Name: Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów z ludzkiej skóry do analizy fenotypowej i hodowli ex vivo. Protokół obejmuje pobranie biopsji, dysocjację enzymatyczną oraz analizę cytometrią przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biopsje skóry od pacjentów z łuszczycą zostały uprzejmie dostarczone przez dr Andreasa Koerbera (Wydział Dermatologii Uniwersytetu w Essen, Niemcy) po ustnej lub pisemnej świadomej zgodzie na wykorzystanie naukowe. 
X.H. jest również obsługiwany przez NSFC 61263039 i NSFC 11101321.

UWAGA: Biopsje skóry od zdrowych osób zostały pobrane z resztek skóry brzucha osób poddawanych planowej operacji plastycznej po ustnej lub pisemnej świadomej zgodzie na wykorzystanie naukowe. Stosowanie ludzkiej skóry zostało zatwierdzone i zgodne z przepisami ustalonymi przez Medyczne Komisje Etyczne ds. Badań na Ludziach Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud w Nijmegen w Holandii i Uniwersytetu w Essen w Niemczech.
1. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z ludzkiej skóry (praca sterylna w komorze przepływowej, jeśli wymagana jest kolejna hodowla komórkowa)
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 + penicylina/streptomycyna (końcowe stężenia odpowiednio 100 jednostek/ml i 100 μg/ml) + pirogronian (0,02 mM) i glutamax (0,02 mM), bez dodatku surowicy.</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną: pożywkę przygotowaną w kroku 1.1 + 10% zbiorcza surowica ludzka (HPS); przechowywać w temperaturze 4°C. Przed użyciem doprowadzić pożywkę do temperatury 20 °C ± 2.</li>
	<li>Wykonać biopsję skóry za pomocą okrągłego dziurkacza do biopsji o średnicy 4 mm i przechowywać go w RPMI1640 kompletnej pożywce hodowlanej w temperaturze 20 °C ± 2 przez okres do 4 godzin lub w temperaturze 4 °C ON. Biopsję należy wykonać jak najszybciej po przybyciu do laboratorium. 
	UWAGA: Dłuższe przechowywanie skóry wpłynie na wydajność komórek i ich żywotność.</li>
	<li>Oznaczyć probówkę dysocjacyjną z niebieską nakrętką i dodać 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej do znakowanej probówki.</li>
	<li>Dodać 2 ml kompletnej pożywki do każdej studzienki (w sumie 3 dołki) sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą sterylnych narzędzi umieść biopsję w jednym dołku, przepłucz, przenieś ją do drugiego dołka i powtórz ten krok jeszcze raz, uzyskując w ten sposób w sumie trzy płukania.</li>
	<li>Przenieś dobrze wypłukaną biopsję skóry na sterylną szalkę Petriego, dodaj 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej na wierzch biopsji i ostrożnie zeskrob podskórną tkankę tłuszczową za pomocą jednorazowego sterylnego skalpela ze stali nierdzewnej. 
	UWAGA: Jest to krytyczny krok.</li>
	<li>Pokrój każdą biopsję skóry na 4 mniejsze kawałki na sterylnej szalce Petriego. Przenieść próbki (do czterech biopsji po 4 mm na probówkę) do przygotowanej probówki dysocjacyjnej zawierającej 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Szczelnie zamknij rurki nakrętką i przymocuj do góry nogami tuleję automatycznego dysocjatora tkanek. Upewnij się, że cały materiał próbki znajduje się w obszarze wirnika.</li>
	<li>Rozpocznij proces dysocjacji, uruchamiając "program m_spleen _01" (predefiniowany program dostarczany przez pamięć wewnętrzną instrumentu lub dołączoną kartę programu) w celu dysocjacji biopsji z odpowiednią prędkością obrotową przez 56 sekund.</li>
	<li>Po przetworzeniu odłącz rurkę dysocjacyjną od dysocjatora i upewnij się, że cały zdysocjowany materiał został zebrany na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 150 μl kolagenazy I-A (80 mg/ml) do probówki dysocjacyjnej i inkubować próbkę w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Dodać 100 μl DNazy I (5 mu/ml) do probówki dysocjującej, dobrze wymieszać. 
