Mysi model cukrzycy typu 2 Lepr^db: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie żywotnych wysepek trzustkowych od myszy cukrzycowych LEP R DB oraz ocena wydzielania insuliny przez komórki beta w obrębie wysepek przy użyciu obrazowania dwufotonowego żywych komórek. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się odczynniki, takie jak mieszanina enzymów do trawienia trzustki, pożywki do hodowli wysepek oraz bufor zewnątrzkomórkowy do analizy dwufotonowej. Następnie otwiera się jamę brzuszną ueutanazowanej myszy i wstrzykuje mieszaninę enzymów do trzustki w celu strawienia narządu.

Następnie wysepki oddziela się od trawionego trzustki i poddaje hodowli. Na koniec, przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, obrazuje się fuzje pojedynczych ziarn insulinowych w komórkach beta wewnątrz wysepki. Ostatecznie protokół ten pomoże badaczom zrozumieć, w jaki sposób wydzielanie insuliny jest kontrolowane w warunkach zdrowia i choroby.

Głównym ulepszeniem techniki izolacji wysepek jest zastosowanie mieszanych enzymów w celu zwiększenia wydajności oraz żywotności wysepek. Technika obrazowania dwufotonowego jest obecnie jedyną metodą pozwalającą na rejestrację sekrecji insuliny z wielu komórek w obrębie nienaruszonej wysepki. Aby przygotować enzymy do izolacji wysepek trzustkowych, należy rozcieńczyć jedną fiolkę zawierającą 5 mg liase TL w 26 ml DM EM, a kolagenazę typu IV w buforze Hanksa przygotować do stężenia 0,5 mg/ml, uzupełniając ją następującymi roztworami mieszanymi liase TL i kolagenazy.

W stosunku objętościowym cztery do jednego podziel mieszaninę enzymów na aalikwoty po 2,5 milliliters każda i przechowuj w temperaturze negative 20 degrees Celsius. Aby przygotować podłoże izolacyjne RPMI, w dużej kolbie stożkowej zawierającej jeden liter wody rozpuść w temperaturze pokojowej jedną fiolkę proszku RPMI 1 6 4 0 i uzupełnij o dwa grams wodorowęglanu sodu oraz 4,02 grams HEPES. Użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 7,4, następnie przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze four degrees Celsius.

Przygotować pożywkę hodowlaną RPMI, dodając 10% FBS oraz 1% antybiotyków do pożywki izolacyjnej RPMI do obrazowania dwufotonowego. Przygotować bufor pozakomórkowy bogaty w sód z następujących odczynników. Aby przygotować barwnik pozakomórkowy, sporządzić 8 mM roztwór zapasowy SRB w buforze pozakomórkowym, rozdzielić go do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20°C.

Aby uzyskać stężenie robocze, należy użyć świeżego buforu zewnątrzkomórkowego do rozcieńczenia roztworu SRB w stosunku 1:10. Po uśmierceniu myszy i dokładnym spryskaniu ciała zwierzęcia 70% etanolem zgodnie z protokołem tekstowym, należy ułożyć zwierzę głową w stronę chirurga, a ogonem w stronę przeciwną. Wykonać dwa długie cięcia boczne przez skórę brzucha i otrzewną, aby utworzyć płat w kształcie litery V.

Odchyl płat skóry, aby odsłonić całą jamę brzuszną. Odsuń jelita i za pomocą złożonej tkanki unieruchom wątrobę, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Następnie załóż zacisk naczyniowy na brodawkę na ścianie dwunastnicy, aby zablokować przedostawanie się wstrzykniętych enzymów do dwunastnicy.

Jest to ważny etap, który decyduje o tym, czy enzymy trzustkowe dostaną się do refluksu w przewodzie trzustkowym, do miejsca wstrzyknięcia, czy do dwunastnicy. Należy użyć igły o rozmiarze 31 G, aby przeprowadzić kaniulację wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu połączenia wspólnego przewodu wątrobowego z przewodem pęcherzykowym, pozostawiając miejsce na drugie wstrzyknięcie. Jeśli perfuzja trzustki nie powiedzie się za pierwszym razem, należy powoli wstrzyknąć około 2 mL zimnej mieszaniny enzymów do wspólnego przewodu żółciowego myszy.

Jeśli zacisk znajduje się w prawidłowej pozycji, trzustka zostanie szybko przepłukana. Po przepłukaniu trzustki należy szybko wyjąć organ, umieścić go w szklanej fiolce i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez około 19 minut. Po inkubacji należy zatrzymać proces trawienia, dodając około 20 ml zimnego medium izolacyjnego.

