Name: Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania naczyń krwionośnych z komórek PiPSC i przeszczepiania ich w modelu mysim. Protokół obejmuje dekompozycję aorty, nasiewanie komórek w bioreaktorze oraz ocenę funkcjonalności przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez The British Heart Foundation i The Oak Foundation.

Przeprowadzać wszystkie doświadczenia na zwierzętach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną dla ludzkiej linii komórkowej fibroblastów CCL-153: Pożywka F-12K, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) oraz 100 U/ml penicyliny i streptomycyny.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do przeprogramowania do generowania PiPSC: zmodyfikowana pożywka orła Knockout Dulbecco (DMEM) zawierająca 20% zamiennik surowicy nokautującej, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (bFGF-2) oraz 100 U / ml penicyliny i streptomycyny. Dodawaj bFGF-2 na świeżo za każdym razem przed użyciem podłoża.</li>
	<li>Wytwarzaj pożywki różnicujące (DM) w celu indukcji różnicowania komórek mięśni gładkich (SMC): pożywki α-MEM zawierające 10% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 100 U / ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu (PDGF-ββ).</li>
	<li>Wykonaj pożywkę różnicującą śródbłonek (EC-DM) w celu wywołania różnicowania komórek śródbłonka (EC): pożywki wzrostu śródbłonka-2 (EGM-2) zawierające 50 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz 100 U / ml penicyliny i streptomycyny.</li>
</ol>
2. Przeprogramowanie ludzkich fibroblastów na częściowo indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (PiPSC)
<ol>
	<li>Hodowla ludzkiej linii komórkowej fibroblastów CCL-153 na 0,04% kolbach pokrytych roztworem żelatyny w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Pasaż komórek co 3 dni w stosunku 1:6. Użyj komórek przed pasażem 9, aby uzyskać optymalną wydajność wytwarzania PiPSC. Komórki są gotowe do transfekcji po osiągnięciu 80 - 90% konfluencji.</li>
	<li>Linearyzuje policistroniczny plazmid pCAG2LMKOSimO zawierający 4 czynniki przeprogramowujące: czynnik transkrypcyjny wiążący oktamery 4 (OCT4), SOX2, czynnik podobny do Kruppela 4 (KLF4) i C-MYC (pCAG-OSKM). Trawić 5 μg plazmidu za pomocą 5 jednostek enzymu restrykcyjnego PvuI przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Oczyść plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Transfekcja 2 x 106 ludzkich fibroblastów za pomocą 4 μg zlinearyzowanego plazmidu pCAG-OSKM za pomocą elektroporacji za pomocą zestawu do nukleofekcji ludzkiego fibroblastu skórnego (NHDF) zgodnie z protokołem producenta. Delikatnie wysiewać transfekowane komórki na wstępnie pokrytej żelatyną kolbie T25 o sile 0,04% zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża do przeprogramowywania.</li>
	<li>Po 24 godzinach zmień pożywkę na suplementy 25 μg/ml neomycyny, aby wybrać czystą populację transfekowanych komórek.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień do 4, 
	Uwaga: Ludzkie fibroblasty stają się PiPSC po 4 dniach przeprogramowania.</li>
</ol>
3. Różnicowanie PiPSC na komórki śródbłonka i mięśni gładkich
<ol>
	<li>Nasiona PiPSC na wstępnie powlekanych naczyniach kolagenowych zawierających DM przez 4 dni w celu wywołania różnicowania w SMC. Zmieniaj podłoże co drugi dzień aż do 4 dnia.</li>
	<li>Nasiona PiPSC na wstępnie powlekanych naczyniach kolagenowych zawierających śródbłonek-DM przez 6 dni w celu wywołania różnicowania w komórki śródbłonka. Zmieniaj podłoże co drugi dzień aż do 6 dnia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie przeszczepu aorty bez komórek
Uwaga: Wszystkie roztwory i sprzęt powinny być sterylne.