	UWAGA: Wyższe stężenie kolagenazy lub dłuższy czas inkubacji zmieni żywotność komórek.</li>
	<li>Podłącz rurkę dysocjacyjną do tulei automatycznego dysocjatora tkanek i uruchom "program m_ śledziony _01", aby jeszcze raz oddzielić biopsję.</li>
	<li>Umieść sitko z nylonu o pojemności 70 μM na górze probówki Falcon o pojemności 50 ml. Nałóż zdysocjowane materiały próbek do tego sitka do komórek, aby usunąć grudki komórek/resztki tkanek.</li>
	<li>Sitko przemyć raz 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 10 minut i odsysać supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok prania jeszcze raz. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl kompletnej pożywki hodowlanej. Zawiesiny jednokomórkowe są gotowe do dalszej analizy; Kontynuuj stosowanie protokołów hodowli komórkowych ex vivo lub analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>W przypadku dalszego barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi przed wykonaniem analizy cytometrii przepływowej należy stymulować komórki PMA (12,5 ng/ml), jonomycyną (500 ng/ml) i brefeldyną A (5 μg/ml) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, inkubatorze 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
</ol>
2. Poliklonalna aktywacja limfocytów T rezydujących w skórze (hodowla komórkowa ex vivo)
<ol>
	<li>Podwielokrotność 100 μl zawiesin jednokomórkowych (przygotowanych w kroku 1.15) na okrągłodenną 96-dołkową płytkę. 
	UWAGA: Dla każdej biopsji skóry o średnicy 4 mm nabyte zawiesiny jednokomórkowe można podzielić na co najmniej dwie studzienki 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodać mikrogranulki pokryte mAb anty-CD3/anty-CD28 (25 000 kulek na studzienkę), rekombinowaną ludzką cytokinę rIL-2 (końcowe stężenie 25 U/ml) i rIL-1β (końcowe stężenie 50 ng / ml).</li>
	<li>Przykryj płytkę hodowlaną dobrze oznakowaną pokrywką płytki, inkubować w inkubatorze o wilgotności 5% CO2 i wilgotności 37 °C. Zmień średnie, gdy kolor medium zmieni się na żółty. 
	UWAGA: Przejrzystą kolonię komórkową można zaobserwować od 8 dnia hodowli komórkowej.</li>
</ol>
3. Analiza cytometrii przepływowej pierwotnych/hodowanych limfocytów T rezydujących w skórze
<ol>
	<li>Przygotować bufor FACS: PBS + 0,2% BSA.</li>
	<li>Przenieś interesujące komórki do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl PBS. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.</li>
	<li>Wybarwić komórki 100 μl przygotowanego sprzężonego barwnika żywotności eFluorescence780 (rozcieńczenie 1:1 000 przy użyciu PBS) w temperaturze 4 °C przez 30 min. Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i aspirować supernatant.</li>
	<li>Wybierz wymagany marker powierzchni komórki mAb, na przykład: CD45-BV421 (HI30, 1:: 20), CD3-ECD(UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5(1388.2, 1:200), CD8-APC-AlexFluo700(B9.11, 1:400), CD14-FITC(TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750(13-119, 1:50), CD56-PE(MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7(BC96, 1:50), CD11c-PeCy7(BU15, 1:10) i CD1c-APC(AD5-8E7, 1:10), przygotować mieszaninę mAbs, używając buforu FACS, zgodnie z każdym badanym współczynnikiem rozcieńczenia mAb. Zdefiniuj ustawienia bramki za pomocą kontroli izotypu przeciwciała wraz z próbką niebarwiącą.</li>
	<li>Dodać 25 μl przygotowanej mieszaniny mAbs do każdej studzienki. Inkubować 20 minut w temperaturze 20 °C ± 2, chronić przed światłem.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odessać supernatant.</li>
	<li>W przypadku próbek, które wymagają jedynie barwienia powierzchni komórek, przejdź do kroku 3.16.</li>
