Name: Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę elektroprzędzenia nanowłókien z gradacją organizacji włókien z polikaprolaktonu. Technika ta umożliwia regulację morfologii i orientacji komórek w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana z funduszy startowych z University of Nebraska Medical Center i National Institute of Health (grant numer 1R15 AR063901-01).

1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) (Mw = 80 000 g/mol) o przybliżonym stężeniu 100 mg/ml. Rozpuścić PCL w mieszaninie dichlorometanu (DCM) i N, N-dimetyloformamidu (DMF) w stosunku 4:1 (v/v) o stężeniu 10% (w/v).</li>
	<li>Umieść roztwór w szklanej probówce o pojemności 20 ml do wymieszania. Umieść szklaną rurkę w myjce ultradźwiękowej na 30 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty.</li>
</ol>
2. Przygotowanie aparatury
<ol>
	<li>Dodać przygotowany roztwór PCL do strzykawki o pojemności 5 ml z dołączoną igłą w rozmiarze 21.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową w pionowej pozycji do elektrowirowania, zgodnie z rysunkiem 1.</li>
	<li>Użyj kolektora szczelinowego ze stali nierdzewnej z otwartą przestrzenią 2 cm x 5 cm na wyrównane podłoże światłowodowe. Umieść kolektor w odległości 12 cm od końcówki igły.</li>
	<li>Podłącz prąd stały (DC) High Voltage zasilacz do igły i uziemić kolektor. Upewnij się, że kolektor jest indywidualnie uziemiony i nie ma kontaktu z innym sprzętem laboratoryjnym.</li>
</ol>
3. Elektroprzędzenie
<ol>
	<li>Ustawić pompkę strzykawkową na 1,50 ml/godz., aż kropelki tworzące się na końcu igły zostaną natychmiast zastąpione po usunięciu. Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,50 ml/h.</li>
	<li>Przekręć napęd napięcia na 12 kV.</li>
	<li>Elektrowiruj, aż jednoosiowo wyrównane włókna całkowicie zakryją szczelinę w kolektorze.</li>
	<li>Nałóż klej na krawędzie małej szklanej płytki i przenieś włókna z kolektora szczelinowego na szklaną płytkę. Umieść szklaną płytkę na kawałku folii aluminiowej, która ma ten sam rozmiar co szklana płyta i jest uziemiona.</li>
	<li>Umieścić drugi pojemnik na strzykawkę zgodnie z rysunkiem 3.</li>
	<li>Przymocuj plastikową maskę do drugiej pompy strzykawkowej i umieść ją 2 mm nad kolektorem.</li>
	<li>Dodaj kumarynę 6 w stężeniu 1% (w/w) do roztworu PCL - jeśli pożądana jest nanokapsułkowanie - i mieszaj, aż roztwór stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Roztwór PCL lub PCL/kumaryny 6 należy umieścić w igle o pojemności 5 ml za pomocą igły o rozmiarze 21. Ustaw pompę pionową na 0,50 ml/godz., a poziomą, aby ciągnąć z prędkością 9 ml/godz. lub z przybliżoną prędkością 1 mm/min.</li>
	<li>Elektrowiruj, aż maska prawie całkowicie odsunie się od kolektora, ale obszar krawędzi nadal znajduje się pod maską.</li>
</ol>
4. Charakterystyka włókien
<ol>
	<li>Umieść próbki za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej na metalowym kołku i pokryj platyną przez 40 sekund za pomocą napylarki do napylania w temperaturze 40 mA.
	<ol>
		<li>Zbadaj włókna za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami17,18.</li>
		<li>Zbieraj obrazy przy narastającym napięciu 15 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj szybką analizę transformaty Fouriera (FFT) na oddzielnej próbce włókna, aby zmierzyć wyrównanie włókien. Szczegółowe informacje na temat pomiaru wyrównania włókien przez FFT można odnieść do wcześniejszych badań19,20.</li>
</ol>
5. Wysiewanie komórek macierzystych.
<ol>
	<li>Wysterylizuj próbki włókien, mocząc je w 70% roztworze etanolu przez 2 godziny. Następnie umyj włókna wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Otrzymać ludzkie ADSC i komórki hodowlane w kolbie o średnicy 25cm2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza/5%CO2. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień10.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki i policz liczbę komórek. W szczególności należy usunąć całą pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli komórkowych i dwukrotnie przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (wstępnie podgrzanego w łaźni wodnej do temperatury 37 °C) w celu przykrycia monowarstwy komórek i inkubować kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2-3 minuty. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej i wypłukać wszystkie komórki z powierzchni, pipetując pożywkę na całej powierzchni. Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zdyspergować osad komórkowy w pożywce hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Wysiewaj około 1 ×10 4 komórek do rusztowania z nanowłókien umieszczonego w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i inkubuj przez 3 i 7 dni.</li>
	<li>Wybarwić komórki za pomocą dioctanu fluoresceiny (5 mg/ml w acetonie) (FDA), a następnie zobrazować próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W szczególności dodaj 100 μl roztworu FDA do naczynia hodowlanego i inkubuj przez 30 minut. Umyj komórki trzykrotnie PBS przed obrazowaniem fluorescencyjnym. Analizuj orientację komórek za pomocą dostosowanego programu mat-lab opartego na naszych poprzednich badaniach10.</li>
</ol>

<ol><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li>
<li>Genin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+grading+of+mineral+and+collagen+in+the+attachment+of+tendon+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone.</a> Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).</li>
<li>Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+orientation+at+the+tendon+to+bone+insertion+and+its+influence+on+stress+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations.</a> J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).</li>
<li>Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+biomechanical%2C+structural%2C+and+compositional+properties+along+the+tendon+to+bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site.</a> J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).</li>
<li>Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+morphogenesis+of+the+tendon-to-bone+insertion+-+What+development+can+teach+us+about+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing.</a> Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).</li>
<li>Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+mineral+content+for+mimicking+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site.</a> Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).</li>
<li>Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+study+of+osteoblast+response+to+nanotopography+by+means+of+nanoparticle-density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients.</a> Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).</li>
<li>Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizable+nanomorphology+gradients+via+colloidal+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly.</a> Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Aligned-to-random%27+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li>
<li>Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+fiber+organization+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications.</a> Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).</li>
<li>James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+tissue+engineering%3A+adipose-derived+stem+cell+and+GDF-5+mediated+regeneration+using+electrospun+matrix+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems.</a> Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).</li>
<li>Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+in+functional+bone+tissue+engineering%3A+lessons+from+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+%28hASCs%29+in+a+porous+three-dimensional+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).</li>
<li>Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+characterization+and+current+application+in+orthopaedic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair.</a> Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stem+cells%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+embryonic+stem+cells+seeded+on+electrospun+nanofibers+into+neural+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages.</a> Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+nanofiber+scaffolds+with+different+orders%2C+structures%2C+and+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties.</a> ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anisotropy+in+electrospun+tissue+engineering+scaffolds%3A+analysis+of+fiber+alignment+by+the+fast+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform.</a> Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fiber+alignment+in+electrospun+scaffolds%3A+a+user%E2%80%99s+guide+to+the+2D+fast+Fourier+transform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Poly.+Ed%22%5BJournal%5D)">Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach.</a> J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytyczną częścią protokołu jest generowanie rusztowania gradientowego. Konieczne jest, aby maska zakrywająca kolektor poruszała się ze stałą prędkością, aby nastąpiła stopniowa zmiana w rusztowaniu światłowodowym. Prawidłowe przygotowanie roztworu PCL jest również ważne dla zapewnienia powodzenia elektroprzędzenia. Zaleca się sprawdzenie morfologii włókien przed elektroprzędzeniem, szczególnie po enkapsulacji kumaryny-6, która może wymagać wyższego napięcia do prawidłowego elektrowirowania. 
<p class='jo...

Nanowłókna są popularnym narzędziem w inżynierii tkankowej ze względu na ich zdolność do naśladowania macierzy zewnątrzkomórkowej w jej strukturze i względnym rozmiarze1. Jednak niektóre natywne interfejsy tkankowe, takie jak miejsce przyczepu ścięgna do kości, zawierają włókna kolagenowe, które wykazują zmienną strukturę organizacyjną, która zwiększa się w stosunku do ścięgna i zmniejsza się w miejscu kości2-5. Tak więc, aby zapewnić skuteczną regenerację tkanek, konieczne jest wyprodukowanie rusztowania, które mogłoby skutecznie naśladować ten gradient strukturalny.
Poprzednio prowadzono badania nad stopniowymi zmianami w składzie włókien, a konkretnie w zawartości minerałów6. Jednak odtworzenie składnika strukturalnego tkanek łącznych pozostaje w dużej mierze niezbadane. We wcześniejszym badaniu zbadano gradienty morfologiczne, badając wpływ powierzchniowej gęstości cząstek krzemionki na proliferację osteoblastów kalwarialnych szczurów i stwierdzono odwrotną zależność między gęstością cząstek krzemionki a proliferacją komórek7. Ale zmiany morfologiczne, które pośredniczyły w proliferacji komórek w poprzednich pracach, były głównie związane z chropowatością powierzchni, która nie była w stanie naśladować zmian organizacyjnych włókien7,8. W jednym z ostatnich badań podjęto próbę wytworzenia rusztowania, które naśladowałoby unikalną orientację włókien kolagenowych przy użyciu nowatorskiego kolektora doelektroprzędzenia. Chociaż w tym badaniu udało się wytworzyć rusztowanie z zarówno wyrównanymi, jak i losowymi włóknami, nie udało się naśladować stopniowych zmian wykazywanych w tkankach natywnych. Ponadto, przy wytwarzaniu oddzielnych komponentów, przy natychmiastowej zmianie orientacji z wyrównanej na losową, właściwości biomechaniczne tego rusztowania znacznie się zmniejszyły. Żadne wcześniejsze prace nie były w stanie wyprodukować odpowiednich rusztowań z nanowłókien z ciągłymi gradacjami orientacji włókien od wyrównanych i losowych. Nasze ostatnie badanie wykazało udane odtworzenie rusztowań z nanowłókien z gradacją organizacji włókien, które mogą potencjalnie naśladować natywną organizację kolagenu przy przyczepie ścięgna do kości10. Praca ta ma na celu przedstawienie protokołów stosowanych do produkcji rusztowań z nanowłókien o strukturze bardzo zbliżonej do organizacji włókien na granicy natywnej tkanki ścięgno-kostnej.
Gradientowe struktury nanowłókien mają potencjalnie daleko idące zastosowania w różnych dziedzinach. Skupiliśmy się na zastosowaniach w inżynierii tkankowej miejsca przyczepu ścięgna do kości, łącząc nasze rusztowania z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC), które są już wykorzystywane do regeneracji tkanek na różnych podłożach11-14. Ponadto ADSC są z natury bardzo podobne do komórek macierzystych szpiku kostnego pod względem wielomocy, a ich zasoby są obfite, można je pobrać za pomocą prostej procedury liposukcji15,16. Umieszczanie tych komórek na stopniowanych rusztowaniach z nanowłókien dodatkowo zwiększa ich zastosowania w inżynierii tkankowej, umożliwiając kontrolowaną dystrybucję komórek, które mogą potencjalnie różnicować się w różne tkanki. Oprócz wysiewu komórek macierzystych, nanowłókna mogą być otoczone cząsteczkami sygnałowymi w celu regulacji odpowiedzi komórkowej. Sprzężenie nanoenkapsulacji z gradientem organizacyjnym tych rusztowań pozwala na badanie zachowania komórek lub możliwych projektów i powłok implantów. Enkapsulacja funkcjonalnych cząsteczek, takich jak białko morfogenetyczne kości 2 (BMP2), które, jak wykazano, indukuje różnicowanie osteoblastów15,16, może jeszcze bardziej wzmocnić zastosowania tych rusztowań w inżynierii tkankowej10.

<table><tbody><tr><td>Polikaprolakton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Fisher Chemical</td><td>D-119-1</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher Chemical</td><td>AC61093-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kumaryna 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546283</td><td></td></tr><tr><td>Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej</td><td>Technologie inżynierii komórkowej</td><td>HMSC. AD-100</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td> Life <td>Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Zmodyfikowany Eagle's Medium</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>s25120a</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>VWR international, LLC</td><td>101412-842</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td>Pojedyncza strzykawka</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td> <td>wysokiego napięcia DCBadania wysokiego napięcia gamma</td><td>ES30</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td>Nova 2300</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table>

rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Celem tego protokołu jest przedstawienie prostej metody generowania rusztowań z nanowłókien z gradacją w organizacji włókien i przetestowanie ich możliwych zastosowań w kontrolowaniu morfologii/orientacji komórek. Organizacja nanowłókien jest kontrolowana za pomocą nowego aparatu produkcyjnego, który umożliwia stopniowe zmniejszanie organizacji włókien w rusztowaniu. Zmiana ułożenia włókien uzyskuje się poprzez skrócenie czasu osadzania losowych włókien elektroprzędzonych na jednoosiowo wyrównanej macie światłowodowej. Dzięki pokryciu kolektora ruchomą barierą/maską, wzdłuż tej samej osi co osadzanie włókien, struktura organizacyjna jest łatwo kontrolowana. Dla celów inżynierii tkankowej komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wysiewane do tych rusztowań. Komórki macierzyste ulegają zmianom morfologicznym w wyniku ich umiejscowienia w zróżnicowanej strukturze organizacyjnej i mogą potencjalnie różnicować się w różne typy komórek w zależności od ich lokalizacji. Dodatkowo stopniowana organizacja włókien poprawia biomimikrę rusztowań z nanowłókien, dzięki czemu bardziej przypominają one naturalne orientacje nanowłókien kolagenowych w miejscu przyczepu ścięgna do kości w porównaniu z tradycyjnymi rusztowaniami. Dzięki nanokapsułkowaniu, stopniowane włókna dają również możliwość konstruowania gradientów chemicznych w rusztowaniach włóknistych, a tym samym jeszcze bardziej wzmacniają swoje potencjalne zastosowania w szybkich badaniach przesiewowych interakcji komórka-materiały i regeneracji tkanek międzyfazowych. Technika ta umożliwia produkcję rusztowań o ciągłym gradiencie, ale może również potencjalnie wytwarzać włókna w dyskretnych krokach, kontrolując ruch ruchomej bariery/maski w dyskretny sposób.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na utworzenie maty z włókien o gradiencie organizacyjnym. Rysunek 3 przedstawia obrazy SEM wykonane w różnych miejscach rusztowania nanowłóknistego. Jakościowo można stwierdzić przejście od włókien wyrównanych jednowymiarowo w punkcie 0 mm (Rysunek 3A) do przypadkowego układu włókien w punkcie 6 mm (Rysunek 3D). Analiza FFT pozwala na ilościowe określenie stopnia wyrównania włókien; szczegóły dotyczące procesów ilościowych opi...

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Ta technika wytwarzania umożliwia produkcję rusztowań nanowłóknistych z gradientem organizacji włókien. Gradacyjna organizacja zwiększa użyteczność rusztowań nanowłóknistych w dziedzinie biomedycznej. Elektroprzędzenie pozwala na wytwarzanie nanowłóknistych rusztowań o dużej powierzchni właściwej.Wytwarzanie odbywa się poprzez połączenie polimeru z lotnym rozpuszczalnikiem, a następnie przesuwanie tego roztworu ze stałą prędkością przez strzykawkę; przyłożone wysokie napięcie ładuje roztwór i wydłuża polimer w momencie jego uwalniania z końcówki igły. Wynikiem jest sucha polimerowa nanowłókno, którą można zbierać na kilka sposobów w zależności od zastosowania. W niniejszym protokole przędziono polimer polikaprolakton na kolektora szczelinowego w celu utworzenia równolegle ułożonego podłoża z włókien.Następnie zastosowaliśmy przesuwającą się stopniowo maskę do zakrycia tego podłoża podczas osadzania przypadkowych włókien PCL. Witam, nazywam się Carl Kalala, pochodzę z laboratorium dr. Xing.Przedstawiamy zespół z Katedry Nauk Farmaceutycznych oraz Programu Medycyny Regeneracyjnej Holland na Uniwersytecie Medycznym w Nebrasce. Dzisiaj zaprezentujemy protokół wytwarzania rusztowania na

electrospun-nanofiber-scaffolds-with-gradations-in-fiber-organization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Sztuczne podłoża z nanowłókien ze stopniowym układem włókien

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Techniki elektroprzędzenia pozwalają na tworzenie różnorodnych rusztowań nanowłóknistych do inżynierii tkankowej lub innych zastosowań. Opisujemy tutaj procedurę optymalizacji parametrów roztworu i aparatury do elektroprzędzenia w celu uzyskania włókien o pożądanej morfologii i orientacji. Przedstawiono również typowe problemy oraz techniki rozwiązywania problemów.

Podstawy elektroprzędzenia: optymalizacja parametrów roztworu i aparatury

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ten protokół służy jako kompleksowa wytyczna do wytwarzania rusztowań za pomocą elektroprzędzenia z polimerami stopionymi w trybie bezpośredniego zapisu. Systematycznie nakreślamy proces i definiujemy odpowiednie ustawienia parametrów w celu osiągnięcia docelowych architektur rusztowań.

Zapis elektroprzędzenia ze stopu trójwymiarowych rusztowań poli(ε-kaprolaktonu) z kontrolowanymi morfologiami do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Poznaj metodę elektroprzędzenia nanowłókien z gradacją organizacji włókien z polikaprolaktonu. Technika ta umożliwia regulację morfologii i orientacji komórek w inżynierii tkankowej.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Przeglądaj więcej filmów