Name: Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj izolację wysp trzustkowych z myszy Leprdb i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek beta. Ta metoda pozwala badać mechanizmy sekrecji insuliny w cukrzycy typu 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych DP110100642 (dla PT) oraz Granty Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych APP1002520 i APP1059426 (dla PT i HYG).

UWAGA: Wszystkie obecne eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi procedurami etyki zwierząt Uniwersytetu Queensland (zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Nauk Anatomicznych Uniwersytetu Queensland).
1. Izolacja wysepek
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>Mieszanina enzymów
		<ol>
			<li>Do trawienia trzustki użyj mieszaniny liberazy i kolagenazy typu IV. Rozcieńczyć liberazę TL (nisko osadzoną termolizynę) w 1 fiolce po 5 mg w 26 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).</li>
			<li>Przygotować kolagenazę typu IV w buforze Hanka o stężeniu 0,5 mg / ml, uzupełnioną 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNAzy i 1 mg / ml albuminy surowicy bydlęcej.</li>
			<li>Roztwory liberazy TL i kolagenazy zmieszać w stosunku 4:1 (objętościowo), tj. 4 ml liberazy TL + 1 ml kolagenazy. Podwielokrotnić mieszaninę enzymów do objętości 2,5 ml każdy i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
			UWAGA: Czas inkubacji tkanek różni się nieco między partiami enzymu (różnica od 30 sekund do 1 minuty). W związku z tym może być wymagane przeprowadzenie badania partii.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nośniki izolacyjne RPMI
		<ol>
			<li>Rozpuścić jedną fiolkę proszku RPMI 1640 w 1 l wody o temperaturze pokojowej i uzupełnić 2 g NaHCO3, 4,02 g HEPES.</li>
			<li>Połączyć pożywkę izolacyjną RPMI w dużej stożkowej kolbie, wymieszać z mieszadłem magnetycznym, dostosować do pH 7,4 za pomocą NaOH, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pożywki hodowlane RPMI</li>
		<li>Stosować pożywki hodowlane RPMI zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków (tj. penicylina 100 j./ml, streptomycyna 100 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i hodowla wysepek
	<ol>
		<li>Składanie ofiar ze zwierząt
		<ol>
			<li>Składaj ofiary na myszy przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2 zgodnie z procedurami etycznymi lokalnej instytucji. Spryskaj korpus myszy dokładnie 70% etanolem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Perfuzja trzustkowa
		<ol>
			<li>Użyj 2 długich nacięć bocznych przez skórę brzucha i otrzewną, aby uzyskać płat w kształcie litery V. Pociągnij płat skóry do góry, aby odsłonić całą jamę brzuszną, odłóż na bok jelito i przytrzymaj wątrobę na miejscu za pomocą złożonej bibuły, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy (ryc. 1 i 2). Ustaw zwierzę tak, aby głowa była skierowana w stronę chirurga, a ogon z dala od chirurga.</li>
			<li>Założyć zacisk naczyniowy na bańkę na ścianie dwunastnicy, aby zablokować wstrzykiwane enzymy przed dostaniem się do dwunastnicy (ryc. 1). 
			UWAGA: Jest to ważny krok, ponieważ określa, czy wstrzyknięte enzymy wejdą do przewodu trzustkowego i przeprowadzą perfuzję trzustki, czy też cofną się do miejsca wstrzyknięcia (za klamrą) lub trafią do dwunastnicy (pod zaciskiem).</li>
			<li>Wprowadzić kaniulację przewodu żółciowego wspólnego za pomocą igły 31 G w pobliżu połączenia przewodu wątrobowego wspólnego i przewodu torbielowatego (ryc. 1) i pozostawić miejsce na drugie wstrzyknięcie, jeśli trzustka nie dojdzie do perfuzji za pierwszym razem. Powoli (ponad ~10 sekund) wstrzyknąć około 2 ml mieszaniny zimnych enzymów do przewodu żółciowego wspólnego myszy. 
			UWAGA: Trzustka zostanie szybko ukrwiona, jeśli zacisk jest we właściwej pozycji.</li>
			<li>Dostosuj pozycję zacisku, jeśli igła znajduje się wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego, ale nie może przeniknąć przez trzustkę (tj. przesuń zacisk nieco w górę od wątroby, jeśli jest nadmiernie zaciśnięty, lub przesuń go nieco w dół do wątroby, jeśli jest zaciśnięty). 