	<li>W przypadku wewnątrzkomórkowego barwienia Foxp3:
	<ol>
		<li>Przygotować bufor utrwalający i przepuszczalny, mieszając jedną część koncentratu z 3 częściami rozcieńczalników.</li>
		<li>Przygotować 1x bufor permeabilizacyjny: 1 część 10x bufor permeabilizacji + 9 części wysterylizowanegoH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić osady w 100 μl buforu utrwalającego i przepuszczalnego, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu permeabilacyjnego do każdej studzienki, odwirować przy 450 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty i odessać supernatant.</li>
	<li>Jeszcze raz przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym.</li>
	<li>Wybierz wymagane wewnątrzkomórkowe przeciwciała monoklonalne, na przykład Foxp3-eFluo450(PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488(eBio64DEC1, 1:50) i IFNγ-PeCy7(4S. B3, 1:400). Przygotować mieszaninę mAbs przy użyciu buforu permeabilacyjnego zawierającego 2% normalnej surowicy szczura zgodnie z każdym badanym współczynnikiem rozcieńczenia mAb. Zdefiniuj ustawienia bramki za pomocą kontroli izotypu przeciwciała wraz z próbką niebarwiącą.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 20 μl przygotowanej mieszaniny mAb. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chronić przed światłem.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji dodać 100 μl buforu permeabilizacji do każdej studzienki. Odwirować w temperaturze 20 °C ± 2, 450 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant.</li>
	<li>Jeszcze raz przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym. Zawiesić osad w 110 μl buforu FACS i przenieść zawiesiny komórek do probówki microFACS. 
	UWAGA: Próbka jest gotowa do pomiaru za pomocą 10-kolorowej cytometrii przepływowej.</li>
	<li>W przypadku gdy wymagana jest dokładna liczba komórek, należy dodać 10 μl dobrze wymieszanej jednorodnej zawiesiny fluorosfer do każdej próbki bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Zaletą tego protokołu jest izolacja stosunkowo dużej liczby żywotnych limfocytów i ekspresja odpowiednich markerów powierzchniowych. Zidentyfikowanymi podzbiorami komórek były: CD11c+ DCs, CD4+ i CD8+ T cell oraz Foxp3+CD25+ cells. Co ważne, hodowla ex vivo wyizolowanych limfocytów T rezydujących w skórze była bardzo dobrze wykonalna i poz...

Skóra, jako główny interfejs między ciałem a środowiskiem, stanowi pierwszą linię obrony przed zewnętrznymi fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi zniewagami, takimi jak zranienia, promieniowanie ultrafioletowe i mikroorganizmy. Skóra składa się z dwóch głównych przedziałów, naskórka i skóry właściwej, i zawiera różne komórki odpornościowe, w tym komórki Langerhansa, makrofagi, komórki dendrytyczne (DC) i około 20 miliardów limfocytów T pamięci, prawie dwa razy więcej niż liczba obecna w całej objętości krwi1,2. Coraz więcej danych potwierdza pogląd, że skóra pełni podstawowe funkcje immunologiczne, zarówno podczas homeostazy tkanek, jak i w różnych stanach patologicznych. Uważa się, że komórki odpornościowe znajdujące się w normalnej skórze przeprowadzają nadzór immunologiczny3 i wykazano, że odgrywają rolę w rozwoju zaburzeń zapalnych, takich jak łuszczyca4. W łuszczycowej zmianie skórnej obserwowano zarówno limfocyty T naciekane CD4+, jak i CD8+ i wykazano, że stosunek CD4 i CD8 różni się w zależności od statusu choroby5. Jednak te populacje komórek są trudne do zbadania, ponieważ istniejące techniki pozwalają na izolację tylko kilku komórek.
