Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie interakcji biofilmu z otaczającym środowiskiem przy użyciu zintegrowanych metod. Zbudowany jest system mikroprzepływowych komórek przepływowych z podwójnym wlotem, w którym pożywki zawierające glukozę i wolne od glukozy są pompowane przez komórkę przepływową, generując gradient glukozy. Do systemu dodaje się bakterie i pozwala się na rozwój biofilmów w ciągu kilku dni.

Biofilmy są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D w celu scharakteryzowania transportu substancji rozpuszczonej. W obrębie biofilmów znaczniki fluorescencyjne są wstrzykiwane do systemu przepływu i wykonuje się obrazowanie poklatkowe w celu scharakteryzowania pola przepływu wokół kolonii biofilmu, wstrzykuje się mikrogranulki fluorescencyjne i wykonuje się obrazowanie poklatkowe. Analiza transportu substancji rozpuszczonej i śledzenia cząstek uzyskanych danych pokazuje przydatność tej metody w ocenie procesów biofilmu w różnych środowiskach chemicznych w ramach jednego urządzenia i jednego zestawu eksperymentów.

Główną zaletą tych metod jest to, że pozwalają na jednoczesną ocenę wielu aspektów interakcji środowiskowych biofilmu. Przedstawione tu metody mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tworzenia się biofilmu w środowisku naturalnym lub infekcji związanych z biofilmem. Pracując w okapie z przepływem laminarnym, przenieś kolonię posa PAO, jeden koniec GFP, kolonię e coli DH pięć alfa z płytki LB do oddzielnych probówek zawierających trzy mililitry bulionu lb.

Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 225 obr./min. Ten system przepływu opiera się na komórce mikroprzepływowej z podwójnym wlotem, która ułatwia obserwację wzrostu biofilmu w dobrze zdefiniowanym gradiencie chemicznym utworzonym przez zmieszanie dwóch roztworów w komorze przepływowej. Podczas przepływu tworzy się płynny gradient stężenia w kierunku poprzecznym.

W wyniku dyfuzji profil stężeń jest stromy w pobliżu wlotu i bardziej zrelaksowany w dół rzeki. W dniu eksperymentu ostrożnie zmontuj system przepływu. Najpierw zaciśnij rurkę w pompie perystaltycznej, a następnie przymocuj jeden koniec rurki do średniej butelki zawierającej 900 mililitrów pożywki FAB z glukozą, a drugi koniec do pułapki bąbelkowej.

Powtórz ten proces, aby podłączyć drugą pożywkę zawierającą 900 mililitrów białka bez glukozy do drugiej pułapki bąbelkowej. Następnie włóż zawory trójdrogowe tuż przed wlotami do komory przepływowej i podłącz każdą z pułapek bąbelkowych do komory przepływowej. Na koniec podłącz wylot komory przepływowej do butelki na odpady.

Upewnij się, że komora przepływowa jest umieszczona stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu, aby umożliwić zawieszenie komórek na szkiełku nakrywkowym. Po zmontowaniu układu przepływu włącz pompę perystaltyczną z natężeniem przepływu 10 mililitrów na godzinę na każdy wlot, aby napełnić system Za pomocą pożywki do dwóch wlotów wprowadza się pożywkę z glukozą podawaną tylko w jednym wlocie. Następnie, pracując w kapturze, rozcieńczyć dwie kultury bakteryjne w stosunku jeden do jednego na jeden mililitr sterylnej wody o równoważnym OD 600 0,01 dla każdej bakterii, aby zaszczepić komórkę przepływową, użyj sterylnej plastikowej strzykawki, aby wstrzyknąć 500 mikrolitrów inokulum do każdego z wlotów komory przepływowej za pomocą zaworu trójdrogowego.

Po wstrzyknięciu należy zatrzymać pompę i pozwolić komórkom bakteryjnym przyczepić się do szkła nakrywkowego na godzinę po przyłączeniu komórek, ustawić pompę na 0,03 mililitra na minutę na każdy wlot i pozwolić systemowi płynąć przez trzy dni w temperaturze pokojowej, podczas których rozwija się biofilm pod gradientem ekspozycji na glukozę. Po upływie trzech dni. Użyj markera i linijki, aby narysować siatkę po szklanej stronie pokrywy komory przepływowej, przygotowując się do obrazowania.

Pomoże to w zlokalizowaniu regionów obrazowania, aby przeciwdziałać plamom podczas oglądania E. coli. Najpierw wyłącz światła, aby przyciemnić obszar roboczy, ponieważ plama z blatu jest wrażliwa na światło. Za pomocą strzykawki powoli wstrzyknąć jeden mililitr rozcieńczonego barwnika kwasu nukleinowego z rozcieńczoną fluorescencyjną krwią do zaworu trójdrogowego przed komorą przepływową.

Zatrzymaj przepływ. Utrzymuj komórkę przepływową w stagnacji w ciemności przez 30 minut. Po upływie 30 minut.