<ol>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy i unieruchamiaj mysz w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przeciąć mostek i okolice klatki piersiowej, aby otworzyć klatkę piersiową. Usuń serce, płuca i przełyk, aby odsłonić aortę. Delikatnie usuń tłuszcz wokół aorty za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Odetnij aortę od przedniego końca nożyczkami i delikatnie przytrzymaj koniec kleszczami. Odłącz aortę od kolumny kręgosłupa z tyłu przez rozwarstwienie. Ostrożnie zamknij wszystkie rozgałęziające się tętnice od aorty poprzez podwiązanie bipolarnym elektrokoagulatorem i przecięcie nożyczkami od drugiego końca podwiązania.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przepłukać światło aorty 3 ml roztworu soli fizjologicznej zawierającego 100 j. heparyny, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi.</li>
	<li>Przetnij tylny koniec aorty, zanim rozgałęzi się do nerki. Zachowanie integralności aorty jest bardzo ważne podczas całego zabiegu.</li>
	<li>Przepłukać światło aorty 5 ml 0,075% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Namocz aortę piersiową w 0,075% roztworze SDS na 10 cm szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 2 godziny przy 150 obr./min przy natężeniu obrotów.</li>
	<li>Przepłukać światło aorty 5 ml PBS.</li>
	<li>Namocz aortę w PBS na 10 cm szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 2 godziny przy 150 obr./min przy RT. Odświeżaj PBS co 20 minut.</li>
	<li>Przepłukać światło aorty 5 ml PBS.</li>
	<li>Pozbawiony komórek przeszczep aorty należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
</ol>
5. Podwójne rozsiewanie PiPSC i kondycjonowanie bioreaktora
Uwaga: Wszystkie roztwory i sprzęt powinny być sterylne. Wszystkie operacje należy wykonywać w kapturze do hodowli tkankowych.
<ol>
	<li>Zmontuj obwód przepływu bioreaktora, jak pokazano na rysunku 1. Podłączyć komorę inkubacyjną, zbiornik mediów, pompę perystaltyczną i komorę zgodności za pomocą przewodów. Minimalna objętość podłoża potrzebna do krążenia wynosi 40 ml.</li>
	<li>Wstępnie kondycjonuj naczynie pozbawione komórek pożywką hodowlaną, mocząc aortę w pożywce DM na 10-centymetrowej szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 1 godzinę przy 50 obr./min przy natężeniu prądu.</li>
	<li>Włóż nylonowe rurki o długości 1 cm (średnica zewnętrzna 0,9 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm) do obu końców naczynia bezkomórkowego pod mikroskopem. Zwiąż naczynie i rurki za pomocą 8-0 szwy jedwabne.</li>
	<li>Zamontuj zdecelularyzowany przeszczep aorty w komorze inkubacyjnej, łącząc rurki nylonowe z portami wlotowymi i wylotowymi (rurka 1/32") ze ściany komory. Utrzymywać komorę inkubacyjną z 5 ml pożywki za każdym razem.</li>
	<li>Trypsynizuj PiPSC, dodając wstępnie podgrzaną trypsynę, aby przykryć naczynie hodowlane i delikatnie kołysz naczynie 10 razy. Wyrzuć trypsynę i pozostaw naczynie w inkubatorze na 2 - 3 minuty. Dodaj podgrzaną pożywkę hodowlaną do naczynia i wymieszaj pożywkę z komórkami.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować dwie porcje zawiesin komórkowych zawierających 5 x10 po 5 komórek każda przez 5 minut przy 300 x g. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Po całkowitym odessaniu supernatantu ponownie zawiesić 1 osad z granulek komórek PiPS w 50 μl s.m. Wstrzyknąć tę zawiesinę komórek do światła naczynia pozbawionego komórek.</li>
	<li>Następnie ponownie zawiesić drugą osadkę komórek PiPS w 100 μl Matrigel. Ostrożnie pipetować mieszaninę na bezkomórkowy przeszczep aorty.</li>
	<li>Odczekaj 10 - 15 minut, aż mieszanina zmieni się w stan żelowy i równomiernie owinie się wokół zewnętrznej powierzchni naczynia. Napełnij komorę inkubacyjną DM.</li>
	<li>Umieścić całe ustawienie bioreaktora w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Ręcznie obracać przeszczep pozbawiony komórek o 90° wokół osi podłużnej co pół godziny w ciągu pierwszych 2 godzin.</li>
	<li>Utrzymuj hodowlę statyczną przez 12 godzin, aby umożliwić adhezję komórek.</li>
	<li>Dostarczaj DM przez światło przez pompę perystaltyczną, aby indukować różnicowanie komórek mięśni gładkich. Rozpocznij początkowe natężenie przepływu od 5 ml/min i stopniowo zwiększaj do 20 ml/min w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>Utrzymuj natężenie przepływu czynnika krążącego na poziomie 20 ml/min przez 24 godziny.</li>
	<li>Zatrzymaj przepływ medium i wyjmij ustawienie bioreaktora z inkubatora.</li>