Obecnie powszechnie stosowane techniki izolacji limfocytów T z ludzkiej skóry łączą mechaniczną dysocjację skóry z leczeniem enzymatycznym. Biopsje ludzkiej skóry są intensywnie mielone i inkubowane z enzymami, takimi jak trypsyna, kolagenaza i / lub EDTA6-8. Biorąc pod uwagę, że skóra jest tkanką barierową, która jest wysoce odporna na siły rozciągające i mechaniczną dezagregację, ustalone metody izolacji limfocytów T wytworzyły bardzo mało komórek, a nawet mniejszą liczbę żywotnych komórek, co sprawia, że hodowla komórkowa ex vivo tych populacji komórek jest trudna i wymagająca.
Tutaj przedstawiamy zmodyfikowaną metodę izolacji limfocytów zarówno ze zdrowej, jak i zaangażowanej łuszczycowej skóry ludzkiej, łącząc mechaniczną dysocjację skóry za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek zamiast ustalonej metody intensywnego mielenia, wraz z trawieniem enzymatycznym za pomocą kolagenazy. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki obserwowano różne żywotne podgrupy komórek odpornościowych, w tym limfocyty DC i T. Co ważne, ekspresja markerów powierzchniowych CD3, CD4 i CD8 była dobrze zachowana. Tak przygotowane komórki są gotowe do użycia w hodowlach komórkowych ex vivo lub analizie metodą cytometrii przepływowej. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do analizy pojedynczych biopsji skóry (4 mm) pochodzących ze skóry chorobowej pacjentów z łuszczycą. Wyniki wykazały, że limfocyty T pacjentów przebywających w skórze wytwarzały więcej cytokin zapalnych, takich jak IL-17 i IFNγ, w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami9.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F 4</td><td>mm</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne skalpele</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>probówka gentleMACS C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Z niebieską nasadką, używana jako rurka dysocjacyjna.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dysocjator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automatyczny dysocjator tkanek. Korzystanie z "programu spleen_01" do dysocjacji biopsji skóry.</td></tr><tr><td>Sitko do komórek&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &mikro; m nylonowa</td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek Pooled Serum (HPS)</td> przygotowane <td></td><td></td><td>we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Typ 1-A, odpowiednie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalany barwnik żywotności (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Barwienie martwych komórek przed utrwaleniem komórek; rozcieńczyć PBS w stosunku 1:1,000</td></tr><tr><td>Koncentrat utrwalający/przepuszczalny</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik utrwalający/przepuszczalny</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Bufor przepuszczalny (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mysz anty-ludzka CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>klon: HI30; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Klon: TUK4; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Klon: MOC-1; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mysz anty-ludzka CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Klon: UCHT1; współczynnik rozcieńczenia 1:50 dla barwienia powierzchni; współczynnik rozcieńczenia 1:25 dla barwienia wewnątrzkomórkowego.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mysz anty-ludzka CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Klon: 13B8.2; współczynnik rozcieńczenia 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mysz anty-ludzka CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Klon: BU15; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>Mysz APC anty-ludzka CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Klon: AD5-8E7; współczynnik rozcieńczenia 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mysz anty-ludzka CD8</td><td>Beckman - Redlica</td><td>A66332</td><td>Klon: B9.11; współczynnik