Wznów przepływ z prędkością 0,03 mililitra na minutę i zmyj niezwiązaną plamę przez 15 minut. Następnie zatrzymaj przepływ i obserwuj biofilmy za pomocą mikroskopii konfokalnej z obiektywem 63x. Znajdź pole widzenia zawierające dużą ilość biomasy z koloniami biofilmu, które są dobrze oddzielone, jak pokazano tutaj.

Następnie przechwyć stosy obrazów 3D w odpowiednich kanałach, aby zmapować przestrzenne wzorce rozwoju biofilmu w obrazie komórki przepływowej, biofilmy w trzech lub więcej odległościach podłużnych lub X wzdłuż wlotu komórki przepływowej oraz w trzech pozycjach poprzecznych lub Y względem narzuconego gradientu składników odżywczych. Aby scharakteryzować wzorce transportu solu w biofilmie, zacznij od komórki przepływowej. Po trzech dniach rozwoju biofilmu, znowu praca w ciemności.

Zatrzymaj pompę, aby wstrzymać przepływ, otwórz pułapki pęcherzykowe, aby uwolnić ciśnienie wtrysku. Następnie za pomocą strzykawki wstrzyknij jeden mililitr rozcieńczonego roztworu znacznika science-fi do jednego z zaworów trójdrogowych przed komorą przepływową. Po wstrzyknięciu roztworu sci-fi zamknij pułapki bąbelkowe.

Wyreguluj zawór trójdrogowy i uruchom ponownie pompę z prędkością 0,03 mililitra na minutę, aby dostarczyć rozwiązanie science-fiction do komory przepływowej. Następnie przełącz tryb obrazowania konfokalnego na XYT z częstotliwością odświeżania 0,15 Hz. Do werbalizacji penetracji barwnika preferowana jest wysoka rozdzielczość czasowa, jednak szybkie skanowanie obniża jakość obrazu.

Ustaw więc prędkość skanowania i średnią liniową, aby zrównoważyć rozdzielczość czasową obrazowania i jakość obrazu. Po ustawieniu parametrów obrazowania uruchom ponownie pompę, aby wznowić przepływ. Z szybkością 0,03 mililitra na minutę sci pięć będzie jednocześnie dostarczanych do komory przepływowej.

Zainicjuj poklatkowe obrazowanie konfokalne. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego. Przeprowadzono analizę dyfuzji zgodnie z instrukcjami zawartymi w dokumencie towarzyszącym.

Aby scharakteryzować pole przepływu wokół biofilmów, rozcieńczyć fluorescencyjne mikrogranulki o długości jednego mikrometra w sterylizowanej wodzie do końcowego stężenia ciała stałego 0,2% i końcowej objętości 0,5 mililitra. Następnie przeprowadź wirowanie, aby upewnić się, że mikrokulki są dobrze rozproszone, wstrzymaj przepływ, a następnie wstrzyknij i dostarcz rozcieńczone mikrokulki fluorescencyjne do komory przepływowej. Tak jak poprzednio, zmień natężenie przepływu na 0,01 mililitra na godzinę.

Niskie natężenie przepływu pozwala na dokładne śledzenie ścieżki cząstek. Przełącz ustawienia konfokalne na tryb XYT i poinstruuj oprogramowanie, aby śledziło ruch cząstek w jednym wycinku Z. Rejestruj obrazy szeregów czasowych tak jak wcześniej, używając szybkości klatek wynoszącej jedną herc.

Powtórz procedurę wstrzykiwania cząstek i obraz w różnych miejscach Z. Po zakończeniu obrazowania postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dokumencie towarzyszącym, aby obliczyć wektory przepływu w celu zbadania interakcji bakterii w biofilmie pod gradientem glukozy. Posa GFP i E. coli różnicowano w biofilmach dwugatunkowych poprzez barwienie przeciwstawne.

Za pomocą cyto uzyskano 62 obrazy w każdym z dziewięciu obszarów obrazowania w komorze przepływowej. Na pokazanych tutaj nakładkach posa GFP jest zielony lub żółty, a E coli pojawia się na czerwono. Posa zdominowała biomasę biofilmu w regionach o wysokim stężeniu glukozy, a E. coli dominowała w regionach o niskim stężeniu glukozy.

W ten sposób oba gatunki zajmowały odrębne nisze ekologiczne. Wyniki te wskazują na przydatność mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem w badaniu rozwoju biofilmu, aktywności i interakcji w złożonych środowiskach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem do hodowli biofilmów w gradientach chemicznych i jak uzyskać parametry środowiskowe do rozwoju biofilmu za pomocą wstrzyknięć cząstek fluorescencyjnych lub ścigaczy po opracowaniu.

Metody te utorowały drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią środowiskową i kliniczną do badania złożonych interakcji między społecznościami drobnoustrojów a otaczającym je środowiskiem.