Name: Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj metodę pionowego obrazowania komór jajowych Drosophila melanogaster w celu wizualizacji organizacji komórkowej w nabłonku pęcherzykowym. Technika ta wykorzystuje mikroskopię konfokalną i fluorescencyjne barwienie przeciwciałami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Doceniamy pomoc od członków społeczności much, szczególnie dr Denise Montell, dr Lynn Cooley i dr Pernille Rorth, w zakresie odczynników. Dziękujemy Flybase, Bloomington Drosophila Stock Center i Developmental Studies Hybridoma Bank za informacje i dostarczenie odpowiednio zapasów much i przeciwciał. LM jest wspierany przez Grant Departamentu Edukacji, stypendium szkoleniowe Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) (P200A120017) oraz przez NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). Część prac mikroskopowych była wspierana przez grant NSF MRI DBI-0722569 oraz Keith R. Porter Core Imaging Facility. Badania były częściowo wspierane przez NSF CAREER Award (1054422) i Basil O'Connor Starter Scholar Award od March of Dimes, obie przyznane MSG.

1. Rozwarstwienie jajników
<ol>
	<li>Przenieś około piętnastu 2-4-dniowych samic much i kilku samców do fiolki ze świeżym pokarmem dla much z dodatkiem aktywnych suchych drożdży. Użyj bawełny jako zatyczki do fiolek i dodaj kilka kropel wody do bawełny, aby utrzymać wysoką wilgotność.</li>
	<li>Umieść fiolkę w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 14-16 godzin, aby zmaksymalizować liczbę komór na jaja etapu 8-10. 
	UWAGA: Czas inkubacji różni się w zależności od temperatury i pożądanego etapu.</li>
	<li>Przygotować pożywki preparacyjne, 0,1 M roztwory KPO4 i NP40 zgodnie z potrzebami na następny dzień (patrz Materiały).</li>
	<li>Znieczulić muchy za pomocą CO2 i umieścić pod mikroskopem preparacyjnym. Odpipetować kilka kropli pożywki preparacyjnej do każdej wnęki w szkiełku wgłębieniowym.</li>
	<li>Trzymaj kleszcze w każdej ręce pod kątem około 30° do blatu stołu i ustaw jedną samicę muchy skrzydłami w dół. Ręką niedominującą podnieś samicę za pomocą kleszczy, chwytając ją w przedniej części brzucha, w pobliżu klatki piersiowej i zanurz ją w pożywce preparacyjnej w szkiełku wgłębienia (ryc. 1A wstawka).</li>
	<li>Drugą parą kleszczy chwyć egzoszkielet w brzusznej tylnej części brzucha i przebij na wylot. Chwyć jajniki na tylnym końcu, a następnie wyciągnij je z brzucha i umieść w świeżej pożywce po drugiej stronie szkiełka wgłębienia. (Rysunek 1A wstawka). Unikaj rozrywania jelit. Wyrzucić tuszę.</li>
	<li>Powtarzaj z innymi samicami much, aż wszystkie jajniki zostaną wypreparowane. Odrzuć samce.</li>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczy przytrzymaj jajnik na tylnym końcu (w pobliżu największych komór jajowych), a drugą ręką użyj pary kleszczy, aby uszczypnąć jedną z najbardziej wysuniętych do przodu komór jajowych (germarium). (Rysunek 1A).</li>
	<li>Powoli i równomiernie wyciągnij łańcuch jajnika z pochewki jajnika. Kontynuuj wycinanie jajników pojedynczo, aż wszystkie pożądane komory jajowe zostaną usunięte.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.7-1.8 dla wszystkich wypreparowanych jajników.</li>
	<li>Po zakończeniu przenieś jajniki do probówki o pojemności 0,6 ml za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.</li>
	<li>Pozwól jajnikom osiąść na dnie rurki, a następnie przejdź do etapów mocowania i barwienia.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) jajników
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę preparacyjną z jajników za pomocą pipety. Pamiętaj, aby nie usuwać żadnych jajników ani komór na jaja. Pozostaw około 50 μl jajników i pożywki preparyjnej.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 16% paraformaldehydu do 150 μl 0,1 M buforu KPO4 w probówce i dodaj roztwór do komór na jajka, aby je naprawić. Inkubować podczas kołysania przez 10 minut. UWAGA: paraformaldehyd jest toksyczny.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i dwukrotnie spłukać 0,5 ml buforu do przemywania NP40.</li>
	<li>Umyj dwa razy po 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zapoznaj się ze standardowym protokołem IF15, aby zapoznać się z kolejnymi krokami.