rozcieńczenia 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mysz anty-ludzka CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Klon: J3-119; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mysz anty-ludzka CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Klon: BC96; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE Szczur anty-ludzki CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>klon: HECA-452; współczynnik rozcieńczenia 1:</td></tr> <tr><td>eFluo450 Szczur anty-ludzki Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Klon: PCH101; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mysz anty-ludzka IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Klon: eBio64DEC17; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mysz anty-ludzka IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Klon: 4S. Klasa B3; barwienie wewnątrzkomórkowe; współczynnik rozcieńczenia 1:400</td></tr><tr><td>Fluorosfery zliczające przepływ</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Kulki zliczające, do cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Ludzka skóra pełni ważną funkcję barierową i zawiera różne komórki odpornościowe, które przyczyniają się do homeostazy tkanek i ochrony przed patogenami. Ponieważ skóra jest stosunkowo łatwo dostępna, stanowi idealną platformę do badania obwodowych mechanizmów regulacji immunologicznej. Komórki rezydujące immunologicznie w zdrowej skórze prowadzą nadzór immunologiczny, ale odgrywają również ważną rolę w rozwoju chorób zapalnych skóry, takich jak łuszczyca. Pomimo pojawiających się spostrzeżeń, nasza wiedza na temat biologii leżącej u podstaw różnych chorób zapalnych skóry jest nadal ograniczona. Istnieje zapotrzebowanie na dobrej jakości (pojedyncze) populacje komórek wyizolowane z próbek skóry pobranych z biopsji. Do tej pory procedury izolacji były poważnie utrudnione ze względu na brak uzyskania wystarczającej liczby żywotnych komórek. Na izolację i późniejszą analizę wpłynęła również utrata markerów linii immunologicznej komórek ze względu na naprężenia mechaniczne i chemiczne spowodowane obecnymi procedurami dysocjacji w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną metodę izolowania limfocytów T zarówno ze zdrowej, jak i zaangażowanej łuszczycowej skóry ludzkiej, łącząc mechaniczną dysocjację skóry za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek i leczenia kolagenazą. Metodologia ta zachowuje ekspresję większości markerów linii immunologicznej, takich jak CD4, CD8, Foxp3 i CD11c po przygotowaniu zawiesin pojedynczych komórek. Przedstawiono przykłady udanej izolacji limfocytów T CD4 + oraz późniejszej analizy fenotypowej i funkcjonalnej.

Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu pozwala na uzyskanie od 2 200 ± 615 (średnia ± SEM, skóra zdrowych ochotników) do 178 000 ± 760 (średnia ± SEM, skóra z obszarów zmian u pacjentów z łuszczycą) żywych limfocytów ze skóry ludzkiej przy zastosowaniu pojedynczej biopsji skóry o średnicy 4 mm.
W zawiesinach pojedynczych komórek uzyskanych ze skóry zdrowych osób zidentyfikowano różne typy komórek CD45+, w tym limfocyty T CD4+ (~45%), limfocyty T CD8+ (...

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna izolacja limfocytów T rezydentnych w skórze z biopsji skóry ludzkiej. Osiąga się to poprzez pobranie biopsji skóry ludzkiej za pomocą okrągłego wyciaka do biopsji. Następnie każdą biopsję skóry tnie się na cztery mniejsze fragmenty w szalce Petriego.Następnie tkanka skóry jest dysocjowana mechanicznie i enzymatycznie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Na koniec limfocyty rezydujące w skórze są analizowane metodą cytometrii przepływowej i hodowane ex vivo. W rezultacie można wyizolować i przeanalizować za pomocą immunobarwienia oraz analizy FACS wystarczającą liczbę żywych ludzkich limfocytów rezydujących w skórze.Niniejsza metoda pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dermatologii oraz immunologii guzów skóry. Przykładowo, w jaki sposób