			UWAGA: Igła czasami wchodzi do otaczającej kapsułki, a nie do światła kanału. Przydatnym znakiem do sprawdzenia, czy igła znajduje się wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego, jest rozszerzenie przewodu podczas wstrzykiwania. Jeśli trzustka nie ulega perfuzji, alternatywą jest to, że mieszanina enzymów może zostać wstrzyknięta do wielu miejsc trzustki z oczekiwaną niższą wydajnością. Perfuzja lewej części trzustki (płata śledziony) jest ważna dla maksymalizacji wydajności wysp trzustkowych.</li>
			<li>Po perfuzji trzustki należy szybko usunąć trzustkę, umieścić ją w fiolce (~20 ml, szkło) i inkubować przez ~19 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
			UWAGA: Czas inkubacji może się nieco różnić w zależności od odmiany i wieku myszy.</li>
			<li>Po czasie inkubacji należy przerwać proces trawienia poprzez dodanie ~20 ml zimnej pożywki izolacyjnej. Delikatnie wstrząsnąć fiolką, aby rozerwać pracę trzustki, a następnie przelać ją przez zwykłe sitko do herbaty (średnica porów 1 mm) do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Uzupełnić probówkę pożywką izolacyjną i wirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C z wyłączonym hamulcem.</li>
			<li>Ponownie rozpuścić osad w pożywce izolacyjnej i przenieść do dwóch probówek o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4°C z wyłączonym hamulcem. Po aspiracji supernatantu dobrze wymieszać dwa granulki z 6 ml pożywki do separacji komórek o gradionym gradiencie gęstości (roztwór histopaque 1077) na probówkę, wirując lub pipetując w górę iw dół. Następnie delikatnie dodać ~6 ml pożywki izolacyjnej na bok probówki na wierzchu pożywki do separacji o gradiacji gęstości i odwirować przy 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C z wyłączonym hamulcem.</li>
			<li>Zebrać supernatant w górnej (pożywka izolacyjna), środkowej i dolnej (pożywka do separacji komórek z gradientem gęstości) w 3 oddzielnych naczyniach. Ręcznie wybierz wysepki w tych 3 naczyniach za pomocą pipety pod mikroskopem preparacyjnym. 
			UWAGA: Środkowa warstwa zawiera większość wysepek. Wysepki są rozpoznawane jako zwarte struktury o wielkości od ~ 50 do 500 μm (ryc. 3). Otrzymujemy ~200 wysepek u myszy WT i 300-<100 wysepek u myszy db/db.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hodowla wysepek
		<ol>
			<li>Aby pomóc wyspom trzustkowym w regeneracji po trawieniu enzymatycznym, należy wyhodować grupy 40 wysepek na 25-centymetrowej szalce Petriego z 6 ml pożywki hodowlanej RPMI (10 mM glukozy) w temperaturze 37 °C, 5% /95% CO2/O2 przez 2 dni przed obrazowaniem 2-fotonów żywych komórek. Codziennie zmieniaj pożywki hodowlane. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie 2-fotonowe na żywo komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>Bufor zewnątrzkomórkowy
		<ol>
			<li>Przygotować bogaty w sód bufor zewnątrzkomórkowy do testu 2-fotonowego ze 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3 i 10 mM HEPES.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwnik zewnątrzkomórkowy
		<ol>
			<li>Do testu 2-fotonowego przygotować podstawowy SRB 8 mM w buforze zewnątrzkomórkowym, podzielić na porcje do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć podstawowy SRB w stosunku 1:10 w świeżym buforze zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać stężenie robocze 0,8 mM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie fotonowe
	<ol>
		<li>Najpierw należy wstępnie inkubować 2-dniowe hodowane wyspy trzustkowe w zewnątrzkomórkowym buforze 3 mM glukozy przez 30 min. 