	<ol>
		<li>Krótko, po utrwaleniu, dodać przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich rozcieńczeniach i inkubować O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć kilkakrotnie NP40, a następnie dodać przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenia 1:200).</li>
		<li>Umyć kilka razy w NP40, następnie dodać DAPI (1:1,000) na 10 min, a następnie powtórzyć prania. Po zakończeniu protokołu IF dodaj 200 μl 50% glicerolu w PBS do komór jajowych i pozostaw w temperaturze RT na 2 godziny.</li>
		<li>Usuń roztwór, zastąp go 70% glicerolem w PBS i przykryj folią. Umieścić próbkę w temperaturze 4 oC do momentu, gdy będzie ona gotowa do montażu. W międzyczasie przejdź do kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zaawansowane przygotowanie preparatów z galaretką glicerynową
<ol>
	<li>Odmierz co najmniej 4 ml galaretki glicerynowej za pomocą szpatułki i napełnij probówkę do hodowli komórek szklanych do połowy. Rozpuść galaretkę glicerynową w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez 30 min.</li>
	<li>Wlać małą kroplę glicerolu, około 300 μl, z roztworu podstawowego na dwa szkiełka mikroskopowe. Za pomocą chusteczki rozprowadź glicerol cienką warstwą na każdym ze szkiełek. Stanowi to bazę i pozwala na łatwe usunięcie galaretki glicerynowej w kroku 5.6.</li>
	<li>Odetnij końcówkę przefiltrowanej końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Za pomocą odciętej końcówki pipety powoli przenieś 1 000-1 500 μl ciepłej galaretki glicerynowej na każde szkiełko mikroskopowe. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka galaretki glicerynowej na 5 minut w temperaturze obrotowej, aby stężały.</li>
	<li>Umieść każde szkiełko z galaretką glicerynową na szalce Petriego o średnicy 60 mm × 15 mm i przykryj folią. Umieścić w temperaturze 4 °C O/N. Opcjonalnie przechowywać szkiełka z galaretką glicerynową do 5 dni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Montaż komór na jajka
<ol>
	<li>Korzystając z próbek z kroku 2.5, odpipetuj kilka kropli 3 μl komór na jajka w 70% glicerolu na jednym szkiełku z galaretką glicerynową. Kontynuuj pipetowanie 3 μl kropli, aż wszystkie komory jaj znajdą się na tym szkiełku. Upewnij się, że każda kropla zawiera co najmniej dziesięć komór na jajka. W międzyczasie podgrzej probówkę hodowlaną z galaretką glicerynową w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Umieść szkiełko z galaretką glicerynową z komorami na jajka pod mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj powiększenie tak, aby w polu widzenia znajdowała się tylko jedna kropla komór na jajka (Rysunek 1B).</li>
	<li>Używając igły o rozmiarze 30 jako łyżki, podnieś żądaną komorę na jajka. W razie potrzeby oddziel żądane komory jajowe od łańcucha jajowego, używając igły jako noża.</li>
	<li>Aby uniknąć zanieczyszczeń, które mogą zakłócać obrazowanie, przenieś komorę jajową na drugi szkiełko z galaretką glicerynową, z przednią stroną skierowaną w lewo (ryc. 1E-1). Powtarzaj, aż w kolumnie znajdzie się co najmniej siedem komór na jajka (Rysunek 1C).</li>
	<li>Uformuj nowe kolumny po siedem, aż wszystkie pożądane komory jaj zostaną przeniesione do drugiego szkiełka z galaretką glicerynową.</li>
	<li>Oderwij mały kawałek chusteczki i przekręć. Użyj tego, aby wchłonąć nadmiar PBS-glicerolu z komór jajowych, lekko dotykając każdej z nich. Uważaj, aby nie wyjmować komór na jajka.</li>
	<li>Odciąć końcówkę przefiltrowanej końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Użyj tego, aby przenieść 150 μl galaretki glicerynowej na pokrycie wszystkich kolumn komór na jajka. 