rezydentne limfocyty T w skórze przyczyniają się do rozwoju choroby. Procedurę zaprezentuje Xuehui He, doktorant z naszego laboratorium.Po przygotowaniu pożywki hodowlanej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać dwa mililitry pożywki kompletnej do trzech dołków sterylnej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Następnie, za pomocą okrągłego wycinaka do biopsji o średnicy czterech milimetrów, należy pobrać biopsję skóry. Umieść ją w kompletnej pożywce hodowlanej RPMI 1640 i pozostaw na blacie do czterech godzin lub w temperaturze czterech stopni Celsius overnight.Podczas inkubacji biopsji należy opisać probówkę do dysocjacji z niebieską zakrętką i dodać do niej pięć mililitrów pełnej pożywki hodowlanej. Następnie, używając sterylnych narzędzi, należy umieścić biopsję w pierwszej studzience w celu jej wypłukania. Przenieś tkankę do drugiej studzience, wypłucz ją, a następnie powtórz ten proces jeszcze raz w trzeciej studzience.Przenieść dobrze wypłukaną biopsję skóry do sterylnej szalki Petriego i nanieść pipetą 100 µL pełnej pożywki hodowlanej na wierzch próbki. Następnie, używając jednorazowego sterylnego skalpela ze stali nierdzewnej, ostrożnie zeskrobać tkankę tłuszczową podskórną. W nowej sterylnej szalce Petriego podzielić każdą biopsję skóry na cztery mniejsze fragmenty.Następnie przenieś próbki do przygotowanej probówki do dysocjacji zawierającej 5 mL pożywki kompletnej. Szczelnie zakręć probówkę i zamocuj ją dnem do góry w uchwycie automatycznego dysocjatora tkanek. Upewnij się, że cały materiał próbki znajduje się w obszarze działania rotora.Następnie należy rozpocząć proces dysocjacji, uruchamiając program M spleen zero one, aby zdysocjować biopsjat przy odpowiedniej prędkości obrotowej przez 56 sekund. Po zakończeniu procesu należy odłączyć probówkę do dysocjacji z dysocjatora i upewnić się, że cały zdysocjowany materiał zebrał się na dnie probówki.Do probówki do dysocjacji dodać 150 µL kolagenezy 1A i inkubować próbkę w wytrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Następnie do probówki do dysocjacji dodać 100 µL DNazy i dokładnie wymieszać. Umieścić probówkę do dysocjacji w uchwycie automatycznego dysocjatora tkanek i uruchomić program M spleen 01, aby ponownie poddać biopsję dysocjacji.Następnie na górze probówki typu Falcon o pojemności 50 ml umieść nylonowe sito komórkowe o oczkach 70 µm i przelej przez nie zdysocjowany materiał próbkowy, aby usunąć skupiska komórek i resztki tkankowe. Użyj 5 ml pełnej pożywki, aby raz przepłukać sito komórkowe. Następnie odwiruj filtrat przy 450 G i 20 °C ± 2 °C przez 10 minut, a po tym czasie odessij nadsącz.Po powtórzeniu etapu płukania jeszcze raz, należy użyć 300 µL kompletnej pożywki hodowlanej, aby zawiesić osady komórkowe. Jednokomórkowe zawiesiny są teraz gotowe do dalszej analizy. W celu przeprowadzenia wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin, należy użyć PMA, jonomycyny i brefeldyny A do stymulacji komórek, a następnie inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny przed wykonaniem analizy cytometrycznej.Aby przeprowadzić poliklonalną aktywację T-komórek rezydujących w skórze, nanieś 100 µL zawiesiny pojedynczych komórek do okrągłodennej płytki 96-dołkowej. Dodaj mikrocząsteczki powlekane przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, rekombinowane ludzkie cytokiny, IL-2 oraz IL-1B. Przykryj płytkę hodowlaną szczelnie dopasowaną pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 i 100% wilgotności.Następnie, gdy pożywka zmieni kolor na żółty, należy ją wymienić. W ósmym dniu hodowli komórkowej można zaobserwować wyraźną kolonię komórek. Aby przeprowadzić analizę FACS, przenieś wybrane komórki do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.Wiruj przy 450 G i 20 °C (± 2 °C) przez dwie minuty. Następnie odessaj supernatant. Aby zbarwić komórki, użyj 100 µL przygotowanego fluorescencyjnego barwnika do oceny żywotności (fixable viability dye) sprzężonego z 780, inkubując próbkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut.Następnie należy dodać 100 µL buforu FACS i odwirować próbki przed odessaniem supernatantu. W dalszej kolejności, po wybraniu przeciwciał monoklonalnych przeciwko markerom powierzchniowym komórek z listy zamieszczonej w protokole tekstowym, należy przygotować roztwory przeciwciał w buforze FACS. W celu zdefiniowania ustawień bramkowania należy zastosować kontrolę izotypową przeciwciał wraz z próbką niebarwioną.Następnie należy dodać 25 µL przygotowanej mieszaniny przeciwciał mysich do każdej studzienki i zabezpieczyć przed światłem. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 20 minut. Dodać 100 µL buforu FACS, odwirować i odessać nadsącz.Używając buforów przygotowanych do barwienia foxp3 zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 100 µL buforu do fiksacji i permeabilizacji, aby resuspender osady. Wymieszaj dokładnie i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie dodaj 100 µL buforu do permeabilizacji do każdego dołka i odwiruj przed odessaniem nadsączu.Po ponownym przemyciu komórek i wyborze odpowiednich przeciwciał, należy dodać 20 µL przygotowanej mieszaniny przeciwciał monoklonalnych do każdej studni i zabezpieczyć próbki przed światłem przed inkubacją w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Komórki należy przemyć jeszcze raz, używając buforu do permeabilizacji. Następnie, przy użyciu 110 µL buforu FACS, należy ponownie zawiesić osady i przenieść zawiesiny komórkowe do mikroprobówek do FACS.Na koniec, jeśli wymagana jest dokładna liczba komórek, do każdej próbki należy dodać 10 µL dobrze wymieszanej, jednorodnej zawiesiny fluorosfer bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów FACS. Jak pokazano tutaj, w zawiesinach pojedynczych komórek pochodzących ze skóry zdrowych osób zidentyfikowano różne typy leukocytów wykazujących ekspresję CD45. W ich liczbie znalazły się limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+ oraz komórki dendrytyczne CD11c+.Podczas gdy zaobserwowano niewiele limfocytów B, komórek NK lub makrofagów. Ponadto zastosowana metodologia umożliwia analizę komórek CD4+, CD25+ i foxp3+ w biopsjach skóry ludzkiej. Na przykład, stosując barwienie wewnątrzkomórkowe po fiksacji i permeabilizacji, możliwe jest wykazanie ekspresji czynnika transkrypcyjnego foxp3 w limfocytach T CD25+.Jak pokazano tutaj, aby uniknąć autofluorescencji tła oraz populacji komórek autofluorescencyjnych, do wyznaczania bramki dla populacji limfocytów zaleca się stosowanie przeciwciała mysiego anty-CD45 przeciwko ludzkiemu białku, koniugowanego z fluorochromem brilliant violet 421. Rysunek ten ilustruje, że większość komórek rezydentnych w ludzkiej skórze stanowiły CD3-dodatnie limfocyty T. Do analizy żywotności komórek zaleca się stosowanie utrwalanego barwnika do oceny żywotności, aby odróżnić komórki żywe od martwych lub obumierających.W ramach dalszej analizy funkcjonalnej, z wykorzystaniem pojedynczej biopsji skóry o średnicy czterech milimetrów pobranej z obszaru zmiany u pacjentów z łuszczycą, wykazano, że pochodzące z biopsji limfocyty T produkowały IL-17a oraz interferon gamma. Miało to miejsce po czterogodzinnej stymulacji PMA i jonomycyną w obecności brefeldyny A. Wreszcie, rycina ta pokazuje, że limfocyty T od osób z łuszczycą wykazują znacznie wyższą zdolność do produkcji cytokin związanych z łuszczycą: IL-17a i interferonu gamma. Należy pamiętać, że praca z tkanką ludzką i odczynnikami laboratoryjnymi może być niebezpieczna.Zawsze należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa.

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów ze skóry ludzkiej w celu analizy fenotypu i Ex Vivo hodowlę komórek

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj metodę izolacji limfocytów z ludzkiej skóry do analizy fenotypowej i hodowli ex vivo. Protokół obejmuje pobranie biopsji, dysocjację enzymatyczną oraz analizę cytometrią przepływową.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Przeglądaj więcej filmów