Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie rezydujących w skórze limfocytów T z biopsji ludzkiej skóry. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie biopsji ludzkiej skóry za pomocą okrągłego stempla biopsyjnego. Następnie każda biopsja skóry jest cięta na cztery mniejsze kawałki na szalce Petriego.

Następnie tkanka skórna jest mechanicznie i enzymatycznie dysocjowana w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. Na koniec limfocyty rezydujące w skórze są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej i hodowane ex vivo. Ostatecznie wystarczająca liczba żywotnych limfocytów rezydujących w ludzkiej skórze może zostać wyizolowana i przeanalizowana za pomocą barwienia immunologicznego i analizy FACS.

Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu dermatologii i immunologii nowotworów skóry. Na przykład, w jaki sposób rezydujące limfocyty T w skórze przyczyniają się do choroby. Procedurę zademonstruje Xuehui He, doktorant z naszego laboratorium.

Po przygotowaniu pożywki hodowlanej, zgodnie z protokołem tekstowym, dodać dwa mililitry kompletnej pożywki do trzech dołków sterylnej sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie użyj czteromilimetrowego okrągłego stempla biopsyjnego, aby uzyskać biopsję skóry. Umieść je w kompletnej pożywce hodowlanej RPMI 1640 i pozostaw na stole do czterech godzin lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc.

Podczas inkubacji biopsji oznacz rurkę dysocjacyjną z niebieską nakrętką i dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej. Następnie za pomocą sterylnych narzędzi umieść biopsję w pierwszej studzience, aby ją wypłukać. Przenieś tkankę do drugiego dołka, spłucz, a następnie powtórz proces jeszcze raz w trzecim dołku.

Przenieść dobrze opłukaną biopsję skóry na sterylną szalkę Petriego i odpipetować 100 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej na wierzch próbki. Następnie użyj jednorazowego sterylnego skalpela ze stali nierdzewnej, aby ostrożnie zeskrobać podskórną tkankę tłuszczową. Na świeżej, sterylnej szalce Petriego pokrój każdą biopsję skóry na cztery mniejsze kawałki.

Następnie przenieść próbki do przygotowanej probówki dysocjacyjnej zawierającej pięć mililitrów kompletnego podłoża. Szczelnie zakryj rurkę i przymocuj do góry nogami do tulei automatycznego dysocjatora tkanek. Upewnij się, że cały materiał próbki znajduje się w obszarze wirnika.

Następnie rozpocznij proces dysocjacji, uruchamiając program M śledziona zero jeden. Aby dysocjować biopsję z odpowiednią prędkością obrotową przez 56 sekund. Po przetworzeniu odłącz rurkę dysocjacyjną od dysocjatora i upewnij się, że cały zdysocjowany materiał został zebrany na dnie probówki.

Dodać 150 mikrolitrów kolagenu A do probówki dysocjacyjnej i inkubować próbkę w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów DNazy do probówki dysocjacyjnej i dobrze wymieszaj. Podłącz rurkę dysocjacyjną do tulei automatycznego dysocjatora tkanek i uruchom program M śledziona zero jeden, aby jeszcze raz zdysocjować biopsję.

Następnie umieść 70-mikromolowe nylonowe sitko komórkowe na wierzchu 50-mililitrowej probówki Falcon i nałóż zdysocjowane próbki na sitko komórkowe, aby usunąć grudki komórek i resztki tkanek. Użyj pięciu mililitrów kompletnego podłoża, aby raz umyć sitko do komórek. Następnie odwirować filtrat w temperaturze 450 g i 20 stopni Celsjusza, plus minus dwa stopnie przez 10 minut przed zasysaniem supernatantu.

Po powtórzeniu etapu mycia jeszcze raz, użyj 300 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić palety komórek. Zawiesiny pojedynczych komórek są teraz gotowe do dalszej analizy. Aby przeprowadzić barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, użyj PMA, jonomyzyny i brefeldyny A do stymulacji komórek i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla przez cztery godziny przed wykonaniem analizy cytometrii przepływowej.

Aby przeprowadzić poliklonalną aktywację limfocytów T rezydujących w skórze, należy podać 100 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki do 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie. Dodaj mikrokulki pokryte przeciwciałem anty-CD3, anty-CD28, rekombinowaną cytokinę ludzką, IL-2 i IL-1B. Dobrze oznaczoną pokrywką przykryj płytkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent dwutlenku węgla i 100% wilgotności.

