Name: Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metody charakteryzowania interakcji biofilmu ze środowiskiem przy użyciu mikroprzepływowego układu komórkowego z podwójnym wlotem. Techniki te umożliwiają tworzenie gradientów chemicznych i analizę dynamiki przepływu wokół kolonii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mattowi Parsekowi z Uniwersytetu Waszyngtońskiego (Seattle, WA) za udostępnienie szczepów P. aeruginosa i E. coli oraz Rogerowi Nokesowi z Uniwersytetu Canterbury (Nowa Zelandia) za udostępnienie oprogramowania Streams. Prace te były wspierane przez R01AI081983 grantowe z National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Obrazowanie konfokalne wykonano w Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).

1. Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
UWAGA: Użyj mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem opisanej w Song et al., 201414 do hodowli biofilmów. Ta komórka przepływowa jest w stanie tworzyć dobrze zdefiniowane, gładkie gradienty chemiczne. Konstrukcja komory przepływowej jest pokazana na rysunku 1, a produkcja komory przepływowej została wcześniej opisana w Song i in., 201414. Tutaj szczegółowo opisujemy nasze metody, wykorzystując P. aeruginosa i E. coli do tworzenia biofilmów, ale inne gatunki również mogą być odpowiednie. Użyliśmy P. aeruginosa PAO1-gfp, który konstytutywnie wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP), jako organizm modelowy do rozwoju biofilmu. Dodatkowo użyliśmy E. coli DH5α do utworzenia mieszanych gatunkowych biofilmów z P. aeruginosa. Szczepy P. aeruginosa i E. coli hodowano na płytkach agarowych LB.
<ol>
	<li>Przygotować komorę przepływową przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) związanego ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym za pomocą plazmy tlenowej, jak opisano wpkt 14. Wymiary komory komory przepływowej wynoszą 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (długość × szerokość × głębokość).</li>
	<li>Przygotować zmodyfikowane podłoże FAB15. Aby zaobserwować wzrost biofilmu w gradiencie składników odżywczych w komórce przepływowej, należy wprowadzić zmodyfikowaną pożywkę FAB15 z 0,6 μM glukozy w jednym wlocie i wprowadzić pożywkę FAB bez żadnego źródła węgla przez drugi wlot. Przefiltrować i wysterylizować (wielkość porów = 0,2 μm) roztwór podstawowy glukozy (60 mM) przed dodaniem go do pożywki FAB. Przed użyciem należy również autoklawować pożywkę FAB w cyklu 1 (ciecz, 15 min; 121 °C, 17 psi).</li>
	<li>Wysterylizuj system przepływu. Przed inokulacją należy przelać w autoklawie całą ścieżkę przepływu (butelki z pożywką, rurki, pułapki bąbelkowe, komory przepływowe) przy użyciu cyklu 1, z wyjątkiem plastikowych zaworów trójdrogowych (jednorazowych i wstępnie wysterylizowanych) znajdujących się przed komorą przepływową. (Zawory trójdrogowe służą do wstrzykiwania hodowli komórkowych, znacznika fluorescencyjnego i mikrogranulek). Aby uniknąć zanieczyszczenia podczas montażu, przed autoklawowaniem przykryj wszystkie rurki i otwory złączy folią aluminiową lub workami do autoklawu.</li>
	<li>Podłącz system przepływu. Ostrożnie zmontuj elementy systemu komory przepływowej (patrz film przedstawiający montaż systemu przepływowego) i dostarcz pożywkę wzrostową do komory przepływowej za pomocą pompy perystaltycznej, która precyzyjnie kontroluje natężenie przepływu.</li>
	<li>Przygotować hodowlę komórkową do inokulacji, przenosząc kolonię P. aeruginosa lub E. coli z płytek LB do 3 ml bulionu LB i wstrząsnąć kulturą O/N przy 225 obr./min i 37 °C. Rozcieńczyć kultury komórkowe O/N w 1 ml wysterylizowanej wody do końcowego OD600 = 0,01 jako inokulum. (Hoduj i rozcieńczaj bakterie w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.)</li>
	<li>W przypadku doświadczeń z biofilmami mieszanymi należy rozcieńczyć dwie kultury bakteryjne w stosunku 1:1 na 1 ml z równoważnym OD600 = 0,01 dla każdej bakterii.</li>
	<li>Zaszczepić komórkę przepływową. Wstrzyknąć 1 ml inokulum do wlotu komory przepływowej z zaworu trójdrogowego. Po wstrzyknięciu należy wstrzymać przepływ na 1 godzinę, aby umożliwić komórkom bakteryjnym przyczepienie się do szkła nakrywkowego. (Upewnij się, że komora przepływowa jest umieszczona szkiełkiem nakrywkowym do dołu, aby umożliwić osadzenie się zawieszonych komórek na szkiełku nakrywkowym.)</li>
	<li>Po 1 godzinie wznowić przepływ i pompować pożywkę wzrostową do komory przepływowej ze stałą szybkością 0,03 ml/min na każdy wlot przez 3 dni.</li>
</ol>
2. Charakterystyka rozwoju biofilmu w odpowiedzi na gradienty składników odżywczych za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: P. aeruginosa może być obrazowany za pomocą konstytutywnie wyrażonego GFP, ale E. coli w biofilmach mieszanych gatunków musi być obrazowany przez barwienie przeciwstawne.