	UWAGA: Ilość galaretki glicerynowej potrzebnej do pokrycia kolumn zależy od etapów komory jajowej i liczby kolumn. Kwota może ulec dostosowaniu.</li>
	<li>Pozostaw zamontowane komory na jajka na 5 minut w temperaturze pokojowej, aż górna warstwa galaretki glicerynowej całkowicie zestali się (ryc. 1D).</li>
	<li>Umieść szkiełko zamontowanych komór na jajka na szalce Petriego o średnicy 60 mm × 15 mm i przykryj folią. Przechowywać w temperaturze 4 °C O/N, aby warstwy galaretki glicerynowej zestaliły się razem (umieścić w ciemności, jeśli istnieje obawa o fotowybielanie).</li>
</ol>
5. Przygotowanie komór jajowych do obrazowania
<ol>
	<li>Umieść szkiełko zamontowanych komór na jajka pod mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj powiększenie tak, aby tylko jedna kolumna komór na jajka znajdowała się w polu view.</li>
	<li>Za pomocą miniaturowego skalpela pod kątem 45° wytnij linię prostą wzdłuż prawej strony pierwszej kolumny komór na jajka (blisko tylnej strony komór na jaja). (Rysunek 1D-E)</li>
	<li>Następnie wytnij powyżej pierwszej komory na jajka u góry i poniżej ostatniej komory na jajka w kolumnie. W tym miejscu kolumnę komór na jajka należy przeciąć z trzech stron.</li>
	<li>Za pomocą mikronoża pokrój wzdłuż lewej strony kolumny, jak najbliżej przedniej strony komór jajowych (ryc. 1E-3).</li>
	<li>Odpipetować 100 μl zimnego 1X PBT na kolumnę cięcia.</li>
	<li>Użyj szpatułki o zaokrąglonych krawędziach, aby usunąć nadmiar galaretki glicerynowej z trzech stron wyciętej kolumny komór na jajka i wyrzuć, pozostawiając resztę na szkiełku.</li>
	<li>Włóż szpatułkę w nacięcie wykonane po przedniej stronie komór na jajka i oddziel kolumnę od pierwotnego bloku galaretki glicerynowej .</li>
	<li>Przygotować próbki do mikroskopii odwróconej (5.8.1) lub pionowej (5.8.2).
	<ol>
		<li>W przypadku mikroskopu odwróconego: Przenieś kolumnę komór na jaja na szkiełko nakrywkowe z przednią stroną komór jaj skierowaną w dół. Powtarzaj kroki 5.2-5.8, aż wszystkie kolumny galaretki glicerynowej zostaną usunięte i zamontowane. Dodaj kilka kropli 50% PBS-Glycerol na każdy blok komór jajowych, aby zapobiec ich wysuszeniu. Obraz komór jajowych bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym.</li>
		<li>W przypadku mikroskopu pionowego: Przenieś kolumnę komór na jaja na szkiełko mikroskopowe przednią stroną skierowaną do góry. Powtarzać kroki 5.2-5.9, aż wszystkie kolumny galaretki glicerynowej zostaną usunięte i zamontowane na szkiełkach mikroskopowych. Dodaj kilka kropli 50% PBS-Glycerol na każdy blok komór jajowych i przykryj bloki szkiełkiem nakrywkowym #1 1/2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy metodę montowania i obrazowania małych, rozwijających się komór jajowych z perspektywy końcowej. Powszechne techniki obrazowania komór jajowych są zoptymalizowane pod kątem widoków bocznych i przede wszystkim umożliwiają precyzyjną wizualizację przyśrodkowo-bocznych komórek pęcherzykowych po zabarwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi. Zastosowanie stosów Z lub rekonstrukcji 3D pomaga w oglądaniu wielu płaszczyzn ogniskowych, ale nadal jest niewystarczające do subkomórkowej rozdzielczości biegunó...

Badania nad Drosophila melanogaster dostarczyły cennych informacji na temat genetycznej regulacji szerokiego zakresu zjawisk. W szczególności przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad rozwojem komórek jajowych, ponieważ oogeneza zapewnia łatwy sposób badania wielu różnych procesów rozwojowych, w tym wzorców tkankowych, zmian polaryzacji komórek, przełączania cyklu komórkowego i regulacji translacyjnej1,2,3,4. Jednym z ważnych zdarzeń morfogennych podczas oogenezy jest specyfikacja, nabycie ruchliwości i migracja zestawu komórek zwanych komórkami granicznymi (przegląd w 5). Ponieważ migracja komórek jest kluczową cechą morfogenezy zwierząt, a genetyczna regulacja tego procesu jest dobrze zachowana, mechanizmy określone u much mogą być ważne w innych kontekstach. W związku z tym badamy molekularną kontrolę migracji komórek granicznych. Na potrzeby naszych badań opracowaliśmy nową metodę obserwacji przednich biegunów rozwijających się komórek jajowych, w których powstają komórki graniczne, aby szczegółowo zbadać, jak się rozwijają.
W jajniku, komory jajowe na różnych etapach rozwoju istnieją wzdłuż łańcuchów zwanych jajnikami, które są zamknięte w cienkiej osłonce (Rysunek 1A). Każda komora na jajka utworzy jedno jajo. Podczas oogenezy kilka różnych typów komórek musi rozwijać się w skoordynowany sposób. Komora jajowa D. melanogaster składa się z 16 komórek linii rozrodczej, w tym jednego oocytu, otoczonych jednowarstwowym nabłonkiem pęcherzykowym6. Niewielka liczba wyspecjalizowanych komórek, zwanych komórkami polarnymi, powstaje na przednim i tylnym biegunie nabłonka. 6-8 komórek granicznych pochodzi z przedniego nabłonka komory jajowej, indukowanego przez komórki polarne5,7. W połowie oogenezy (etap 9) komórki graniczne odłączają się od swoich sąsiadów i migrują między komórkami pielęgniarki, aby dotrzeć do oocytu w tylnej części komory jajowej5,7. Ruch ten musi zostać wykonany, gdy komórki graniczne pozostają w klastrze otaczającym dwie nieruchome komórki polarne, co sprawia, że jest to rodzaj zbiorowej migracji komórek. Udana migracja klastra komórek granicznych zapewnia prawidłowy rozwój mikropyla skorupki jaja, który jest niezbędny do zapłodnienia.
Komórki biegunowe przednie instruują los komórki granicznej, aktywując kaskadę transdukcji sygnału. Komórki polarne wydzielają cytokinę niesparowaną (UPD), która wiąże się z receptorem transbłonowym, Domeless (DOME), na sąsiednich komórkach pęcherzykowych na etapie 8 rozwoju oocytów8,9. Wiązanie UPD powoduje fosforylację kinazy tyrozynowej Janusa (JAK) przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT)8,10,11. Następnie STAT przemieszcza się do jądra, aby aktywować transkrypcję. Powolne komórki graniczne (SLBO) to czynnik transkrypcyjny, który jest bezpośrednim celem transkrypcyjnym STAT i jest również wymagany do migracji komórek granicznych12. Boczne widoki komór jajowych wskazują, że aktywność STAT jest regulowana w gradiencie w poprzek przedniego nabłonka8,11,13. Komórki pęcherzykowe znajdujące się najbliżej komórek polarnych mają najwyższy poziom aktywowanego STAT, dzięki czemu stają się komórkami granicznymi i atakują sąsiednią tkankę linii rozrodczej.
Aby zrozumieć, w jaki sposób komórki graniczne są określone wewnątrz nabłonka i od niego odłączane, musimy obserwować, jak zorganizowana jest tkanka. Jeśli spojrzymy na komory jajowe z perspektywy przed, spodziewalibyśmy się radialnej symetrii aktywności STAT w komórkach pęcherzykowych otaczających komórki polarne. Widok end-on pozwoliłby również dokładniej pokazać różnice między białkami błonowymi i interfejsami komórka-komórka przed i w trakcie odłączenia, niż porównywanie komórek w różnych płaszczyznach ogniskowych. Ponieważ komory jajowe są podłużne i połączone ze sobą komórkami łodygi, osiadają na szkiełkach bocznie, co utrudnia obserwację przedniej architektury. W ten sposób wiele informacji o komórkach na biegunach komory jajowej zostało wywnioskowanych z widoków bocznych. Chociaż pewne informacje można uzyskać za pomocą algorytmicznych rekonstrukcji 3D przekrojów optycznych, rozpraszanie światła, fotowybielanie i gorsze granice rozdzielczości w osi Z sprawiają, że informacje te są mniej szczegółowe i wiarygodne przy braku drogich technik, takich jak mikroskopia superrozdzielcza14. Inne rodzaje obrazowania opartego na przekrojach (na przykład mikroskopia elektronowa lub sekcja mikrotomowa) wymagają rozległej manipulacji tkankami, w tym odwodnienia, co zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia artefaktów. W związku z tym opracowaliśmy nową metodę obrazowania komór jajowych D. melanogaster w pozycji pionowej. Metoda ta okazała się już przydatna w wyjaśnianiu, w jaki sposób przemieszczają się komórki (patrz wyniki reprezentatywne oraz Manning i wsp., w trakcie przeglądu) i prawdopodobnie będzie bardziej wartościowa w badaniach nad innymi aspektami oogenezy.

<table><tbody><tr><td>0,1 M bufor fosforanu potasu (KPO4 Buffer)Dodać</td><td></td><td></td> <td>3,1 g NaH2PO4&bull; H2O i 10,9 g Na2HPO4 (bezwodny) do destylowanego H2O w celu uzyskania objętości 1 l. pH roztworu końcowego wyniesie 7,4. Bufor ten może być przechowywany przez okres do 1 miesiąca w temperaturze 4& stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu, mikroskopia elektronowa klasy EM</td><td>Sciences</td><td>15710</td><td>bez metanolu w celu zachowania fluorescencji GFP</td></tr><tr><td>Igła 30G x 1/2 cala&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Regularne skośne</td></tr><tr><td>aktywne suche drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Do tuczenia samic much</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>PAA-hodowla komórkowa Firma</td><td>A15-701</td><td>Używany w NP40 Bufor do mycia</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Stop Dumostar, końcówka biologiczna; Ostre końcówki są niezbędne do rozwarstwienia</td></tr> <tr><td>jajnikaDAPI (dichlorowodorek 4&,6-diamidyno-2-fenyloindolu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml roztwór podstawowy&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Dodano do suplementu pożywkę preparacyjną (10%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana probówka hodowlana</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Szkiełka wgłębieniowe</td><td>VWR</td><td>470019-020</td> Galaretka glicerynowa o <td>grubości 1,2 mm z podwójną wnęką</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nauki Mikroprocesora Elektronowego</td><td>17998-10</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% w PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(wymienny z Nonidet P-40)&nbsp; Stosowany w buforze płuczącym NP40&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny Leica&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica SP5</td><td>Suchy obiektyw Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td> ze stali nierdzewnej <td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA i 0,02% azydek sodu</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Dodano do suplementu pożywkę preparacyjną (0,6X)</td></tr><tr><td>Petrydish- Polistyrena, sterylna</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H</td></tr><tr><td>mm Bufor fosforanowy Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 opakowań proszku</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Stosowany w 0,1 M buforze KPO4&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Stosowany w 0,1 M buforze KPO4&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>Z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Stosowany w barwieniu przeciwciał fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Stosowany w buforze płuczącym NP40</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Obraz 3D o objętości Oprogramowanie analityczne</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Do przetwarzania konfokalnych stosów Z</td></tr></tbody></table>

obrazowanie pionowe komór jajowych drosophila

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Oogeneza Drosophila melanogaster stanowi idealny kontekst do badania różnorodnych procesów rozwojowych, ponieważ jajnik jest stosunkowo prosty w budowie, dobrze scharakteryzowany i podatny na analizę genetyczną. Każda komora jajowa składa się z komórek linii rozrodczej otoczonych pojedynczą warstwą nabłonkową komórek pęcherzyków somatycznych. Podzbiory komórek pęcherzykowych ulegają różnicowaniu na określonych etapach, aby stać się kilkoma różnymi typami komórek. Standardowe techniki pozwalają przede wszystkim na boczny widok komór jajowych, a tym samym ograniczony wgląd w organizację i tożsamość komórek pęcherzykowych. Protokół obrazowania pionowego opisuje technikę montażu, która umożliwia nowatorski, pionowy widok komór jajowych za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego. Próbki są najpierw umieszczane między dwiema warstwami galaretki glicerynowej w pozycji bocznej (poziomej) na szklanym szkiełku mikroskopowym. Galaretka z zamkniętymi komorami na jajka jest następnie cięta na bloki, przenoszona na szkiełko nakrywkowe i odwracana, aby ustawić komory jaj w pozycji pionowej. Zamontowane komory jajowe mogą być obrazowane za pomocą pionowego lub odwróconego mikroskopu konfokalnego. Technika ta umożliwia badanie specyfikacji, organizacji, markerów molekularnych i rozwoju komórek jajowych z nowymi szczegółami i z nowej perspektywy.

Metoda obrazowania pionowego pozwoliła nam bezpośrednio zaobserwować organizację komórek w przednim nabłonku pęcherzyka w stadium 8. Ogólny marker przeznaczenia komórek pęcherzyka, białko Eyes Absent (EYA), a także marker jądrowego DNA DAPI, wykazały równomierną ekspresję w tym polu komórek i dowiodły, że wszystkie komórki można było zaobserwować przy podobnym natężeniu barwienia (Rycina 2B”). Jednak białka regulowane w odpowiedzi na cytokinę UPD wykazały zmienne wzorce i poziomy ekspresji. Komórki polar...

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster. Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie obrazowania o wysokiej rozdzielczości biegunów komór jajowych drosofil. Jest to osiągane poprzez wstępne wypreparowanie owariów i ich barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi. Drugim krokiem jest identyfikacja i oddzielenie wybranych komór jajowych.Następnie wybrane próbki są orientowane i wyrównywane, a potem zatapiane w blokach z galaretki glicerynowej. Ostatnim krokiem jest przycięcie i obrócenie bloków w celu zamontowania komór jajowych tak, aby ich oś podłużna była ustawiona pionowo. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną, aby ujawnić organizację komórkową i subkomórkową na biegunach komory jajowej.Nabłonek, taki jak układy komórek brzeżnych. Istniejące metody obrazowania preparatów prostopadle do płaszczyzny obrazowania za pomocą sekcji optycznej i algorytmicznej rekonstrukcji 3D mogą powodować fotoblaknięcie i rozpraszanie światła oraz oferować gorszą rozdzielczość, co skutkuje mniej dokładnymi obrazami. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na montowanie preparatów pod nowym kątem i bezpośrednią obserwację. Wykorzystujemy tę technikę do obrazowania biegunów rozwijających się komór jajowych, co

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wyprostowane obrazowanie komór jajowych Drosophila

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Poznaj metodę pionowego obrazowania komór jajowych Drosophila melanogaster w celu wizualizacji organizacji komórkowej w nabłonku pęcherzykowym. Technika ta wykorzystuje mikroskopię konfokalną i fluorescencyjne barwienie przeciwciałami.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów