retencji komórek jest opracowanie biokompatybilnych systemów hydrożelowych, które otaczają albo komórki, albo środki terapeutyczne, które mogą być dostarczane do uszkodzonego miejsca. Hydrożelem z wyboru w tym protokole jest dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) ze względu na jego wcześniejsze zastosowanie w procedurach enkapsulacji komórek, jednak można użyć dowolnego hydrożelu zdolnego do enkapsulacji8. Dostarczenie plastra bezpośrednio do miejsca urazu zapewnia kontakt komórka-tkanka przez dłuższy czas, wydłużając czas, w którym komórki mogą dostarczać korzystne czynniki do leżącego poniżej mięśnia sercowego.
Wąskim gardłem w podejściu do łatki jest trudność przyklejenia łatki do powierzchni serca. Wiele grup poradziło sobie z tym za pomocą różnych technik, z których najbardziej rozpowszechnioną jest prosty szew do przywiązania konstruktu do powierzchni serca9,10. Okazało się to skuteczne w wielu przypadkach, w których konstrukcja jest wykonana ze sztywniejszego materiału, ale zawodzi przy próbie na systemie hydrożelowym, ze względu na wysokie stężenie wody i delikatną naturę konstrukcji łaty. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy zewnętrzny system klejenia z klejem fibrynowy, który naśladuje chemię tworzenia się skrzepów. Klej fibrynowy był stosowany w wielu operacjach medycznych, w tym w przypadku łez opony twardej, przetok oskrzelowych i przeszczepów rogówki, podkreślając biokompatybilność produktu jako uszczelniacza ran11-13. Ponadto fibryna była stosowana do różnych celów kardiologicznych, w tym do chirurgicznego leczenia pęknięć lewej komory i operacji pomostowania tętnic wieńcowych, jednak jej zastosowanie jako kleju adhezyjnego do plastra sercowego nie jest powszechnie stosowane14-17. Prosta formuła trombiny i fibrynogenu daje w efekcie biokompatybilny klej, który można umieścić bezpośrednio na zewnątrz zewnętrznego plastra nasercowego, zapewniając realny system adhezji zapewniający interakcję plastra z sercem.

<table><tbody><tr><td>Wentylator myszy Harvard Model 687</td><td>Aparat Harvard</td><td>55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Inintech Biosciences LLC Sterylizator suchych szklanych kulek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny Leica MZ6</td><td></td> Zestaw do kauteryzacji Gemini <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>- końcówki 0,4 mm Kątowe</td><td>narzędzia naukowe</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Zwijacz Agricola - 3,5 cm rozpięty</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe - Ostrza 2,5 mm Proste</td><td>narzędzia do nauki</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Uchwyt na igły - z blokadą z węglika wolframu 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki - delikatne proste 10,5 cm</td><td>Narzędzia do nauki o nakryciu</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Szew monofilamentowy 8-0</td><td>Ethicon</td><td>8730P</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Szew jedwabny</td><td>Ethicon</td><td>639G</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

Mysi model MI jest powszechnie uznawany w dziedzinie chorób sercowo-naczyniowych i jest konsekwentnie stosowany jako pierwszy krok do testowania skuteczności leczenia in vivo1. Tradycyjny, ustalony protokół został jeszcze bardziej dopracowany w celu zminimalizowania szkód wyrządzonych zwierzęciu. Warto zauważyć, że warstwy mięśni piersiowych są usuwane, a nie po prostu cięte, a torakotomia jest podchodziła międzyżebrowo, w przeciwieństwie do łamania żeber w sternotomii, zachowując integralność klatki piersiowej. Dzięki tym zmianom zmniejsza się ogólny stres zwierzęcia. 
Terapie komórkami macierzystymi mające na celu złagodzenie szkód spowodowanych przez zawały serca okazały się obiecujące na przestrzeni lat ze względu na swoje pro-angiogenne i antyapoptotyczne korzyści. Obecne podejścia do dostarczania komórek na powierzchnię serca zazwyczaj obejmują wstrzyknięcie komórek w pobliżu uszkodzonego miejsca, w tętnicy wieńcowej lub do obwodowego krwiobiegu2-4. Chociaż udowodniono, że komórki są domem dla uszkodzonego mięśnia sercowego, jego funkcjonalność jest ograniczona przez ich słabe wszczepienie w miejscu urazu, co powoduje dyfuzję do krwiobiegu5. Niniejszy manuskrypt przedstawia procedurę, która pokonuje tę przeszkodę za pomocą plastra hydrożelowego otoczonego komórkami. Plaster jest wytwarzany przed zabiegiem chirurgicznym i umieszczany na uszkodzonym mięśniu sercowym bezpośrednio po niedrożności lewej tętnicy wieńcowej. Aby przykleić plaster na miejscu, biokompatybilny zewnętrzny klej fibrynowy jest umieszczany bezpośrednio na wierzchu plastra, co pozwala na wyschnięcie zarówno na plastrach, jak i na powierzchni serca. Podejście to zapewnia nowatorską metodę adhezji do zastosowania delikatnego konstruktu terapeutycznego otaczającego komórki.

Podczas procedury chirurgicznej podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej można zidentyfikować po wyraźnym zblednięciu tkanek poniżej miejsca zamknięcia tętnicy. W ramach testu przed zawiązaniem węzła można krótko zacisnąć szew, aby sprawdzić, czy znajduje się on w odpowiednim miejscu. Ponadto, ponieważ zamknięcie tętnicy skutkuje niemal natychmiastowym spadkiem zdolności lewego przedsionka do prawidłowego skurczu, lewy przedsionek powiększy się w odpowiedzi na cofanie się krwi w układzie.
Pomiary e...

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeniesienie terapeutycznego plastra hydrożelowego na powierzchnię serca w celu zminimalizowania uszkodzeń następujących po zawale mięśnia sercowego. Jest to realizowane poprzez wstępne odsłonięcie powierzchni serca za pomocą torakotomii. W drugim kroku, w miejscu lewej tętnicy wieńcowej, zawiązuje się mały węzeł szewny, aby wywołać zawał mięśnia sercowego.Następnie terapeutyczny plaster hydrożelowy jest przytwierdzany do powierzchni serca za pomocą kleju fibrynowego, po czym jamę klatki piersiowej zamyka się. Ostatecznie do oceny zmian w strukturze i funkcji serca, które występują w obecności i przy braku tych technik interwencyjnych, wykorzystuje się analizę histologiczną oraz echokardiografię małych zwierząt. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii komórek macierzystych, takie jak określenie liczby komórek i metod podania niezbędnych do poprawy funkcji serca.Po zawale mięśnia sercowego. Choć metoda ta jest stosowana w celu uzyskania wiedzy na temat terapii zawałów mięśnia sercowego, może być również wykorzystana w innych systemach inżynierii tkankowej i rewaskularyzacji, takich jak model niedokrwienia kończyny tylnej. Rozpocznij od umieszczenia zdrowej, znieczulonej myszy na statywie do intubacji i skierowania źródła światła w stronę klatki piersiowej zwierzęcia.Następnie za pomocą pęsety odsunąć powierzchnię krtani, aby odsłonić struny głosowe. Po czym ostrożnie wprowadzić kaniulę do angiografii o rozmiarze 20 G pomiędzy struny głosowe i płynnie wprowadzić ją do tchawicy.Podłącz cewnik do respiratora dla małych zwierząt i wykonaj jeden mechaniczny ruch klatki piersiowej, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie cewnika. Następnie ułóż zwierzę w pozycji grzbietnej na podkładce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść z pola operacyjnego, a następnie wykonaj trzy naprzemienne mycia sterylizujące Betadyną i 75% etanolem. Umieść.Nanieś maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu podczas zabiegu, a następnie obłóż pole operacyjne sterylnymi obłożami. Rozpocznij procedurę chirurgiczną, wykonując nacięcie skóry około jednego centymetra na lewo, biegnące przez całą długość mostka. Zlokalizuj linię oddzielającą mięsień piersiowy większy i za pomocą pęsety delikatnie unieś mięsień, aby oddzielić go od znajdującego się pod nim mięśnia skośnego zewnętrznego brzucha.Odciągnięcie mięśnia przyśrodkowo. W ten sam sposób odseparuj mięsień skośny zewnętrzny od leżącej pod nim klatki piersiowej, ale stosując odciągnięcie boczne, aby zapewnić niezakłócony widok drugiego, trzeciego i czwartego żebra.Delikatnie unieś czwarty żebro i za pomocą kauteryzatora otwórz jamę klatki piersiowej pomiędzy trzecim a czwartym żebrem. Następnie umieść rozszerzacze, aby dodatkowo otworzyć jamę; odsłoń serce, przerwij osłonkę osierdziową za pomocą pęsety, a następnie podwiąż lewą tętnicę wieńcową monofilamentową nicią nylonową o rozmiarze 8-0 w odległości około 4 mm od wierzchołka serca, bezpośrednio poniżej dolnej krawędzi lewego przedsionka. Jeśli szew został umieszczony prawidłowo, zaobserwowano będzie bladość mięśnia sercowego komory oraz zwiększenie rozmiaru lewego przedsionka.Aby założyć łatkę, należy użyć szpachelki o płaskim końcu, aby delikatnie umieścić hydrożel na powierzchni serca w miejscu zawału. Używając szpachelki, należy lekko przytrzymać łatkę w miejscu, podczas gdy asystent szybko miesza klej przez około minutę. Gdy klej osiągnie pożądaną lepkość, należy szybko przenieść około 10 µL na powierzchnię łatki.Następnie użyj od trzech do czterech pojedynczych szwów przerywanych z monofilamentowego nylonu 6-0, aby zamknąć warstwę żeber. Przed zamknięciem warstwy międzyżebrowej wprowadź do nacięcia kaniulę PE 10. Następnie zamknij mięśnie piersiowe za pomocą od trzech do czterech pojedynczych szwów przerywanych.Zamknij warstwę skóry za pomocą szwu ciągłego i przymocuj strzykawkę o pojemności 1 ml do końcówki kaniuli. Na koniec opróżnij jamę klatki piersiowej, podaj leki przeciwbólowe po zabiegu w ciągu sześciu do ośmiu godzin od zamknięcia i monitoruj zwierzę aż do pełnego powrotu do zdrowia; pomiary echokardiograficzne wykonane już dwa dni po zawale wykazują ustanie ruchu ściany lewej komory, co świadczy o przebudowie mięśnia. Obliczenia jakościowe wykonane na podstawie danych wykazują spadek frakcji wyrzutowej i objętości wyrzutowej w sercach z zawałem.Analiza histologiczna zdrowych i zainfarctowanych serc wykazuje rozszerzenie lewej komory oraz pocienienie ściany lewej komory obserwowane w mięśniu sercowym po zawale. Oba te objawy przebudowy tkanki i odkładania tkanki bliznowatej sprawiają, że zastosowanie łaty jest użytecznym podejściem terapeutycznym w leczeniu zawału, ponieważ klej fibrynowy nie uszkadza mięśnia sercowego. Rzeczywiście, w miejscu aplikacji nie obserwuje się przebudowy tkanki ani pocienienia komory, a kardiomiocyty pozostają nienaruszone pomimo zastosowania zarówno łaty sercowej, jak i towarzyszącego jej kleju.Ponadto testy żywotności potwierdzają, że naniesienie kleju na zewnętrzną powierzchnię hydrożelowego plastra enkapsulującego komórki nie wpływa na przeżywalność komórek wewnątrz plastra. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 30 do 40 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest odpowiednie zsynchronizowanie aplikacji kleju fibrynowego, aby zapewnić właściwą adhezję plastra do twardej powierzchni.

a-hydrogel-construct-fibrin-based-glue-approach-to-deliver

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Hydrożelowa konstrukcja i podejście oparte na kleju z fibryną do dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Implantacja biogramu do leczenia zawału mięśnia sercowego wywołanego podwiązaniem LAD w modelu gryzoni tradycyjnie wymagała dwóch operacji na otwartym sercu. W celu zmniejszenia śmiertelności i zapewnienia optymalnych warunków do utrwalania stałych i galaretowatych biomatryc związanych z komórkami, opracowano procedury małoinwazyjne.

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Supramolekularne hydrożelatory oparte na ureido-pirymidynonach pozwalają na pełną kontrolę nad makroskopowymi właściwościami żelu i zachowaniem zol – żel za pomocą pH. W tym miejscu przedstawiamy protokół formułowania i wstrzykiwania takiego supramolekularnego hydrożelatora za pomocą systemu dostarczania cewnika do miejscowego dostarczania bezpośrednio w odpowiednie obszary serca świni.

Supramolekularny hydrożel do wstrzykiwań i lek do miejscowego wstrzykiwania cewnika do serca świni

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych za pomocą hydrożelowej łaty i kleju fibrynowego w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. Technika poprawia przetrwanie komórek i regenerację serca.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. (Wideo) | JoVE Journal

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Przeglądaj więcej filmów