<ol>
	<li>Obserwuj 3-dniowe biofilmy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, obserwuj biofilmy za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63X. Przed przystąpieniem do obrazowania należy oznaczyć celę przepływową z podwójnym wlotem siatką po stronie szkła nakrywkowego. (Celem tej siatki jest umożliwienie eksperymentatorowi zlokalizowania obszarów obrazowania w komorze komory przepływowej).</li>
	<li>Aby przeciwbarwić, rozcieńczyć 10 μl czerwonego fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym przepuszczanym przez komórkę, takiego jak zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym, takim jak STYO 62, roztwór podstawowy (1 mM) w 990 μl sterylizowanej wody, a następnie powoli wstrzyknąć rozcieńczoną plamę za pomocą strzykawki do komory komory przepływowej z poprzedzającego zaworu trójdrogowego. Utrzymuj celę przepływową w stagnacji i ciemności przez 30 minut, a następnie wznów przepływ, aby wypłukać niezwiązaną plamę na 15 minut.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne. Aktywuj laser argonowy 488 nm do wzbudzenia i kanałów zbierających emisję dla GFP (500-535 nm) i barwienia kwasami nukleinowymi (dla barwienia kwasami nukleinowymi na zielono fluorescencyjnymi, 650-750 nm). Dostosuj wzmocnienia i przesunięcia dla obu kanałów, aby uzyskać jasny i czysty obraz. Wybierz tryb xyz i obrazowania symultanicznego. Użyj pokrętła z-control, aby zidentyfikować dolną i górną część biofilmu na polu. Ustaw krok z na 0,5 μm, aby uzyskać stos obrazów 3-W. (Aby zapewnić wysoką jakość obrazu, do akwizycji obrazu należy użyć średniej linii czterech).</li>
	<li>Aby zmapować przestrzenne wzorce rozwoju biofilmu w komórce przepływowej, należy zobrazować biofilmy w trzech lub więcej odległościach podłużnych (x) wzdłuż wlotu komórki przepływowej oraz w trzech pozycjach poprzecznych (y) względem narzuconego gradientu składników odżywczych, jak pokazano na rysunku 1.</li>
</ol>
3. Charakterystyka wewnętrznego transportu substancji rozpuszczonej za pomocą wstrzyknięć konserwatywnego znacznika fluorescencyjnego
UWAGA: Konserwatywny znacznik fluorescencyjny, taki jak Cy5, może być użyty do scharakteryzowania wzorców transportu substancji rozpuszczonej w biofilmie.
<ol>
	<li>Rozpuścić Cy5 (monoreaktywny ester NHS) w wodzie do końcowego stężenia 10 mg/ml w postaci roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy Cy5 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Ponieważ Cy5 jest wrażliwy na światło, należy przechowywać, rozcieńczać i wstrzykiwać roztwory Cy5 w ciemności.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem znacznika fluorescencyjnego należy wykonać obraz 3D 3-dniowego biofilmu za pomocą mikroskopii konfokalnej (z obiektywem 63X). (Szerokie obszary kolonii biofilmu są idealne do obserwacji transportu barwnika w szeregach czasowych). Należy również wybrać płaszczyznę Z z z dobrze oddzielonymi koloniami do obrazowania (jak pokazano na rysunku 5A).</li>
	<li>Dla każdego eksperymentu z wstrzykiwaniem Cy5 rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego Cy5 w 998 μl wysterylizowanej wody, aby otrzymać roztwór do wstrzykiwań o stężeniu Cy5 20 μg/ml.</li>
	<li>Zatrzymać pompę, aby wstrzymać przepływ i wstrzyknąć roztwór Cy5 do górnej części komory przepływowej za pomocą strzykawki za pomocą zaworu 3-drogowego. (Ważne jest, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza na ścieżkę przepływu podczas wstrzykiwania. Pułapki bąbelkowe powinny być otwarte podczas wstrzyknięcia wstecznego.)</li>
	<li>Po wstrzyknięciu roztworu Cy5 zamknij pułapki bąbelkowe, wyreguluj zawór 3-drogowy i uruchom ponownie pompę, aby dostarczyć wstrzyknięty roztwór Cy5 do komory przepływowej.</li>
	<li>Przełącz tryb obrazowania konfokalnego na xyt. Aktywuj kanały Cy5 i GFP w trybie jednoczesnego obrazowania. Dostosuj ustawienia konfokalne intensywności Cy5 (intensywność lasera, wzmocnienie i przesunięcie), aby uniknąć nasycenia sygnałów, co ma kluczowe znaczenie dla kwantyfikacji. (Wysoka rozdzielczość czasowa jest preferowana do wizualizacji penetracji barwnika. Jednak szybkie skanowanie pogarsza jakość obrazu.) Wybierz odpowiednią szybkość skanowania i średnią liniową, aby zrównoważyć rozdzielczość czasową obrazowania i jakość obrazu. W przypadku tego protokołu użyj średniej liniowej wynoszącej cztery i częstotliwości odświeżania 0,15 Hz.</li>
	<li>Wznów przepływ, aby dostarczyć Cy5 do komory przepływowej (nadal przy natężeniu przepływu 0,03 ml/min). Równocześnie rozpocznij obrazowanie konfokalne szeregów czasowych.</li>
	<li>Określ ilościowo penetrację Cy5 poprzez promieniste uśrednienie intensywności Cy5 w okrągłej kolonii biofilmu 2D. Aby uśrednić, najpierw zidentyfikuj krawędź klastra biofilmu, następnie wygeneruj mapę odległości dla dwuwymiarowego odcinka gromady, a na końcu uśrednij wzorce radialne o intensywności Cy5, aby wygenerować krzywą penetracji (patrz rysunek 6).
	<ol>
		<li>Aby obliczeniowo zrealizować krok 3.8, należy użyć pakietu oprogramowania BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) (niepublikowanego, pakiet oprogramowania i instrukcja dostępne na żądanie) lub innych programów do analizy obrazu.</li>
		<li>Aby korzystać z BioSPA, najpierw zaimportuj zestaw obrazów do BioSPA. Następnie wybierz odpowiedni próg dla kanałów GFP i Cy5 do tworzenia obrazów binarnych. W menu analiza/obliczenia wybierz opcję Analiza zaawansowana, a następnie Analiza dyfuzyjna. Użyj kanału GFP, aby zdefiniować krawędź klastra i użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać jeden klaster jako obszar zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie wybrane skupisko biofilmu, aby przeprowadzić analizę dyfuzji. Zapisz wyniki analizy dyfuzji i skalibruj intensywność Cy5 do stężenia Cy5 za pomocą krzywej kalibracyjnej.
		<ol>
			<li>Aby wygenerować krzywą kalibracyjną stężenia Cy5, zmierz intensywności Cy5 w gradiencie stężenia Cy5 pod mikroskopią konfokalną. (Intensywność i stężenie Cy5 mają liniową zależność.)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka otaczającego pola przepływu poprzez śledzenie cząstek fluorescencyjnych
UWAGA: Cząstki fluorescencyjne, takie jak mikrogranulki fluorescencyjne, mogą być używane do charakteryzowania pola przepływu wokół biofilmów. Pole przepływu wokół biofilmów można obliczyć na podstawie obserwacji szeregów czasowych pozycji cząstek za pomocą oprogramowania do śledzenia prędkości cząstek. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano za pomocą pakietu oprogramowania Streams 2.0216 (oprogramowanie do pobrania i podręcznik użytkownika są dostępne pod adresem <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).</a>
<ol>
	<li>Rozcieńczyć mikrogranulki fluorescencyjne (średnica ~1 μm) w wysterylizowanej wodzie do końcowego stężenia stałego 0,2% i końcowej objętości 0,5 ml. Wirować, aby upewnić się, że mikrogranulki są dobrze rozproszone.</li>
	<li>Wstrzyknąć i dostarczyć rozcieńczone mikrokulki fluorescencyjne do celi przepływowej, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.3 do 3.5. Aby umożliwić dokładne śledzenie ścieżki cząstek, należy użyć stosunkowo niskiego natężenia przepływu (0,01 ml/godz. dla wyników śledzenia cząstek w tym artykule).</li>
	<li>Przełącz ustawienia konfokalne na tryb xyt, aby śledzić ruch cząstek w jednym wycinku z i wykonywać obrazy szeregów czasowych. (Dla reprezentatywnych wyników przedstawionych w tym artykule użyto częstotliwości odświeżania 1 Hz). Powtórz wstrzykiwanie cząstek i obraz w różnych miejscach z, aby wygenerować pole przepływu 3D.</li>
	<li>Wstępnie przetwórz obrazy konfokalne szeregów czasowych, odejmując sygnał fluorescencji tła (sygnał z pierwszego uzyskanego obrazu zestawu obrazów) za pomocą ImageJ (oprogramowanie do pobrania i instrukcja dostępne na stronie <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a>) lub innych programów.</li>
	<li>W ImageJ otwórz pierwszy obraz zestawu obrazów, a następnie zaimportuj zestaw obrazów. W obszarze Process / Image Calculator (Kalkulator procesu/obrazu) odejmij pierwszy obraz od zestawu obrazów. Zapisz wstępnie przetworzony zestaw obrazów.</li>
	<li>Aby obliczyć wektory przepływu, zaimportuj obrazy konfokalne szeregów czasowych w programie Streams 2.02. W sekcji "Otwórz widok procesu" wybierz i wykonaj "Zidentyfikuj cząstki". Użyj odpowiedniego progu, aby zidentyfikować cząstki. Dla cząstek o wielkości 1 μm należy stosować 0,5 i 5 μm jako minimalne i maksymalne progi średnicy.</li>
	<li>Następnie w sekcji "Otwórz widok procesu" wybierz i wykonaj "Potok analizy PTV", aby wygenerować ścieżki cząstek. Sprawdź ścieżki cząstek, aby zobaczyć, czy reprezentują ruch cząstek. Na koniec wybierz i wykonaj polecenie "Utwórz pole prędkości", aby wygenerować mapę wektorów przepływu.</li>
</ol>

<ol><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li>
<li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+A+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear%3A+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li>
<li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk%2Fbiofilm+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Convection+around+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%3A+The+Journal+of+Bioadhesion+and+Biofilm+Research%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li>
<li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorption+sites+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li>
<li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Eng-T+Asme%22%5BJournal%5D)">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li>
<li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li>
<li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li>
<li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li>
<li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li>
<li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs%5BTitle%5D)+AND+%22Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li>
<li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li>
<li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li>
<li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowaliśmy zestaw metod charakteryzujących trzy ważne interakcje biofilm ze środowiskiem: odpowiedź biofilmu na gradienty chemiczne, wpływ wzrostu biofilmu na otaczające mikrośrodowisko przepływu oraz niejednorodność biofilmu wynikającą z ograniczeń transportu wewnętrznego.
Po raz pierwszy pokazaliśmy zastosowanie nowatorskiej mikroprzepływowej komórki przepływowej do nałożenia dobrze zdefiniowanego gradientu chemicznego do rozwoju biofilmu. Aby wygenerować dobrze zdefiniowany gradient...

Mikroorganizmy przyczepiają się do powierzchni i tworzą biofilmy — agregaty komórkowe zamknięte w pozakomórkowej matrycy polimerowej1. Biofilmy zachowują się zupełnie inaczej niż pojedyncze komórki drobnoustrojów, ponieważ biofilmy mają dramatyczną niejednorodność przestrzenną wynikającą z połączenia wewnętrznych ograniczeń transportu substancji rozpuszczonej i przestrzennych zmian w metabolizmie komórkowym2,3. Stężenie tlenu i składników odżywczych drastycznie spada na granicy faz między biofilmem a otaczającym płynem i ulega dalszemu wyczerpaniu w biofilmie2. Przestrzenne różnice w oddychaniu biofilmu i syntezie białek mogą również wystąpić w odpowiedzi na miejscową dostępność tlenu i składników odżywczych2.
W środowisku wodnym i glebowym większość bakterii żyje w biofilmach. Naturalne biofilmy przeprowadzają ważne procesy biogeochemiczne, w tym obieg węgla i azotu oraz metale redukujące4,5. Klinicznie tworzenie się biofilmu jest odpowiedzialne za przedłużające się infekcje płuc i dróg moczowych6. Zakażenia związane z biofilmem są wysoce problematyczne, ponieważ komórki w biofilmach mają wyjątkowo wysoką oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu z ich planktonowymi odpowiednikami6. Ponieważ biofilmy są ważne w różnych środowiskach, znaczna liczba badań koncentruje się na zrozumieniu czynników środowiskowych, które kontrolują aktywność biofilmu i niejednorodności przestrzennej w biofilmach i otaczającym mikrośrodowisku.
Poprzednie badania wykazały, że rozwój biofilmu jest silnie regulowany przez szereg czynników środowiskowych: biofilmy rozwijają różne morfologie w różnych warunkach przepływu; dostępność tlenu i składników odżywczych wpływa na morfologię biofilmu; a hydrodynamiczne naprężenie ścinające wpływa na przyleganie komórek planktonowych do powierzchni i oddzielenie komórek od biofilmów7-9. Ponadto warunki przepływu zewnętrznego wpływają na dostarczanie substratów do biofilmów i w ich obrębie10. Wzrost biofilmów zmienia również otaczające warunki fizyczne i chemiczne. Na przykład wzrost biofilmu prowadzi do miejscowego wyczerpania tlenu i składników odżywczych2; biofilmy gromadzą związki nieorganiczne i organiczne z otaczającego środowiska11; a klastry biofilmu przekierowują przepływ i zwiększają tarcie powierzchniowe12,13. Ponieważ biofilmy oddziałują z otaczającym je środowiskiem w bardzo złożony sposób, kluczowe znaczenie ma jednoczesne uzyskiwanie informacji na temat właściwości biofilmu i warunków środowiskowych, a do kompleksowego scharakteryzowania interakcji biofilm a środowiskiem należy zastosować podejścia multidyscyplinarne.
Tutaj prezentujemy szereg zintegrowanych metod do charakteryzowania przestrzennych wzorców wzrostu mikroorganizmów w obrębie mono-gatunkowych i dwugatunkowych biofilmów pod narzuconym gradientem żywieniowym oraz do obserwacji wynikającej z tego modyfikacji lokalnego chemicznego i płynnego mikrośrodowiska. Najpierw opisujemy zastosowanie niedawno opracowanej mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem do obserwacji wzrostu biofilmu w dobrze zdefiniowanych gradientach chemicznych. Następnie demonstrujemy zastosowanie tej mikroprzepływowej komórki przepływowej do obserwacji wzrostu dwóch gatunków bakterii, Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli, w biofilmach w różnych warunkach żywieniowych. Pokazujemy, w jaki sposób wizualizacja in situ fluorescencyjnego znacznika rozprzestrzeniania się do kolonii biofilmu może być wykorzystana do ilościowej oceny wzorców transportu substancji rozpuszczonej w biofilmach. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać prędkość śledzenia cząstek w mikroskali, wykonywaną pod mikroskopią konfokalną, do uzyskania lokalnego pola przepływu wokół rosnących biofilmów.

<table><tbody><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Konfiguracja komory przepływowej i rurka pompy inokulacyjnej</td></tr><tr><td>0,50&nbsp; mm OVC, pomarańczowo-żółte</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>Trójdrożny kran z obrotowym męskim zamkiem Luer</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Enkapsulacja ogniw słonecznych do produkcji paneli słonecznych</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>Butelka Pyrex Medium, 1&nbsp; L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej</td></tr><tr><td>C-FLEX Rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej</td></tr><tr><td>1 ml TB Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>Rurka polimerowa</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej</td></tr><tr><td>Sterylny adapter Intramedic Luer Stub</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>HACH</td><td></td><td>Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej Filtry</td></tr><tr><td>strzykawkowe - sterylne (0,2 &mu; m)</td> <td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Chlorek magnisium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Dwuwodny siarczan wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Pożywki wzrostowe</td></tr><tr><td>Siarczan manganu(II) jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Pożywki</td></tr><tr><td>wzrostowe Siarczan miedzi(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Pożywki wzrostowe</td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Siarczan kobaltu(II) siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Molibdenian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B6768</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bulion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>TCS SP2 Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica</td><td></td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>PA15100</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Czerwona fluorescencyjna (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Moc</td><td>Strumienie przetwarzania obrazu PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.02</td><td>Przetwarzanie obrazu</td> <td>Uniwersytetu Cantebury</td><td></td></tr></tbody></table>

metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilmy to powierzchniowo przyczepione społeczności mikroorganizmów, które mają złożone struktury i wytwarzają znaczne niejednorodności przestrzenne. Rozwój biofilmu jest silnie regulowany przez otaczający przepływ i środowisko odżywcze. Wzrost biofilmu zwiększa również niejednorodność lokalnego mikrośrodowiska poprzez generowanie złożonych pól przepływu i wzorców transportu substancji rozpuszczonych. Aby zbadać rozwój heterogeniczności biofilmów i interakcji między biofilmami a ich lokalnym mikrosiedliskiem, wyhodowaliśmy monogatunkowe biofilmy Pseudomonas aeruginosa i dwugatunkowe biofilmy P. aeruginosa i Escherichia coli w gradientach odżywczych w mikroprzepływowej komórce przepływowej. Zapewniamy szczegółowe protokoły tworzenia gradientów składników odżywczych w komórce przepływowej oraz wzrostu i wizualizacji rozwoju biofilmu w tych warunkach. Przedstawiamy również protokoły dla szeregu metod optycznych do ilościowego określania wzorców przestrzennych w strukturze biofilmu, rozkładu przepływu nad biofilmami oraz transportu masowego wokół i wewnątrz kolonii biofilmu. Metody te wspierają kompleksowe badania nad współtworzeniem biofilmu i heterogenicznością siedlisk.

Mikropłynna komora przepływowa z podwójnym wlotem umożliwia obserwację wzrostu biofilmu w ściśle określonym gradiencie chemicznym, powstającym w wyniku mieszania dwóch roztworów wewnątrz komory przepływowej. Powstały gradient chemiczny był wcześniej obserwowany poprzez wstrzykiwanie barwnika i szczegółowo scharakteryzowany przez Song et al.14. W kierunku poprzecznym utworzyły się łagodne gradienty stężeń, co przedstawiono na Rysunku 1. Profil stężeń był stromy w pobliżu wlotu i ulegał...

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka oddziaływań biofilmu z otaczającym go środowiskiem przy użyciu zintegrowanych metod. Skonstruowano mikrofluidyczny układ komory przepływowej z podwójnym wlotem, w którym pompowane są pożywki zawierające glukozę oraz pozbawione glukozy, co generuje gradient glukozy. Do układu dodaje się bakterie, a następnie umożliwia się rozwój biofilmów w ciągu kilku dni.Następnie biofilmy są obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii 3D w celu scharakteryzowania transportu substancji rozpuszczonych. W celu scharakteryzowania pola przepływu wokół kolonii biofilmów, do systemu przepływowego wstrzykuje się fluorescencyjne znaczniki i wykonuje obrazowanie poklatkowe, a następnie wstrzykuje się fluorescencyjne mikrokulki i ponownie przeprowadza obrazowanie poklatkowe. Analiza transportu substancji rozpuszczonych oraz śledzenie cząsteczek na podstawie uzyskanych danych wykazują użyteczność tej metody w ocenie procesów biofilmowych w różnych środowiskach chemicznych w obrębie jednego urządzenia i w jednym zestawie doświadczeń.Główną zaletą tych metod jest to, że pozwalają one na jednoczesną ocenę wielu aspektów oddziaływań w środowisku biofilmu. Metody opisane w niniejszej pracy mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tworzenia się biofilmu w środowiskach naturalnych lub w przebiegu infekcji związanych z biofilmem. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieś kolonię posa PAO one GFP oraz kolonię e coli DH five alpha z płytki z podłożem LB do oddzielnych probówek zawierających 3 mL bulionu LB.Kultury inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 RPM. Ten system przepływowy opiera się na mikrofluidycznej komorze z podwójnym wlotem, która umożliwia obserwację wzrostu biofilmu w dobrze zdefiniowanym gradiencie chemicznym, tworzonym poprzez mieszanie dwóch roztworów wewnątrz komory przepływowej. Podczas przepływu w kierunku poprzecznym tworzy się gładki gradient stężeń.W wyniku dyfuzji profil stężeń jest stromy w pobliżu wlotu i łagodniejszy w kierunku ujścia. W dniu eksperymentu należy starannie zmontować układ przepływowy. Najpierw zamocuj wężyki w pompie perystaltycznej, a następnie podłącz jeden koniec wężyka do butelki z 900 mililitrami pożywki FAB z glukozą, a drugi koniec do pułapki na pęcherzyki powietrza.Powtórz ten proces, aby podłączyć drugą butelkę z pożywką zawierającą 900 milliliters fab bez glukozy do drugiej pułapki pęcherzykowej. Następnie zamontuj zawory trójdrożne bezpośrednio przed wlotami do komory przepływowej i podłącz każdą z pułapek pęcherzykowych do komory przepływowej. Na koniec podłącz wylot z komory przepływowej do butelki na odpady.Należy upewnić się, że celę przepływową umieszczono stroną z lamellerką do dołu, aby zawieszone komórki mogły osiąść na lamellerce. Po zmontowaniu układu przepływowego należy włączyć pompę perystaltyczną z przepływem 10 ml/h dla każdego wlotu, aby wypełnić układ pożywką. Pożywkę wprowadza się do obu wlotów, przy czym glukozę podaje się tylko w jednym z nich. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy rozcieńczyć dwie kultury bakteryjne w stosunku jeden do jednego w 1 ml sterylnej wody do wartości OD 600 wynoszącej 0,01 dla każdej bakterii. Aby zaszczepić celę przepływową, należy użyć sterylnej plastikowej strzykawki, aby wstrzyknąć 500 µL inokulum do każdego z wlotów celi przepływowej za pomocą zaworu trójdrożnego.Po wstrzyknięciu należy zatrzymać pompę i pozwolić komórkom bakteryjnym przytwierdzić się do szkiełka podstawowego przez jedną godzinę. Po przytwierdzeniu się komórek ustawić pompę na 0,03 milliliters per minute dla każdego wlotu i pozostawić układ w przepływie przez trzy dni w temperaturze pokojowej, podczas których pod wpływem gradientu stężenia glukozy rozwinie się biofilm. Po upływie trzech dni, przy użyciu markera i linijki, narysować siatkę na stronie szkiełka podstawowego komory przepływowej w celu przygotowania do obrazowania.Ułatwi to zlokalizowanie obszarów obrazowania w celu przeprowadzenia barwienia kontrastowego do wizualizacji e coli. Najpierw zgaś światło, aby zaciemnić obszar roboczy, ponieważ barwnik kontrastowy jest światłoczuły. Za pomocą strzykawki powoli wstrzyknij 1 mL rozcieńczonego, przenikającego przez błony komórkowe czerwonego fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych do zaworu trójdrożnego powyżej komory przepływowej.Zatrzymać przepływ. Pozostawić komórkę przepływową w ciemności, bez przepływu, na 30 minut. Po upływie 30 minut.Wznów przepływ z prędkością 0,03 milliliters per minute i wypłukuj niezwiązany barwnik przez 15 minutes. Następnie zatrzymaj przepływ i obserwuj biofilmy za pomocą mikroskopii konfokalnej z obiektywem 63 x. Znajdź pole widzenia zawierające odpowiednią ilość biomasy z dobrze oddzielonymi koloniami biofilmu, jak pokazano tutaj.Następnie wykonaj obrazy 3D w odpowiednich kanałach, aby zmapować przestrzenne wzorce rozwoju biofilmu w obrazie komory przepływowej, analizując biofilmy w trzech lub więcej punktach wzdłuż osi podłużnej (X) od wlotu komory przepływowej oraz w trzech pozycjach poprzecznych (Y) względem zastosowanego gradientu odżywczego. Aby scharakteryzować wzorce transportu substancji rozpuszczonych w obrębie biofilmu, rozpocznij od przygotowania komory przepływowej. Po trzech dniach rozwoju biofilmu ponownie pracuj w ciemności.Zatrzymaj pompę, aby przerwać przepływ, a następnie otwórz pułapki pęcherzyków powietrza, aby zwolnić ciśnienie wtrysku. Następnie za pomocą strzykawki wstrzyknij 1 mL rozcieńczonego roztworu znacznika sci-fi do jednego z zaworów trójdrożnych znajdujących się przed celą przepływową. Po wstrzyknięciu roztworu sci-fi zamknij pułapki pęcherzyków powietrza.Ustaw zawór trójdrożny i ponownie uruchom pompę z prędkością 0,03 milliliters per minute, aby wprowadzić roztwór sci-fi do celi przepływowej. Następnie przełącz tryb obrazowania konfokalnego na XYT z częstotliwością klatek 0,15 hertz. Wysoka rozdzielczość czasowa jest preferowana w celu zobrazowania penetracji barwnika, jednak szybkie skanowanie obniża jakość obrazu.Należy zatem ustawić prędkość skanowania oraz uśrednianie linii, aby zrównoważyć rozdzielczość czasową obrazowania i jakość obrazu. Po ustawieniu parametrów obrazowania należy ponownie uruchomić pompę, aby wznowić przepływ. Przy szybkości 0.03 milliliters per minute sci five będzie dostarczane do celi przepływowej jednocześnie.Rozpocznij konfokalne obrazowanie poklatkowe. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego przeprowadź analizę dyfuzji zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym dokumencie.Aby scharakteryzować pole przepływu wokół biofilmów, należy rozcieńczyć fluorescencyjne mikrokulki o średnicy 1 µm w sterylnej wodzie do końcowego stężenia stałych 0,2% i końcowej objętości 0,5 ml. Następnie należy zastosować mieszanie w wirówce (vortex), aby upewnić się, że mikrokulki są dobrze rozproszone, zatrzymać przepływ, a następnie wstrzyknąć i wprowadzić rozcieńczone fluorescencyjne mikrokulki do komory przepływowej. Podobnie jak wcześniej, należy zmienić szybkość przepływu na 0,01 ml/h.Niski przepływ umożliwia dokładne śledzenie ścieżki cząstki. Przełącz ustawienia konfokalu na tryb XYT i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby śledziło ruch cząstki w jednym przekroju Z. Rejestruj obrazy w serii czasowej w taki sam sposób jak wcześniej, stosując częstotliwość klatek 1 Hz.Powtórz procedurę wstrzykiwania cząstek i wykonaj obrazowanie w różnych położeniach Z. Po zakończeniu obrazowania postępuj zgodnie z instrukcjami w załączonym dokumencie, aby obliczyć wektory przepływu w celu zbadania interakcji bakteryjnych w biofilmie w gradiencie glukozy. Posa GFP i E coli zostały rozróżnione w biofilmach dwugatunkowych poprzez barwienie kontrastowe.Za pomocą cyto 62 obrazy zostały pozyskane w każdym z dziewięciu obszarów obrazowania w komorze przepływowej. Na przedstawionych tutaj nałożeniach posa GFP ma kolor zielony lub żółty, a e coli ma kolor czerwony. Posa dominowała w biomasie biofilmu w obszarach o wysokich stężeniach glukozy, natomiast e coli dominowała w obszarach o niskich stężeniach glukozy.W ten sposób oba gatunki zajmowały odrębne nisze ekologiczne. Wyniki te demonstrują użyteczność mikrofluidycznej celi przepływowej z podwójnym wlotem w badaniu aktywności rozwoju i interakcji biofilmu w złożonych środowiskach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu wykorzystania mikrofluidycznej celi przepływowej z podwójnym wlotem do hodowli biofilmów w gradientach chemicznych oraz metod pozyskiwania parametrów środowiskowych rozwoju biofilmu za pomocą iniekcji cząsteczek fluorescencyjnych lub markerów po zakończeniu procesu rozwoju.Metody te utorowały drogę badaczom z dziedzin mikrobiologii środowiskowej i klinicznej do zgłębiania złożonych interakcji między społecznościami drobnoustrojów a ich otoczeniem.

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedliska

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Źródło: Miquel Guennoc, C. i inni. Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów włóknistych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje przygotowanie hodowli grzybów na poddanych leczeniu błon celofanowych, aby wspierać tworzenie kolonii i wzrost promieniowy. Następnie pokazuje uprawę i przygotowanie komórek bakteryjnych glebowych do testów interakcji. Na koniec ilustruje, jak komórki bakteryjne...

Ustanowienie współkultury grzybowo-bakteryjnej do tworzenia biofilmu

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Biofilmy mikrobiologiczne tworzą złożone architektury na skrzyżowaniach i rozwijają się w wysoce zależne od skali wzorce przestrzenne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny system (sprzętowy i programowy) do automatycznego pozyskiwania zestawów danych optycznej tomografii koherentnej (OCT) 3D. Ten zestaw narzędzi pozwala na nieinwazyjną i wieloskalową charakterystykę morfogenezy biofilmu w przestrzeni i czasie.

Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Poznaj metody charakteryzowania interakcji biofilmu ze środowiskiem przy użyciu mikroprzepływowego układu komórkowego z podwójnym wlotem. Techniki te umożliwiają tworzenie gradientów chemicznych i analizę dynamiki przepływu wokół kolonii.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Przeglądaj więcej filmów