Następnie, gdy kolor podłoża zmieni kolor na żółty, zmień go. Wyraźną kolonię komórkową można zaobserwować w ósmym dniu hodowli komórkowej. Aby przeprowadzić analizę FACS, przenieś interesujące komórki do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.

Wirować w temperaturze 450 g i 20 stopni Celsjusza, plus minus dwa stopnie przez dwie minuty. Następnie odessać supernatant. Użyj 100 mikrolitrów przygotowanej fluorescencji 780 o sprzężonej utrwalanej żywotności do barwienia w celu barwienia komórek przez inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu FACS i odwiruj przed zasysaniem supernatantu. Następnie, po wybraniu przeciwciał monoklonalnych markera powierzchniowego komórki z listy zamieszczonej w protokole tekstowym, należy użyć bufora FACS do przygotowania roztworów przeciwciał. Użyj kontroli izotopowej przeciwciał wraz z niebarwioną próbką, aby zdefiniować ustawienia bramki.

Teraz dodaj 25 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał myszy do każdej studzienki i chroń przed światłem. Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj 100 mikrolitrów buforu FACS, odwiruj i odessaj supernatant.

Za pomocą przygotowanych do barwienia foxp3 zgodnie z protokołem tekstowym należy dodać 100 mikrolitrów buforu utrwalającego i przepuszczalnego w celu ponownego zawieszenia palet. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu przepuszczalnego do każdej studzienki i odwiruj przed zasysaniem supernatantu.

Po ponownym umyciu komórek i wybraniu odpowiednich przeciwciał, dodaj 20 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał monoklonalnych do każdej studzienki i chroń przed światłem przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Używając buforu przepuszczalnego, umyj komórki jeszcze raz. Następnie użyj 110 mikrolitrów buforu FACS, aby ponownie zawiesić palety i przenieść zawiesiny komórek do probówek mico FACS.

Na koniec, jeśli wymagana jest dokładna liczba komórek, w 10 mikrolitrach dobrze wymieszanej jednolitej zawiesiny flurosfer do każdej próbki bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów FACS. Jak pokazano tutaj, różne typy leukocytów CD45 dodatnich zidentyfikowano w zawiesinach jednokomórkowych pochodzących ze skóry zdrowych osób. W tym limfocyty T CD4-dodatnie, limfocyty T CD8-dodatnie i komórki dendrytyczne CD11c dodatnie.

Natomiast zaobserwowano niewiele limfocytów B, komórek NK lub mikrofagów. Ponadto metodologia pozwala na analizę CD4 dodatnich CD25 dodatnich komórek foxp3 w biopsjach ludzkiej skóry. Na przykład, stosując barwienie wewnątrzkomórkowe po utrwaleniu i przepuszczalności, można wykazać ekspresję czynnika transkrypcyjnego foxp3 w limfocytach T CD25-dodatnich.

Jak wykazano tutaj, aby uniknąć autofluorescencji tła i uniknąć populacji komórek autofluorescencyjnych, do bramkowania populacji limfocytów zaleca się przeciwciało myszy anty-ludzkie CD45 sprzężone z genialnym, gwałtownym fluorochromem 421. Rysunek ten ilustruje, że większość komórek rezydujących w ludzkiej skórze to limfocyty T CD3-dodatnie. Do analizy żywotności komórek zaleca się utrwalany barwnik żywotności w celu odróżnienia komórek żywotnych od martwych lub umierających.

W celu dalszej analizy funkcjonalnej, przy użyciu pojedynczej, czteromilimetrowej biopsji skóry zmienionej chorobowo od pacjentów z łuszczycą, wykazano, że limfocyty T pochodzące z biopsji wytwarzały IL-17a i inteferon gamma. Po czterogodzinnej stymulacji jonomycyną PMA w obecności brefeldyny A. Wreszcie, rysunek ten pokazuje, że limfocyty T od osób z łuszczycą mają znacznie większą zdolność do wytwarzania cytokin związanych z łuszczycą IL-17a i interferonu gamma. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi i środkami laboratoryjnymi może być niebezpieczna.

Zawsze bierz pod uwagę środki bezpieczeństwa.