		UWAGA: Używamy wysepek od 2 do 5 dni w hodowli.</li>
		<li>Następnie umieść szkiełko szkiełkowe w komorze termoregulacyjnej zamontowanej na stoliku mikroskopu. Użyj smaru, aby zapobiec wyciekaniu roztworu.</li>
		<li>Przykryj komorę 500 μl buforu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,8 mM SRB o różnych stężeniach glukozy (3 mM, 6 mM, 15 mM i 20 mM glukozy).</li>
		<li>Następnie umieść wstępnie inkubowaną wyspę trzustkową na środku komory i skup się na 3-4 warstwach komórek w wysepce, gdzie u wysepek gryzoni barwienie immunologiczne insuliny pokazuje, że większość komórek to komórki beta. 
		UWAGA: SRB szybko obrysuje całą błonę komórkową wyspy trzustkowej, a wyspa jest gotowa do obrazowania.</li>
		<li>Użyj mikroskopu 2-fotonowego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 60X (NA 1.42) i oprogramowaniem do obrazowania (np. ScanImage 11). Rysunek 4 ilustruje typowy układ mikroskopowy. Obrazowanie zdarzeń egzocytarnych przy użyciu SRB jako nieprzepuszczalnego dla błony fluorescencyjnego markera zewnątrzkomórkowego wzbudzonego femtosekundowymi impulsami laserowymi przy 880 nm, z fluorescencją wykrytą przy 550-650 nm. Rejestruj reakcje wysp trzustkowych na stymulację.</li>
		<li>Zidentyfikuj pojedyncze zdarzenia egzocytarne na podstawie nagłego pojawienia się małej plamki fluorescencyjnej (rozdzielczość 10 pikseli/μm) i potwierdź przez szybko narastającą fazę sygnału fluorescencyjnego w obszarze zainteresowania (~0,78 μm2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najbardziej krytycznym czynnikiem w izolacji wysp trzustkowych jest początkowa perfuzja trzustki; Niedokrwiona trzustka powoduje znacznie niższy plon wysp trzustkowych. Na jakość izolacji wpływają również inne czynniki, takie jak czas trawienia i poziom wstrząsania, które mogą częściowo zrekompensować poziom perfuzji. Na przykład w pełni perfundowana trzustka będzie musiała być inkubowana w temperaturze 37 °C przez ~18 minut 30 sekund, delikatnie potrząsając, natomiast niedotrawiona trzustka może wymagać ~20 minut trawie...

Rola dysfunkcji komórek beta w chorobach została powszechnie uznana 3,4. Linie komórkowe, takie jak MIN6 i INS-1, są użytecznymi narzędziami do zrozumienia biologii zachowania komórek beta. Jednak fizjologiczna kontrola wydzielania insuliny odbywa się w obrębie wysepek Langerhansa. Wysepki te zawierają tysiące ciasno upakowanych komórek beta, a także naczynia krwionośne i inne typy komórek endokrynnych. To środowisko w obrębie wyspy trzustkowej wpływa na wydzielanie insuliny i może być ważne w cukrzycy. Dlatego, aby zrozumieć fizjologiczną kontrolę wydzielania insuliny i patofizjologię choroby, konieczne jest zbadanie nienaruszonych wysp trzustkowych.
Izolacja wysepek
Żywe ludzkie wyspy trzustkowe, a w szczególności ludzkie wyspy trzustkowe od pacjentów z cukrzycą typu 2, są trudne do zdobycia. Ponadto ludzkie wyspy trzustkowe mają ograniczone możliwości eksperymentalnej manipulacji molekularnej. W związku z tym naukowcy wykorzystali wysepki pochodzące od zwierząt i zwierzęce modele cukrzycy typu 2. Jednym z takich modeli choroby jest mysz db/db. Jest to spontaniczna mutacja, która modeluje cukrzycę typu 2 z progresją fenotypu, która jest ściśle równoległa do choroby u człowieka 5,6. Przedstawiony tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych od myszy z cukrzycą db / db ma wiele wspólnych etapów z innymi grupami z pewnymi udoskonaleniami w celu lepszej wydajności, oczyszczania i zwiększonej przeżywalności wysp trzustkowych.
2 obrazowanie fotonów
Opisany tutaj test 2-fotonowy na żywych komórkach umożliwia badaczom ilościowe określenie liczby i ocenę cech pojedynczych granulek zawierających insulinę z wielu komórek wysepek typucukrzycowego 7 i dzikich 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td></td> <td>Roche-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>do przygotowania podłoża izolacyjnego</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>do przygotowania pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>do przygotowania pożywek hodowlanych&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>do przygotowania pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>do rozcieńczenia liberazy</td></tr><tr><td>Program Metamorph</td><td>Devices, USA</td><td></td><td>do analizy obrazów 2-fotonowych</td></tr></tbody></table>

mysi model cukrzycy typu 2 leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Cukrzyca typu 2 jest chorobą przewlekłą, która dotyka 382 miliony ludzi w 2013 roku i oczekuje się, że wzrośnie do 592 milionów do 2035 roku 1. W ciągu ostatnich 2 dekad rola dysfunkcji komórek beta w cukrzycy typu 2 została wyraźnie ustalona 2. Postęp badań wymaga metod izolacji wysp trzustkowych. Przedstawiony tutaj protokół izolacji wysepek ma wiele wspólnych kroków z protokołami z innych grup, z pewnymi modyfikacjami w celu poprawy wydajności i jakości izolowanych wysepek zarówno od myszy typu dzikiego, jak i myszy z cukrzycą Leprdb (db / db). Następnie przedstawiono metodę obrazowania 2-fotonowego żywych komórek, która może być wykorzystana do zbadania kontroli wydzielania insuliny w wyspach trzustkowych.

Wydajność i oczyszczanie wysp
W przypadku normalnej myszy typu dzikiego oczekuje się uzyskania około 200 wysp. Zdrowe wyspy są jasne, mają okrągły kształt i gładką krawędź. Partia izolacji poddana zbyt silnej trawieniu zwykle zawiera małe i rozmyte wyspy, natomiast partia niedostatecznie strawiona charakteryzuje się mniejszą liczbą wysp oraz obecnością wysp z przytwierdzonymi komórkami acinarnymi (Rycina 3). W przypadku cukrzycowych myszy db/db wydajność i wygląd wysp zależą o...

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie żywotnych wysepek trzustkowych od myszy cukrzycowych LEP R DB oraz ocena wydzielania insuliny przez komórki beta w obrębie wysepek przy użyciu obrazowania dwufotonowego żywych komórek. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się odczynniki, takie jak mieszanina enzymów do trawienia trzustki, pożywki do hodowli wysepek oraz bufor zewnątrzkomórkowy do analizy dwufotonowej. Następnie otwiera się jamę brzuszną ueutanazowanej myszy i wstrzykuje mieszaninę enzymów do trzustki w celu strawienia narządu.Następnie wysepki oddziela się od trawionego trzustki i poddaje hodowli. Na koniec, przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, obrazuje się fuzje pojedynczych ziarn insulinowych w komórkach beta wewnątrz wysepki. Ostatecznie protokół ten pomoże badaczom zrozumieć, w jaki sposób wydzielanie insuliny jest kontrolowane w warunkach zdrowia i choroby.Głównym ulepszeniem techniki izolacji wysepek jest zastosowanie mieszanych enzymów w celu zwiększenia wydajności oraz żywotności wysepek. Technika obrazowania dwufotonowego jest obecnie jedyną metodą pozwalającą na rejestrację sekrecji insuliny z wielu komórek w obrębie nienaruszonej wysepki. Aby przygotować enzymy do izolacji wysepek trzustkowych, należy rozcieńczyć jedną fiolkę zawierającą 5 mg liase TL w 26 ml DM EM, a kolagenazę typu IV w buforze Hanksa przygotować do stężenia 0,5 mg/ml, uzupełniając ją następującymi roztworami mieszanymi liase TL i kolagenazy.W stosunku objętościowym cztery do jednego podziel mieszaninę enzymów na aalikwoty po 2,5 milliliters każda i przechowuj w temperaturze negative 20 degrees Celsius. Aby przygotować podłoże izolacyjne RPMI, w dużej kolbie stożkowej zawierającej jeden liter wody rozpuść w temperaturze pokojowej jedną fiolkę proszku RPMI 1 6 4 0 i uzupełnij o dwa grams wodorowęglanu sodu oraz 4,02 grams HEPES. Użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 7,4, następnie przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze four degrees Celsius.Przygotować pożywkę hodowlaną RPMI, dodając 10% FBS oraz 1% antybiotyków do pożywki izolacyjnej RPMI do obrazowania dwufotonowego. Przygotować bufor pozakomórkowy bogaty w sód z następujących odczynników. Aby przygotować barwnik pozakomórkowy, sporządzić 8 mM roztwór zapasowy SRB w buforze pozakomórkowym, rozdzielić go do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20°C.Aby uzyskać stężenie robocze, należy użyć świeżego buforu zewnątrzkomórkowego do rozcieńczenia roztworu SRB w stosunku 1:10. Po uśmierceniu myszy i dokładnym spryskaniu ciała zwierzęcia 70% etanolem zgodnie z protokołem tekstowym, należy ułożyć zwierzę głową w stronę chirurga, a ogonem w stronę przeciwną. Wykonać dwa długie cięcia boczne przez skórę brzucha i otrzewną, aby utworzyć płat w kształcie litery V.Odchyl płat skóry, aby odsłonić całą jamę brzuszną. Odsuń jelita i za pomocą złożonej tkanki unieruchom wątrobę, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Następnie załóż zacisk naczyniowy na brodawkę na ścianie dwunastnicy, aby zablokować przedostawanie się wstrzykniętych enzymów do dwunastnicy.Jest to ważny etap, który decyduje o tym, czy enzymy trzustkowe dostaną się do refluksu w przewodzie trzustkowym, do miejsca wstrzyknięcia, czy do dwunastnicy. Należy użyć igły o rozmiarze 31 G, aby przeprowadzić kaniulację wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu połączenia wspólnego przewodu wątrobowego z przewodem pęcherzykowym, pozostawiając miejsce na drugie wstrzyknięcie. Jeśli perfuzja trzustki nie powiedzie się za pierwszym razem, należy powoli wstrzyknąć około 2 mL zimnej mieszaniny enzymów do wspólnego przewodu żółciowego myszy.Jeśli zacisk znajduje się w prawidłowej pozycji, trzustka zostanie szybko przepłukana. Po przepłukaniu trzustki należy szybko wyjąć organ, umieścić go w szklanej fiolce i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez około 19 minut. Po inkubacji należy zatrzymać proces trawienia, dodając około 20 ml zimnego medium izolacyjnego.Delikatnie wstrząśnij fiolką, aby rozbić trzustkę, a następnie przelać zawartość przez zwykłe sito typu T o rozmiarze oczek 1 mm do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Dopełnij probówkę medium izolacyjnym i wiruj przy 400 G i 4°C przez jedną minutę. Po wyłączeniu wirowania dodaj medium izolacyjne do osadu i rozpuść go.Następnie przenieś zawiesinę do dwóch probówek o pojemności 15 ml i odwiruj po raz drugi. Po odessaniu nadsączu dodaj sześć ml medium do separacji komórek w gradiencie gęstości do każdego osadu i resuspenduj za pomocą pipety lub wortexa. Następnie, prowadząc probówki bokiem, ostrożnie dodaj około sześciu ml medium izolacyjnego na wierzch medium do separacji w gradiencie gęstości i wiruj przy 100 G i temperaturze czterech °C przez 15 minut.Po rozdzieleniu, zbierz górną, środkową i dolną warstwę do trzech osobnych naczyń. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, za pomocą pipety ręcznie wyzbieraj eyelety z trzech naczyń. Większość z nich znajdzie się w warstwie środkowej, co pomoże eyeletom zregenerować się po trawieniu enzymatycznym.Przygotować grupy po 40 wysp w szalkach Petriego o średnicy 25 centymetrów z sześcioma mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10 milimolarnej glukozy i inkubować przez dwa dni. Pożywkę należy wymieniać codziennie, aby przeprowadzić obrazowanie dwufotonowe jako pośredni test do pomiaru wydzielania insuliny. Rozpocząć od zastosowania 3 milimolarnej glukozy w buforze zewnątrzkomórkowym do preinkubacji wysp inkubowanych przez dwa dni.Przez 30 minut nakładaj smar na stolik mikroskopu, aby zapobiec wyciekowi roztworu, a następnie zamocuj na stoliku komorę termostatową zawierającą szkiełko przedmiotowe. Następnie wypełnij komorę 500 µL buforu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,8 mM SRB oraz różne stężenia glukozy. W kolejnym kroku umieść wcześniej inkubowany wyrostek w środku komory i ustaw ostrość na głębokości trzech do czterech warstw komórek wewnątrz wyrostka.W wycinkach oka gryzonia barwienie immunocytochemiczne na insulinę wykazuje, że większość komórek to komórki beta. Następnie, przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i obiektywu imersyjnego olejowego 60 x, identyfikuje się pojedyncze zdarzenia egzocytozy poprzez nagłe pojawienie się małej fluorescencyjnej plamki. Na koniec, w oprogramowaniu do obrazowania skanującego, potwierdza się zdarzenie poprzez szybką fazę wzrostu sygnału fluorescencji w wyznaczonym obszarze zainteresowania dla myszy typu dzikiego.Stosując protokół przedstawiony w tym filmie, oczekuje się uzyskania około 200 wysepek. Zdrowe wysepki są jasne, mają okrągły kształt i gładki brzeg. Z kolei w partiach izolacyjnych niedostatecznie trawionych wysepki są zazwyczaj małe i rozmyte, a do wysepek przytwierdzone są komórki asar.Podczas gdy w przypadku partii poddanej nadmiernemu trawieniu w teście dwufotonowym obserwuje się mniej otworków w odpowiedzi na bodźce, takie jak glukoza lub wysokie stężenie potasu, ziarna insuliny zlewające się z błoną plazmatyczną są przenikane przez SRB, co skutkuje pojawieniem się nagłej fluorescencyjnej plamki o średnicy około 400 nanometrów. W zarejestrowanym czasie identyfikuje się wszystkie zdarzenia egzocytozy w odpowiedzi na bodziec oraz lokalizację zdarzeń, czas ich pojawienia się, czas trwania i rodzaj fuzji. Zdarzenia takie jak KISS and Run lub pełna fuzja są charakteryzowane i stanowią cenny materiał do oceny wszelkich defektów fuzji ziarn w modelach cukrzycy typu drugiego.Metodę tę zastosowano, aby wykazać, że defekt w wysepkach osób z cukrzycą (myszy DB DB) polega na utracie pełnej fuzji ziarnistości, a nie na zmianie kinetyki fuzji poszczególnych ziarnistości. Ponadto najważniejszym czynnikiem wpływającym na zmniejszone wydzielanie insuliny w przebiegu choroby jest redukcja liczby komórek responsywnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść gruntowną wiedzę na temat perfuzji trzustki i aktywacji wysepek z lewej strony u myszy RDB, a także potrafić przeprowadzić oba testy w celu oceny odpowiedzi wydzielniczej w obrębie nienaruszonych wysepek.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model myszy Leprdb cukrzycy typu 2: Izolowanie wysepek trzustkowych i obrazowanie żywych wysepek za pomocą techniki 2-fotonowej

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Ten film demonstruje metodę opartą na obrazowaniu, aby zwizualizować przeszczepione komórki beta z ekspresją lucyferazy do nieotyłej myszy z cukrzycą z niedoborem odporności. Wprowadzenie splenocytów od myszy z cukrzycą prowadzi do postępującego niszczenia komórek beta, co jest wizualnie potwierdzone spadkiem luminescencji po wprowadzeniu substratu.

Obrazowanie transgenicznych komórek beta u myszy z niedoborem odporności i prowokacją ze splenocytami cukrzycowymi

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo.  Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Opisujemy protokół wizualizacji egzocytozy insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą pHluoryny, wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji. Izolowane wysepki są zakażone adenowirusem kodującym pHluorynę sprzężoną z neuropeptydem Y ładunku pęcherzyka. Pozwala to na wykrycie zdarzeń fuzji granulek insuliny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj izolację wysp trzustkowych z myszy Leprdb i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek beta. Ta metoda pozwala badać mechanizmy sekrecji insuliny w cukrzycy typu 2.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal

Mysi model cukrzycy typu 2 Lepr^db: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Przeglądaj więcej filmów