Delikatnie wstrząśnij fiolką, aby rozbić trzustkę, a następnie przelać zawartość przez zwykłe sito typu T o rozmiarze oczek 1 mm do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Dopełnij probówkę medium izolacyjnym i wiruj przy 400 G i 4°C przez jedną minutę. Po wyłączeniu wirowania dodaj medium izolacyjne do osadu i rozpuść go.

Następnie przenieś zawiesinę do dwóch probówek o pojemności 15 ml i odwiruj po raz drugi. Po odessaniu nadsączu dodaj sześć ml medium do separacji komórek w gradiencie gęstości do każdego osadu i resuspenduj za pomocą pipety lub wortexa. Następnie, prowadząc probówki bokiem, ostrożnie dodaj około sześciu ml medium izolacyjnego na wierzch medium do separacji w gradiencie gęstości i wiruj przy 100 G i temperaturze czterech °C przez 15 minut.

Po rozdzieleniu, zbierz górną, środkową i dolną warstwę do trzech osobnych naczyń. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, za pomocą pipety ręcznie wyzbieraj eyelety z trzech naczyń. Większość z nich znajdzie się w warstwie środkowej, co pomoże eyeletom zregenerować się po trawieniu enzymatycznym.

Przygotować grupy po 40 wysp w szalkach Petriego o średnicy 25 centymetrów z sześcioma mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10 milimolarnej glukozy i inkubować przez dwa dni. Pożywkę należy wymieniać codziennie, aby przeprowadzić obrazowanie dwufotonowe jako pośredni test do pomiaru wydzielania insuliny. Rozpocząć od zastosowania 3 milimolarnej glukozy w buforze zewnątrzkomórkowym do preinkubacji wysp inkubowanych przez dwa dni.

Przez 30 minut nakładaj smar na stolik mikroskopu, aby zapobiec wyciekowi roztworu, a następnie zamocuj na stoliku komorę termostatową zawierającą szkiełko przedmiotowe. Następnie wypełnij komorę 500 µL buforu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,8 mM SRB oraz różne stężenia glukozy. W kolejnym kroku umieść wcześniej inkubowany wyrostek w środku komory i ustaw ostrość na głębokości trzech do czterech warstw komórek wewnątrz wyrostka.

W wycinkach oka gryzonia barwienie immunocytochemiczne na insulinę wykazuje, że większość komórek to komórki beta. Następnie, przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i obiektywu imersyjnego olejowego 60 x, identyfikuje się pojedyncze zdarzenia egzocytozy poprzez nagłe pojawienie się małej fluorescencyjnej plamki. Na koniec, w oprogramowaniu do obrazowania skanującego, potwierdza się zdarzenie poprzez szybką fazę wzrostu sygnału fluorescencji w wyznaczonym obszarze zainteresowania dla myszy typu dzikiego.

Stosując protokół przedstawiony w tym filmie, oczekuje się uzyskania około 200 wysepek. Zdrowe wysepki są jasne, mają okrągły kształt i gładki brzeg. Z kolei w partiach izolacyjnych niedostatecznie trawionych wysepki są zazwyczaj małe i rozmyte, a do wysepek przytwierdzone są komórki asar.

Podczas gdy w przypadku partii poddanej nadmiernemu trawieniu w teście dwufotonowym obserwuje się mniej otworków w odpowiedzi na bodźce, takie jak glukoza lub wysokie stężenie potasu, ziarna insuliny zlewające się z błoną plazmatyczną są przenikane przez SRB, co skutkuje pojawieniem się nagłej fluorescencyjnej plamki o średnicy około 400 nanometrów. W zarejestrowanym czasie identyfikuje się wszystkie zdarzenia egzocytozy w odpowiedzi na bodziec oraz lokalizację zdarzeń, czas ich pojawienia się, czas trwania i rodzaj fuzji. Zdarzenia takie jak KISS and Run lub pełna fuzja są charakteryzowane i stanowią cenny materiał do oceny wszelkich defektów fuzji ziarn w modelach cukrzycy typu drugiego.

Metodę tę zastosowano, aby wykazać, że defekt w wysepkach osób z cukrzycą (myszy DB DB) polega na utracie pełnej fuzji ziarnistości, a nie na zmianie kinetyki fuzji poszczególnych ziarnistości. Ponadto najważniejszym czynnikiem wpływającym na zmniejszone wydzielanie insuliny w przebiegu choroby jest redukcja liczby komórek responsywnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść gruntowną wiedzę na temat perfuzji trzustki i aktywacji wysepek z lewej strony u myszy RDB, a także potrafić przeprowadzić oba testy w celu oceny odpowiedzi wydzielniczej w obrębie nienaruszonych wysepek.