	<li>Ponownie zasiej światło przeszczepu za pomocą PiPSC. Trypsynizować, liczyć i odwirować 1 x 106 PiPSC, jak w krokach 5.5 - 5.6. Zawiesić komórki w 50 μl pożywki EGM-2 zawierającej 50 ng/ml VEGF. Wstrzyknąć mieszaninę komórek do światła przeszczepu.</li>
	<li>Zmienić pożywkę w komorze inkubacyjnej i całym krążeniu na pożywkę EGM-2 zawierającą 50 ng/ml VEGF w celu wywołania różnicowania śródbłonka.</li>
	<li>Przenieś ustawienie bioreaktora z powrotem do inkubatora. Ręcznie obracaj przeszczep o 90° co 30 minut przez pierwsze 2 godziny, a następnie utrzymuj posiew statyczny przez 12 godzin.</li>
	<li>Rozpocznij przepływ w obiegu od 5 ml/min i stopniowo zwiększaj do 35 ml/min. Utrzymuj przepływ na poziomie 35 ml/min przez 5 dni. Zmieniaj pożywkę krążącą i komorową co drugi dzień.</li>
	<li>Zbierz zmodyfikowany przeszczep do dalszego szczepienia myszy.</li>
</ol>
6. Szczepienie podwójnie nasiennego szczepu PiPSC myszom
<ol>
	<li>Użyj NOD. Samce myszy CB17-Prkdcscid/NcrCrl jako biorcy przeszczepu naczyniowego. Zawsze upewnij się, że myszy mają około 10 tygodni, ważą około 25 - 35 g i są w dobrym stanie zdrowotnym.</li>
	<li>Znieczulić mysz biorcy, podając kombinację Hypnorm (25 mg/kg) i Hypnovel (25 mg/kg) dootrzewnowo. Nałóż maść okulistyczną wazeliny na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Potwierdź skuteczne znieczulenie, upewniając się, że myszy mają rozluźnione mięśnie i oddychają równomiernie.
	<ol>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach z ogoloną i wyprostowaną szyją. Podawać siarczan atropiny (1,7 mg/kg) w połączeniu ze środkami znieczulającymi, aby zapewnić, że drogi oddechowe myszy pozostaną czyste.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj nacięcie w linii środkowej od żuchwy do mostka myszy. Pod mikroskopem preparacyjnym z 5- do 10-krotnym wzmocnieniem unieś prawe gruczoły ślinowe na boki i usuń prawy mięsień obojczykowy, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną.</li>
	<li>Delikatnie usuń przyczepione tkanki, aby zmobilizować prawą tętnicę szyjną wspólną od dystalnego końca w kierunku bliższego końca. Podwiązaj środkową część tętnicy szyjnej wspólnej dwukrotnie za pomocą 8-0 Jedwab zszyj i rozkrój między dwoma krawatami.</li>
	<li>Przełóż przez mankiet wykonany z autoklawowalnej nylonowej rurki na każdym końcu naczynia i przymocuj każdy koniec za pomocą zacisków do mikrohemostatu.</li>
	<li>Zdejmij opaskę szwową z jednego końca i nałóż kroplę heparyny (100 j./ml). Natychmiast po tym odwróć dystalny koniec tętnicy, aby pokryć cały korpus mankietu i umocuj odwrócone naczynie za pomocą 8-0 jedwabny szew do mankietu.
	<ol>
		<li>Powtórz tę samą procedurę dla drugiej części tętnicy. Przepłucz tętnicę roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć skrzepy krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszczepić przeszczep naczynia pozbawionego komórek między dwoma końcami tętnicy szyjnej, przesuwając pozbawione komórek końce naczynia nad mankietami tętnic i mocując je za pomocą 8-0 szwy jedwabne. Usuń zaciski naczyniowe z obu końców przed oceną pulsacji przeszczepu.</li>
	<li>Ustaw prawy gruczoł ślinowy z powrotem w jego pierwotnej pozycji. Zamknij skórę w miejscu chirurgicznym za pomocą przerwanego szwu za pomocą szwu poliglaktynowego 6-0.</li>
	<li>Konsekwentnie obserwuj parametry życiowe myszy po zakończeniu zabiegu, aż do odzyskania przytomności. Uśmierc myszy biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy i przeszczepy naczyń do pobrania 24 godziny lub 3 tygodnie później w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Obecny protokół wskazuje na solidną, szybką, prostą, wydajną i powtarzalną strategię, w której funkcjonalne naczynia inżynierii tkankowej mogą być generowane przy użyciu PiPSC z ludzkich fibroblastów. Technika ta stanowi cenne narzędzie dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i potencjalnie specyficznej dla pacjenta terapii komórkowej w najbliższej przyszłości. Kluczowe kroki w celu zapewnienia skuteczności protokołu obejmują przygotowanie PiPSC, przygotowanie sterylnych i w pełni pozbawionych komórek przeszcze...

Budowa kanałów naczyniowych jest podstawową strategią chirurgicznej naprawy uszkodzonych i uszkodzonych naczyń krwionośnych wynikających z chorób sercowo-naczyniowych. Do tej pory materiały do przeszczepów stosowane w chirurgii obejmują biokompatybilne polimery syntetyczne (politetrafluoroetylen [teflon], spieniony politetrafluoroetylen [ePTFE; Gore-Tex] lub politereftalan etylenu [Dacron]), przeszczepy allogeniczne, tkanka autologiczna (osierdzie lub żyła odpiszczelowa) i ksenoprzeszczepy1. Chociaż najczęściej stosowane są sztuczne przeszczepy (np. Gore-Tex i Dacron), materiały te prawdopodobnie powodują liczne krótko- i długoterminowe powikłania, w tym zwężenie, odkładanie się wapnia, zakrzepliwą embolizację i infekcje. Chociaż u pacjentów z przeszczepami biologicznymi obserwuje się zmniejszone zdarzenia zakrzepowo-zatorowe, nadal napotykają ograniczenia, takie jak wtórne niepowodzenie przeszczepu i skrócona trwałość z powodu degradacji zwapnienia2. Dlatego, pomimo znacznego postępu w technikach chirurgicznych na przestrzeni lat, badacze i klinicyści nadal są obciążeni potrzebą zidentyfikowania idealnego przewodu dla chorób naczyniowych. Niedawno w dziedzinie inżynierii tkanki naczyniowej opracowano koncepcję, w której komórki są włączane do biodegradowalnych rusztowań, w celu stworzenia środowiska biomimetycznego, które uosabia funkcjonalne naczynie do udanego szczepienia1. Zasadniczo, sukces konstruktów naczyniowych zależy od trzech podstawowych elementów; Komórki, które składają się na rusztowanie, tj. wewnętrzną warstwę komórek śródbłonka i warstwę komórek mięśni gładkich, rusztowanie zawierające odpowiednią macierz zewnątrzkomórkową zapewniającą właściwości mechaniczne porównywalne z natywnym unaczynieniem oraz sygnalizację molekularną/komórkową, która jest wymagana do zainicjowania/regulacji naprawy.
Długoterminowa drożność przeszczepów i trwały rozwój tkanek nowotworowych są wysoce zależne od skutecznego zasiewania komórek na rusztowaniach, co sprawia, że decyzja o typie komórki ma kluczowe znaczenie. Kilka doniesień wskazuje na wykorzystanie dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich z różnych źródeł do opracowania przewodów o małej średnicy3-6. Choć obiecująca, brak wystarczającej ilości naczyń autologicznych do uzyskania dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich pozostaje znacznym obciążeniem. Ostatnio komórki macierzyste z różnych źródeł zostały wykorzystane do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych. Rzeczywiście, różne typy komórek macierzystych, w tym embrionalne komórki macierzyste7, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)8,9, PiPSC10,11, komórki jednojądrzaste pochodzące ze szpiku kostnego12, mezenchymalne komórki macierzyste13, komórki progenitorowe śródbłonka i antygen komórek macierzystych pochodzących ze ściany naczynia dorosłego-1 (Sca-1) + komórki macierzyste/progenitorowe14,15 wykazano, że wszystkie są zdolne do różnicowania się w funkcjonalne komórki śródbłonka lub mięśni gładkich w odpowiedzi na określone pożywki i warunki hodowli. Co więcej, nieograniczona zdolność komórek macierzystych do samoodnawiania się czyni je lepszymi kandydatami, w przeciwieństwie do dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich, które mogą dzielić się tylko skończoną liczbę razy, zanim ulegną zatrzymaniu wzrostu i starzeniu się.
Wybór materiału na rusztowanie do wytworzenia udanego naczynia do szczepienia zależy od kilku czynników, takich jak biokompatybilność, właściwości biomechaniczne i szybkość biodegradacji. Zasadniczo materiały używane do tworzenia rusztowań dla przeszczepów powinny być biodegradowalne i nie będą generować niepotrzebnych odpowiedzi immunologicznych biorcy. Dodatkowo musi obejmować odpowiednią porowatość i mikrostrukturę do przyczepiania komórek i późniejszego przetrwania. Do tej pory najczęstszymi materiałami stosowanymi do rusztowań w inżynierii tkanek naczyniowych są polimery kwasu poliglikolowego, kwasu polimlekowego i poli ε-kaprolaktonu16. Ostatnio z pewnym powodzeniem zastosowano również bezkomórkowe materiały biologiczne. Kilka laboratoriów wykazało, że wysiewanie bezkomórkowych naczyń ludzkich, kłów lub świń komórkami autologicznymi zapewniło przeszczep biologiczny, który był odporny na krzepnięcie i przerost błony wewnętrznej17-19. Inne strategie w inżynierii tkanki naczyniowej obejmują przeszczepy naczyniowe oparte na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, np. Wysiewanie komórek w żelu fibrynowym13 i generowanie arkuszy komórkowych bez podparcia rusztowania20, 21.
Obecny protokół demonstruje różnicowanie ludzkich PiPSC na funkcjonalne komórki śródbłonka i mięśni gładkich, generowanie bioreaktora składającego się z bezkomórkowego rusztowania naczyniowego do przechowywania funkcjonalnych komórek naczyniowych pochodzących z PiPSC, oraz szczepienie naczyń inżynierii tkankowej myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID). PiPSC są optymalnym typem komórek do wykorzystania w inżynierii tkankowej przeszczepów naczyń, ponieważ komórki te nie tworzą guzów u myszy ani nie wywołują odpowiedzi etycznych i alloimmunologicznych. Ponadto wykazaliśmy, że strategia generowania komórek śródbłonka PiPS i komórek mięśni gładkich PiPS jest wydajna i powtarzalna10,11. Następnie zaprojektowaliśmy bezkomórkowe naczynie do wysiewu komórek naczyniowych pochodzących z PiPSC, aby ściśle naśladować białka macierzy istniejące w natywnym naczyniu, zwiększając w ten sposób skuteczność szczepienia i przeżycia. Ponadto decelularyzacja naczyń krwionośnych przed wysiewem PiPSC zapobiega występowaniu reakcji zapalnych wywoływanych przez typy komórek odpornościowych, takie jak makrofagi. Co ważniejsze, protokół ten nie tylko stanowi metodologię generowania obiecujących kanałów naczyniowych do translacji na ludzi, ale także dostarcza cennych środków do badania i zrozumienia mechanizmów molekularnych, które rządzą regeneracją tkanki naczyniowej za pomocą modeli mysich.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie fibroblasty CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatalne ludzkie fibroblasty embrionalne</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Pożywka (modyfikacja Kaighna pożywki F-12 Hama)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Knockout DMEM zoptymalizowana pod kątem embrionalnych komórek macierzystych</td><td>Technologie życia (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Technologie zastępowania żywotności w surowicy nokautującej</td><td>(Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM medium</td><td>Technologie życia (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki PDGF</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny 2%</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Enzym restrykcyjny PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Nucelofekcji (zestaw NHDF)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, oświetlenie do mikroskopii stereoskopowej</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Oświetlenie światłem zimnym do mikroskopii stereoskopowej</td></tr><tr><td>Mikroskop sterograficzny Nikon Zoom SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór podstawowy SDS Odczynnik do biologii molekularnej</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10 mg / ml)</td> <td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka IKA Vibrax z platformą wibracyjną VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cyfrowy napęd pompy</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-kanałowa, 6-rolkowa głowica pompy z wkładem</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S duże wkłady do głowicy pompy</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa Masterflex utwardzana platyną, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Rurka przechodzi przez pompę perystaltyczną</td></tr><tr><td>0,5 mm ID, 0,8 mm OD Rurki silikonowe</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Rurki łączą komorę inkubacyjną, zbiornik mediów i komorę zgodności&nbsp;</td></tr><tr><td>Reduktor mocujący 0,5 do 1,6, naturalny polipropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter łączy powyżej dwa typy</td></tr><tr><td>wężyków Rurka 1/32", ID 0,01" (250&micro; m) Materiał: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Rurka przez ścianę komory inkubacyjnej, która łączy przeszczep z rurką zewnętrzną</td></tr><tr><td>Złączki jednoczęściowe&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Zamocuj powyższe rurki przez ściankę komory inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Rurki nylonowe (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp;</td><td>Rurki Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>wkładane są do dwóch końców przeszczepu aorty</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl mysz</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, 8-0&nbsp; jedwab</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgezik do stosowania u myszy</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Indukcja znieczulenia</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Rurka nylonowa Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>o średnicy 0,65 mm i długości 1 mm; do wykonania mankietu tętniczego</td></tr><tr><td>Elektrokoagulator</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Podwiązanie gałęzi tętnic na aorcie</td></tr><tr><td>Bipolarne kleszcze mikrohemostatowe</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Mocowanie końców naczyń</td></tr><tr><td>Rozszerzacz naczynia</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzacz naczynia</td><td>S& T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzacz naczynia</td><td>S& T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini aplikator&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Mikro klipsy hemostatyczne</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, 6-0</td><td>VICRYL ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Budowa przewodów naczyniowych jest podstawową strategią chirurgicznej naprawy uszkodzonych i uszkodzonych naczyń krwionośnych wynikających z chorób sercowo-naczyniowych. Obecny protokół przedstawia skuteczną i powtarzalną strategię, w której funkcjonalne przeszczepy naczyń krwionośnych inżynierii tkankowej mogą być generowane przy użyciu częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) z ludzkich fibroblastów. Zaprojektowaliśmy bezkomórkowy bioreaktor rusztowania naczyń krwionośnych, który ściśle naśladuje strukturę białka macierzy i przepływ krwi, który istnieje w natywnym naczyniu, do wysiewu komórek śródbłonka PiPSC lub komórek mięśni gładkich przed wszczepieniem myszom. Wykazano, że podejście to jest korzystne, ponieważ myszy z niedoborem odporności, którym wszczepiono przeszczepy pochodzące z PiPSC, wykazywały znacznie zwiększony wskaźnik przeżycia 3 tygodnie po operacji. Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i potencjalnie specyficznej dla pacjenta terapii komórkowej w najbliższej przyszłości.

Pomyślną generację PiPSC potwierdzono 4 dni po nukleofekcji fibroblastów ludzkich zlinearyzowanym plazmidem pCAG2LMKOSimO niosącym 4 czynniki transkrypcyjne: OCT4, SOX2, KLF4 oraz c-MYC (OSKM). PiPSC wykazywały wyraźnie odmienny fenotyp w porównaniu z fibroblastami (Ryc. 2A) i wykazywały ekspresję 4 czynników przeprogramowania na poziomie mRNA (Ryc. 2B) oraz białka (Ryc. 2C)10. Skuteczność przeszczepu naczyniowego opartego na PiPSC w wysokim stopniu zależy od ...

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie funkcjonalnych inżynieryjnie tkanek naczyń krwionośnych przeznaczonych do przeszczepienia myszom. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów in vitro w częściowo indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, które wykazują zdolność do różnicowania się w komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich. Następnie od pobitej myszy wycina się aortę, którą poddaje się decelularyzacji za pomocą roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu przygotowania decelularyzowanych graftów aorty.Następnie przygotowuje się obwód przepływowy bioreaktora do podwójnego zasiewu częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ostatnim krokiem jest przeszczepienie graftu z podwójnie zasianymi, częściowo indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi do myszy. Ostatecznie analiza wskaźników śmiertelności myszy trzy tygodnie po przeszczepieniu służy do wykazania funkcjonalności inżynieryjnie wytworzonych graftów naczyniowych.Zastosowania tej techniki obejmują terapię chorób układu sercowo-naczyniowego, ponieważ wykazano, że pozwala ona na skuteczne generowanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych z wykorzystaniem komórek PIPS w krótkim czasie. W ujęciu ogólnym bardzo ważne jest zachowanie nienaruszonego stanu i sterylności przeszczepu naczyniowego podczas całej procedury, szczególnie w przypadku osób rozpoczynających pracę z tą metodą. Procedurę należy rozpocząć od przeprogramowania ludzkich fibroblastów w częściowo indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki PIPS) poprzez transfekcję komórek czterema mikrogramami zlinearyzowanego plazmidu OSKM przy użyciu zestawu do transfekcji jądrowej ludzkich fibroblastów skóry.Ludzkie fibroblasty przekształcają się w komórki PIPS po czterech dniach przeprogramowania. Po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie karku, umieść mysz w pozycji grzbietowej pod mikroskopem sekcyjnym.Następnie należy przeciąć mostek oraz obszar wokół klatki piersiowej, aby otworzyć jamę klatki piersiowej. Usuwa się serce, płuca i przełyk, aby odsłonić aortę, a następnie ostrożnie usuwa się tłuszcz okołaortyczny za pomocą pęsety. Aortę należy przeciąć w przednim odcinku nożyczkami, a koniec delikatnie przytrzymać pęsetą tępą.Następnie oddziel aortę od kręgosłupa za pomocą tępej dyssekcji. Ostrożnie zamknij wszystkie tętnice odchodzące od aorty poprzez ligację z użyciem koagulatora bipolarnego i przecięcie końców ligatur nożyczkami. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby przepłukać światło aorty 3 ml roztworu soli fizjologicznej zawierającego 100 jednostek heparyny.Aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi, przetnij tylny koniec aorty przed jej rozgałęzieniem w tętnice nerkowe. Utrzymanie ciągłości aorty jest bardzo ważne podczas całej procedury. Następnie przepłucz światło aorty pięcioma mililitrami 0.075.Aortę szczura namaczano w 0,075% roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS) przygotowanym w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), w 10-centymetrowej płytce Petriego, na wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny przy 150 obr./min w temperaturze pokojowej. Następnie światło aorty przemyto 5 ml PBS. Kolejno aortę namaczano w PBS w 10-centymetrowej płytce Petriego, którą umieszczono na wytrząsarce orbitalnej przy 150 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Odświeżanie PBS co 20 minut po upływie dwóch godzin. Przepłucz światło aorty pięcioma mililitrami PBS. Na początek złóż obwód przepływowy bioreaktora zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie należy poddać rekondycjonowaniu odkomórkowane naczynie w pożywce hodowlanej, namaczając aortę w pożywce różnicującej w 10 centymetrowej płytce Petriego na wytrząsarce orbitalnej przez jedną godzinę przy 50 RPM w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem należy wprowadzić nylonowe rurki o długości jednego centymetra do obu końców odkomórkowanego naczynia. Następnie naczynie i rurki należy związać szewami jedwabnymi o rozmiarze 8-0.Zmontuj przeszczep z decelularyzowanej aorty w komorze inkubacyjnej, łącząc rurki nylonowe z portami wlotowym i wylotowym w ściance komory. Utrzymuj w komorze inkubacyjnej pięć mililitrów medium. Następnie poddaj komórki PIPS trypsynizacji, dodając uprzednio podgrzany trypsyn.Przykryć naczynie hodowlane i delikatnie potrząsnąć nim 10 razy. Odrzucić pipety i pozostawić naczynie w inkubatorze przez dwie do trzech minut. Następnie dodać do naczynia podgrzaną pożywkę hodowlaną i wymieszać ją z komórkami.Następnie należy policzyć komórki, używając komory countingowej (hemo-cytometru). Dwie alikwoty zawiesiny komórkowej, zawierające każda pół miliona komórek, odwiruj przez pięć minut przy 300 ×g. Po odwirowaniu całkowicie resuspenduj jeden pellet komórek PIPS. W 50 µL medium dm wstrzyknij zawiesinę komórkową do światła zdekularyzowanego naczynia.Następnie resuspenduj pozostały pellet komórek PIPS w 100 µL matrigelu. Ostrożnie nanieś mieszaninę pipetą na zdekularyzowany graft aorty. Odczekaj od 10 do 15 minut, aż mieszanina przejdzie w stan żelu i równomiernie pokryje zewnętrzną powierzchnię naczynia.W tym momencie należy zbudować komorę inkubacyjną za pomocą dm. Cały układ bioreaktora należy umieścić w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius. Następnie rurkę łączącą rezerwuar z medium z komorą wyrównawczą należy założyć na pompę perystaltyczną.W inkubatorze. Przez pierwsze dwie godziny, po 12-godzinnym statycznym utrzymywaniu hodowli, ręcznie obracaj zdekularyzowany graft o 90 stopni wokół osi podłużnej co pół godziny, aby umożliwić dostarczanie pożywki DM przez światło naczynia za pomocą pompy perystaltycznej w celu indukowania różnicowania komórek mięśni gładkich. Ustaw początkową szybkość przepływu na 5 ml/min.Następnie, po utrzymaniu przepływu krążącego medium na poziomie 20 ml/min przez 24 godziny, zastosuj stopniowy wzrost przepływu o 20 ml/min w ciągu kolejnych 24 godzin, po czym zatrzymaj przepływ medium i wyjmij bioreaktor z inkubatora. Następnie zasiedl światło przeszczepu komórkami PIPS, wykonując odliczanie po trypsynizacji i wirowaniu, używając 1 miliona komórek PIPS. Podobnie jak poprzednio, resuspenderuj komórki w 50 µl medium do wzrostu śródbłonka.Dwa zawierające 50 nanogramów na mililitr czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Następnie wstrzyknij mieszaninę komórek do światła przeszczepu. Wymień medium w komorze inkubacyjnej i w całym obiegu na eGM two zawierające VEGF, aby indukować różnicowanie śródbłonka.Po przeniesieniu zestawu bioreaktora z powrotem do inkubatora, należy ręcznie obracać graft o 90 stopni co pół godziny przez pierwsze dwie godziny, a następnie utrzymać kulturę statyczną przez 12 godzin. Po 12 godzinach należy uruchomić przepływ krążący, zaczynając od 5 ml/min i stopniowo zwiększając go do 35 ml/min, a następnie utrzymać szybkość przepływu na poziomie 35 ml/min przez pięć dni. Następnie należy wyekstrahować zmodyfikowany graft, odcinając końce rurek nylonowych.Umieść szczep na płytce Petriego zawierającej świeże medium e GM two w ramach przygotowania do przeszczepienia myszy po uprzednim znieczuleniu zwierzęcia biorcy. Unieruchom mysz w pozycji na plecach, z ogoloną i wyprostowaną szyją. Wykonaj nacięcie w linii środkowej od żuchwy do mostka myszy, korzystając z mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od 5 do 10-krotnego.Odsuń gruczoły śliniowe w prawo i usuń prawy mięsień sutkowaty. Aby odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną, delikatnie usuń przylegające tkanki, mobilizując prawą tętnicę szyjną wspólną od końca dystalnego w kierunku końca proksymalnego. Podwiąż środkową część tętnicy szyjnej wspólnej dwukrotnie, używając nici jedwabnej 8/0, i przeprowadź preparację pomiędzy dwa wiązania. Przesuń mankiet wykonany z autoklawowalnej rurki nylonowej przez każde naczynie.Zakończ i zabezpiecz każdy koniec za pomocą mikro clampów naczyniowych. Następnie usuń szwy wiążące na jednym końcu i natychmiast po tym nanieś kroplę heparyny. Wywiń dystalny koniec tętnicy, aby pokryć cały korpus mankietu, a następnie przymocuj wywinięte naczynie do mankietu za pomocą nici jedwabnej o rozmiarze 8-0.Po powtórzeniu tej samej procedury na drugim odcinku tętnicy, przemyj tętnicę roztworem soli fizjologicznej w celu usunięcia skrzepów krwi. Następnie zaimplantuj odkomórkowiony graft naczyniowy pomiędzy dwa końce tętnicy szyjnej, nasuwając końce odkomórkowanego naczynia na mankiet tętnicy i mocując go szwami z jedwabiu o rozmiarze 8-0. Usuń zaciski naczyniowe z obu końców przed oceną pulsacji graftu, a następnie umieść prawy gruczoł ślinowy z powrotem w jego pierwotnej pozycji.Zamknąć skórę w miejscu operacyjnym za pomocą szwów przerywanych, używając nici prolactin o rozmiarze 6-0. Kontynuować opiekę pooperacyjną zgodnie z opisem w reprezentatywnym protokole tekstowym. Tutaj przedstawiono morfologię ludzkich fibroblastów po czterech dniach przeprogramowania do komórek PIPS.Komórki PIPS wykazywały wyraźnie odmienny fenotyp w porównaniu z fibroblastami. Zgodnie z oczekiwaniami, pełną decelularyzację aorty osiągnięto poprzez dwugodzinną obróbkę SDS. W rezultacie decelularyzowana aorta przybrała postać półprzezroczystego rusztowania acelularnego w porównaniu z aortą świeżo pobraną.Po podwójnym zasiewie komórek PIPS w odkomórkowanej aorcie, zaprojektowane przeszczepy naczyniowe wykazują właściwości komórek śródbłonka i mięśni gładkich, które różnią się od właściwości odkomórkowanych przeszczepów naczyń. Jest to tutaj zobrazowane za pomocą zielonego barwnika dla komórek śródbłonka i czerwonego barwnika dla komórek mięśni gładkich. Myszy, którym przeszczepiono naczynia z komórkami PIPS, wykazały przeżywalność na poziomie 60% trzy tygodnie po transplantacji, zgodnie z oczekiwaniami.Myszy z przeszczepionymi zdecelularyzowanymi naczyniami wykazywały znacznie wyższy wskaźnik śmiertelności już w pierwszym dniu po zabiegu. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie kardiologii drogę do zbadania wykorzystania komórek PIPS oraz zdecelularyzowanych przeszczepów naczyń w tworzeniu funkcjonalnych, inżynieryjnych tkankowo przewodów naczyniowych. Po obejrzeniu tego filmu mam nadzieję, że zdobędą Państwo pełną wiedzę na temat przygotowania zdecelularyzowanego przeszczepu naczynia, montażu bioreaktora oraz ponownego wszczepienia zrecelularyzowanego przeszczepu myszom.

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generyzacja i Przeszczepianie Tkankowych Naczyń Modelu Mysiego

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Opisujemy protokoły dla naszych modeli miażdżycy przeszczepów myszy (GA), które polegają na wprowadzeniu segmentu naczynia myszy do biorcy tego samego szczepu wsobnego. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, model może ocenić wpływ określonych genów na GA.

Modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Aby zbadać łączoną allotransplantację narządów litych i unaczynionych kompozytów, opisujemy nowy heterotopowy model przeszczepu en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i serca u myszy przy użyciu techniki mankietu szyjki macicy bez szwów.

Nowatorski model mikrochirurgiczny do heterotopowego, en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i przeszczepu serca u myszy

Prezentujemy model ortotopowego przeszczepu aorty przy użyciu techniki rękawowej u myszy. Jest to bardzo szybka metoda zespolenia, która może być stosowana w badaniach nad chorobami naczyniowymi.

Zastosowanie techniki rękawowej w mysim modelu przeszczepu aorty - film instruktażowy

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół heterotopowego przeszczepu aorty u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów w mysim modelu szyjki macicy. Model ten może być wykorzystany do badania patologii leżącej u podstaw przewlekłej waskulopatii przeszczepu allogenicznego (CAV) i może pomóc w ocenie nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.

Mysi model przeszczepu aorty szyjnej przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

W pracy przedstawiono model świni do oceny przeszczepów o małej średnicy w tętnicach udowych. Model naśladuje dynamikę naczyń krwionośnych człowieka i kompleksowo ocenia drożność przeszczepów, hemodynamikę i przebudowę naczyń. Stanowi cenną platformę do badania przeszczepów naczyniowych i monitorowania ich za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej i angiografii.

Implantacja przeszczepu naczyniowego kości udowej w modelu trzody chlewnej w celu przetestowania przeszczepów naczyniowych o małej średnicy

Poznaj metodę wytwarzania naczyń krwionośnych z komórek PiPSC i przeszczepiania ich w modelu mysim. Protokół obejmuje dekompozycję aorty, nasiewanie komórek w bioreaktorze oraz ocenę funkcjonalności przeszczepu.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów